泛素特异性蛋白酶7功能和在结直肠癌中的研究进展

2024-03-31付锦程付涛

临床外科杂志 2024年1期

付锦程付涛

泛素特异性蛋白酶7(ubiquitin-specific protease 7,USP7)是一种广泛参与DNA修复、细胞分裂、细胞凋亡、基因表达、蛋白定位、蛋白降解等多种细胞过程的去泛素化酶[1]。有研究表明,UPS7在调节多种信号通路相关因子、调控细胞增殖和凋亡、协助建立肿瘤免疫逃逸、参与DNA损伤修复等促进肿瘤发生,发展的机制中发挥着重要的作用。USP7广泛的生物学效应使其成为研究肿瘤机制和进展过程的重要分子。本文对USP7的结构、广泛的生物学功能及其在结直肠癌中的研究进展进行综述。

一、USP7的结构与功能

USP7能与单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1) 编码的具有泛素连接酶(ubiquitin-ligase enzymes 3,E3)活性的感染性细胞蛋白(infected cell protein 0,ICP0)结合,也被称为疱疹病毒相关泛素特异性蛋白(herpesvirus-associated ubiquitin-specific protein,HAUSP)[2]。USP7由1 102个氨基酸组成,具有高度保守的结构域,自氨基末端至羧基末端包括：氨基末端多聚谷氨酰胺(polyglutamine,poly Q)延伸,肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor-related factor,TRAF)样结构域,催化结构域(catalytic domain,CD)和羧基末端区域。

USP7是一种半胱氨酸蛋白酶,具有三个部分的保守USP7结构域,称为手指、拇指和手掌[3-4]。USP7结构域的大小从300到800多个氨基酸不等[3]。辅助结构域,包括泛素相关结构域(UBA)、泛素相互作用基序(UIM)和锌指泛素特异性蛋白酶结构域(ZnF-UBP)以及末端扩展,被认为赋予了USP7的底物特异性[3,5]。由于一些USP7控制细胞周期进程、DNA损伤修复和与癌症相关的细胞信号,它们在肿瘤发生中的作用已被研究[3,6-8],关于其结构和功能也是最近才开始被研究[9]。

二、USP7的功能

1.p53依赖途径：随着研究的深入,越来越多的USP7底物被鉴定出来,这些底物中关于p53的研究最为透彻。正常细胞中的p53主要通过Murine double minute 2(MDM2)介导的泛素化和随之而来的降解维持低水平状态[10]。p53和MDM2均是USP7的底物,且以互斥的方式特异性地识别USP7 的TRAF样结构域,由于MDM2的亲和力强于p53,因此,正常细胞稳态中MDM2是USP7的首选底物[11-12]。在细胞应激的条件下,MDM2磷酸化降低了其与USP7结合的亲和力,使USP7从稳定MDM2转换为稳定p53,诱导凋亡途径激活[13],这个现象被研究人员称为“开关”效应。肿瘤抑制因子p53在肿瘤预防中起着重要作用。在人类肿瘤的发展过程中,p53经常因直接突变或调节蛋白的表达改变而失活。p53是分子网络中的一个中心枢纽,它能感知各种细胞应激,并引发有效的抗增殖反应,包括细胞周期阻滞、凋亡和衰老。此外,p53还参与调控其他细胞过程,如代谢、自噬和铁死亡等[14]。

2.非p53依赖途径：除了USP7-MDM2-p53轴之外,USP7还通过p53非依赖性的途径参与细胞增殖和凋亡调控,这种效应主要源于USP7参与调节多种信号通路相关因子,改变它们的表达水平和亚细胞定位。

USP7可以通过逆转多泛素化,稳定转录因子导致其靶点表达增加,如USP7通过TRAF样结构域和Ubl结构域与NOTCH1胞内结构域(Intracellular domain of NOTCH1,ICN1)交互,使其稳定并异常激活,导致NOTCH1靶基因的表达上调,促进急性T淋巴细胞白血病的发展,而USP7缺失可使NOTCH1的多聚泛素化增强,导致其降解[15]。

USP7可以使E3泛素连接酶NEDD4L去泛素化,通过NEDD4L-SMAD轴影响神经系统[16]。USP7也可以调节TBX3、直接结合TBX3并减少其泛素化和降解来抑制p57KIP2的表达,促进甲状腺乳头状癌细胞增殖[17]。USP7逆转单泛素化和多泛素化标记的能力使其能够从多方面调节信号通路转录因子,这种通过逆转多泛素化改变转录因子的稳定性和逆转单泛素化改变转录因子的亚细胞定位之间的差异性,将是一个有待进一步研究的课题。

3.促进DNA修复及细胞分裂分化：USP7对DNA损伤和耐受有重要作用。当细胞出现DNA双链断裂(DNA double strand breaks ,DSBs)时,会出现DNA损伤反应(DNA damage response,DDR),这个过程需要关键调控因子MRE11-RAD50-NBS1(MRN)复合物和DDR信号的核心成分DNA损伤检查点蛋白调节因子1(mediator of DNA damage checkpoint protein 1,MDC1)。MRN识别DSBs信号时导致MDC1与磷酸化组蛋白H2AX结合,使得泛素E3连接酶RNF168聚集,促进多聚泛素链在染色质上形成,同时生成染色质绑定的p53结合蛋白1(p53 binding protein 1,p53BP1)和乳腺癌蛋白1(breast cancer protein 1),产生有效的DNA修复[18-20]。

4.表观遗传学调控功能：USP7作为翻译后蛋白稳定性调节因子的作用被广泛接受。它可能以通过组蛋白H3K9的甲基转移酶SUV39H1以表观遗传学机制调控p53靶蛋白[21]。USP7是控制组蛋白H2A泛素化水平的非典型多梳抑制复合体1(polycomb repressive complex 1,PRC1)的组分之一[22]。有研究显示,延伸蛋白BC和多梳抑制复合物相关蛋白EPOP能够通过招募USP7调控H2B泛素化水平,参与癌症增殖调控[23]。这些研究为USP7调控组蛋白标记的结构提供了更清晰的解释。

E3连接酶泛素样含PHD和环指域(ubiquitin-like with PHD and ring finger domain 1,UHRF1)是DNA甲基化机制的重要组成部分,能够结合半甲基化的CpG岛并招募维持甲基转移酶DNMT1,以确保DNA甲基化模式通过复制传播[24]。UHRF1、USP7和DNMT1还可以作为泛素E3连接酶-USP7靶复合物在已知的抑癌基因启动子处形成,通过增加DNA甲基化和组蛋白修饰来抑制它们[25]。提示了USP7表观遗传调控和DNA修复两大功能之间存在联系。

三、USP7与结直肠癌

1.USP7在结直肠癌中的研究进展：正如上文所述,USP7具有广泛且迥异的生物学功能,使得其在结直肠癌(CRC)中的表现也呈现出显著的差异,在CRC中像“双刃剑”一样,即USP7既可以促进肿瘤生长,又可以抑制肿瘤生长。

Kerstin等[26]的研究显示,USP7既具有促癌效应,又具有抑癌效应：在无应激的癌细胞中,无论上调还是下调USP7均能稳定p53,从而导致抑制细胞生长并诱导凋亡。体内实验也证实,USP7上调或下调,都使肿瘤的体积和重量下降,肿瘤生长抑制。有研究表明,USP7的上调所带来的生长抑制效应可能源于其稳定了p53,同时激活p53依赖的凋亡途径;而USP7下调所带来的生长抑制效应则较为复杂,因为其效果依赖于p53、MDM2和USP7相对化学计量,当USP7部分减少时可使p53失活,而USP7接近完全消失时则由于MDM2的失稳定性而使p53趋于稳定。总而言之,在CRC中,USP7下调所带来的p53依赖和p53独立同时存在的生长抑制作用,表现为促增殖蛋白的减少和抗增殖蛋白的增加。

Yang等[27-28]通过实时PCR和蛋白质印迹分析了25例结肠癌及癌旁组织中USP7表达,发现USP7在癌组织中显著下调,同时还观察到癌组织中磷酸化STAT3的表达升高。随后在结肠癌细胞系HCT116、SW620和SW480中发现,磷酸化STAT3增多时,USP7的表达水平会降低,同时内源性p53蛋白水平下降。通过荧光素酶报告和芯片分析发现STAT3与USP7启动子区域结合导致组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase 1,HDAC 1)招募抑制USP7活性进而使内源性p53蛋白水平降低,导致肿瘤生长。Choi等[29]研究发现,FAM188B的mRNA和蛋白水平在结肠癌细胞系(HCT116,SW620,HT-29)中均有较高的表达。FAM188下调可以通过细胞周期阻滞或细胞死亡导致体外细胞生长抑制,这一过程的机制是：FAM188B的沉默激活了p53,从而上调凋亡相关基因导致细胞死亡。这种效应是通过与USP7相互作用来调控p53的稳定性。FAM188B中存在USP7结合基序,当FAM188B过表达时,会使得其结合的USP7显著增加,导致泛素化的p53增多,使p53凋亡途径被抑制;反之,当FAM188B表达下调时,游离的USP7增多,使得p53上调,激活p53凋亡信号通路,抑制肿瘤生长。总而言之,FAM188B的发现为USP7-MDM2-p53轴增添了新的内容。

在促进癌症进展的研究中,Novellasdemunt等[30]在APC突变SW480细胞系中发现,敲减USP7会使CRC细胞的生长受限。随后将SW480细胞系导入免疫缺陷模型鼠(SCID mice)中,构建异种移植模型,结果表明,USP7特异性抑制剂P2207对小鼠肿瘤生长有明显的抑制作用,分离瘤体显示出对Wnt靶基因的抑制,这种效应与敲减USP7一致,并且在APC突变的细胞中更为明显。该研究显示了USP7促进CRC发展的机制：APC突变的CRC细胞中Wnt活化和转化的阈值-β-catenin抑制结构域(β-catenin inhibitory domain ,CID)缺失,使得β-catenin暴露于USP7下,放大了USP7对β-catenin去泛素化效应,导致Wnt信号的异常激活,促进了细胞增殖和肿瘤进展。

有关USP7抑制剂的研究也进一步证实了USP7所带来的促癌效应。Du等[37]发现,结肠癌中USP7与DNMT1的丰度相关(R2=0.84)。USP7敲减的结肠癌细胞对组蛋白去乙酰化酶HDAC抑制剂更敏感：相较于正常细胞系,USP7敲减的细胞中HDAC抑制剂可以诱导5～10倍的细胞凋亡,增加了凋亡细胞标志物的丰度,包括caspase3,6,9和PARP。An等[31]发现与正常细胞相比,USP7在CRC细胞系HCT116,SW480,Caco-2,SW620 and HT-29中高表达。减少USP7的表达可以有效抑制CRC细胞系HCT116,SW480,Caco-2的增殖,由于三种细胞系中p53的状态差异大,表明这种效应是非p53依赖性的。有数据分析显示,CRC病人的总体生存率与USP7水平呈现显著负相关,低表达USP7的病人显示出相对增加的无复发生存的可能性。随后使用USP7抑制剂P5091处理细胞,显著抑制了细胞生长,增加了细胞凋亡,这与β-catenin降解有关。P5091能够增加β-catenin的泛素化从而加快其降解,显著降低β-catenin的水平,抑制了Wnt/β-catenin通路的异常激活,诱导了凋亡途径。随后的裸鼠异种移植实验证实,使用P5091治疗的裸鼠肿瘤的直径和重量都明显降低,并且荷瘤小鼠的体重没有明显下降,显示出较好的耐受性。总而言之,P5091的处理在体内和体外均能通过抑制Wnt/β-catenin通路来抑制CRC的增殖。研究表明,USP7抑制剂在CRC中的显著作用,进一步开发和完善有助于CRC的靶向治疗。

2.USP7在结直肠癌中的研究方向

正如上文所述,USP7的生物学功能广泛,普遍参与细胞调节,尤其是调节信号通路相关因子。已有的研究阐明了USP7如何调节Wnt/β-catenin、JAK/STAT等信号通路相关因子以促进CRC的进展,未来探究其他通路中USP7与CRC的关系将是一个方向,例如,目前研究已经证实Hippo通路与CRC的发展密切相关[32],而且已有研究人员证实USP7稳定该通路的转录因子Yki,促进肝细胞癌的发展[33]。上文提到USP7通过去泛素化可以调节NOTCH通路、Hedgehog通路、PI3K/Akt通路的相关转录因子,而这些通路广泛参与癌症的发生和发展,提示我们研究USP7如何通过这些通路促进CRC的进展。

另外,关于非编码RNA协同USP7在肿瘤中研究逐渐增多,如上文所示的miR-205与USP7的关系,最近的研究也显示在体脂较高的肝细胞癌病人中,由脂肪细胞分泌的外泌体中的环状RNAs(circular RNAs,circRNAs)上调,通过抑制microRNA-34a(miR-34a),激活USP7,导致一组基因上调,包括细胞周期蛋白cyclin A2,促进肿瘤增殖和转移[34]。也有研究表明,长链非编码RNA(lncRNA)可以通过USP7蛋白介导Wnt/β-catenin通路促进结直肠癌的发生[35],这也为USP7在结直肠癌的研究中提供了新的方向。