畜禽粪便中雌激素污染特征与控制技术研究进展

王俊跃,桑煜龙,王贺飞,凌婉婷(南京农业大学土壤有机污染控制与修复研究所,江苏 南京 210095)

研究表明,在极低浓度下雌激素就可扰乱野生动物和人类内分泌系统的正常功能[1].多种鱼类的发育与繁衍、性别分化、卵黄原蛋白的产生都受到环境中雌激素的影响[2-3].雌激素也对其他生物产生毒害,受环境雌激素的影响,野生青蛙后代种群中性别比例失调[4].高水平雌激素与男性生殖障碍和精子数量、质量下降有关,还会导致女性不孕不育和乳腺癌等疾病发病率增加[5].

环境中的雌激素包括动物体内合成的天然雌激素(雌酮、雌二醇、雌三醇等)和以医疗、饲养、加工等为用途的合成雌激素(炔雌醇、己烯雌酚、双酚A 等).环境中大部分雌激素源自于动物产生的天然雌激素,尤其是集中饲养的畜禽.世界上分布最广泛的动物类型是牛、羊、猪和家禽[6].天然雌激素按形态划分可分为自由态和结合态,相关畜禽体内未被代谢的雌激素随粪尿排放进入环境中,结合态雌激素通常随尿液排出,而粪便中存在的雌激素多为自由态[7].有大量研究报道了水环境[8]中,例如,工业废水、生活污水和地下水中含有双酚A,而Zhang 等[9]在研究畜禽粪便中雌激素种类的过程中也发现了双酚A,这可能是畜禽养殖场中动物的食盆或者盛放粪便的塑料容器内表面材料中释放出来的.炔雌醇、己烯雌酚作为人工合成的口服生物活性雌激素,是牲畜养殖活动中用以促进生长、育肥、诱导发情、预防和治疗牲畜生殖障碍比较常见的药物[10-11],这类药物经过生物代谢后残留于畜禽粪便中.不同种类畜禽粪便中雌激素的种类含量不同,明确其污染特征将更有利于推进风险防控和治理工作.

在施加畜禽粪便中的农田土壤和地下水中都检测到雌激素及其代谢产物[12],在施用粪便农田邻近的河流、湖泊中也检测到不同浓度的雌激素,说明雌激素可以在环境中不断迁移与转化[13].吸附、膜分离、传统氧化等物理和化学方法能够去除环境中的雌激素[14-15].但生物修复因其高效、环保被认为是一种更先进的处理技术.

本文概括了国内外畜禽粪便中雌激素的结构和性质、污染特征和迁移过程的研究进展.列举了除传统堆肥之外,高级氧化、微生物等雌激素控制技术,介绍了雌激素降解功能细菌、降解功能菌群和固定化菌剂,评价了功能菌群和固定化菌剂的显著降解效果和应用潜力.

1 畜禽粪便中雌激素的污染特征

1.1 畜禽粪便中雌激素的结构与性质

畜禽粪便中3 种天然雌激素都是由一个酚环、两个环己烷和一个环戊烷构成的环戊烷并多氢菲结构,又称甾体母核.区别在于环戊烷上C16和C17所连基团的位置和数量不同[6],如表1 所示,雌酮在C17上连接一个羰基,雌二醇与雌酮的差异在于C17的羰基变为羟基,羟基在空间位置上的不同形成了两种立体构型17α-E2 和17β-E2,而雌三醇在C16和C17上都连接一个羟基[16].合成雌激素中炔雌醇由甾体雌激素衍生,具有环戊烷并多氢菲结构.在雌二醇的结构基础上C17上的氢被乙炔基取代,使得炔雌醇的结构更稳定,在环境中的降解难度更大.双酚A 的结构与塑化剂较为类似,主要由2 个刚性平面芳环和可塑非线性脂肪链构成[17],分子空间结构对称具有非极性.己烯雌酚是一类合成非甾体雌激素,具有乙烯平面结构,3、4 号位上的氢被两个羟基苯基取代,p-Π 共轭的结构使得芳香环具备高抗性.

表1 畜禽粪便中雌激素的理化性质[6,15-16]Table 1 Physicochemical properties of estrogens in manure[6,15-16]

如表1 所示,无论是天然或者是人工合成的雌激素,饱和蒸汽压都较低,挥发作用可忽略不计.天然雌激素的Log Kow(辛醇-水分配系数)较高且水中的溶解度(Sw)较低,因此暴露于环境中易被土壤、粪便中的有机质及其水中的沉积物吸附,而合成雌激素像炔雌醇和己烯雌酚也具有相似的性质.双酚A 可作为某些塑料制品的原材料和抗氧化剂,A 对小鼠具备雌激素的效应[18],能够与人体细胞的雌激素受体结合,产生雌激素活性,因此双酚A 被列为雌激素.

1.2 畜禽粪便中雌激素的种类和含量

畜禽粪便中雌激素的种类和含量因畜禽类型的不同而产生差异,对比国内外不同畜禽粪便中雌激素的污染特征,结果如表2.根据调查的数据(采用均值作比较)发现牛粪中的雌激素主要为E1 和17β-E2,浓度分别为265.56,102.52μg/kg,这与Li 等[19]的研究结果相符,他们发现牛粪便中90%的雌激素为E1 和E2.与其他畜禽相比,猪粪便中雌激素的浓度普遍偏高,E1 和E2 浓度高达1052.81,266.29μg/kg,这可能是因为猪的尿液和粪便长期共存,导致检测的雌激素含量偏高.鸡鸭粪便中雌激素主要以E3 为主,浓度均值可达 121.01,111.6μg/kg.为了提高畜禽产量和质量,EE2、BPA 等合成雌激素通常被添加到饲料中,因此在畜禽粪便中可以检测到合成雌激素的存在,畜禽粪便中合成雌激素的量远低于天然雌激素,这与大部分关于畜禽粪便中雌激素含量的研究结果相符.

表2 畜禽粪便的雌激素浓度(µg/kg)[9,20-28]Table 2 Concentration of estrogens in manure(µg/kg)[9,20-28]

对于同种畜禽,生长阶段和性别差异等因素对其粪便中雌激素含量也有很大影响.在Abdellah 等[6]的研究中发现怀孕期间牛粪便中总雌激素的日排泄量为256～7300μg/d,而未怀孕牛的雌激素日排泄量低于200μg/d,说明怀孕期间雌激素排泄量远高于平时.由于人类的需求,家养畜禽往往会有不同用途,这也影响了其粪便中雌激素的含量,奶牛产生的雌激素明显高于肉牛,蛋鸡的游离激素含量也高于肉鸡.在Zhang 等[20]的研究中发现雄性肉鸡粪便中雌激素日排泄量低于检出限,而雌性肉鸡和蛋鸡粪便中的游离雌激素排泄量为 2.79～3.28 和 2.04～8.59μg/d.在表3 中根据文献总结了不同畜禽在不同差异下的雌激素日排泄量的估计值,但这些数据只代表了少数几类动物,并且如饮食习惯、季节变化、健康状况等情况都很难考虑进去,对于了解动物雌激素的贡献有限,未来还需更多关于此方面的研究.

表3 不同生理阶段的畜禽粪便中雌激素日排泄量(µg/d)[9,20,25,28]Table 3 Daily excretion of manure at different physiological stages(µg/d)[9,20,25,28]

1.3 畜禽粪便中雌激素的迁移特征

畜禽养殖场以及施用过粪肥的农田周围的土壤、地下水、地表径流中都发现了不同程度的雌激素污染.比如,在施用动物粪便的地区地下水中发现17β-E2[29].全球多个国家都报道了不同程度的地表水雌激素污染,尤其集中在人口众多、经济发达的国家和地区.在中国,Li 等[30]预测了长江流域粪源性雌激素浓度,长江上中下游的平均雌激素活性当量(EEQ)分别为2.13,3.49,9.36ng/L,其中江苏省的EEQ预测值最高,为16.65ng/L.Luo[31]调查了美国乔治亚州流域受家禽排泄物影响的河流中4 种雌激素污染状况,约有1/6 的水样中检测到雌激素的量高于定量限,E1、E2、E3 的平均浓度分别为1.85,4.69,5.04ng/L,尚未检测到EE2 的存在.然而,世界范围内对畜禽粪便中雌激素的迁移机制的研究还很有限.

雌激素在迁移过程中易受环境中多种因素的影响.Chambers 等[32]研究发现粪便中的溶解性组分和胶体组分对于雌激素的迁移及生物活性有显著影响,在高含量有机质的影响下,雌激素更倾向于与其中的溶解性组分结合,且结合后仍具有较高的生物活性,这也解释了畜禽粪便中雌激素易向其他环境发生迁移的原因.残留在农田中的雌激素会随着淋溶作用向下层土壤迁移,Xu 等[33]发现土壤的有机质含量和水利条件是影响雌激素迁移的主要因素,土壤有机质含量高的土壤通常具有较高的淋溶性.Langwaldt 等[34]的研究中发现雌激素向土壤下层迁移时会在含水层以溶解的形式渗入到地下水,由于溶解氧不足等不利的条件,地下水中的雌激素难以消减而导致持续存在长达数月.迁移过程中雌激素在不同环境中活性和形态发生转变,未来对于畜禽粪便中雌激素的环境行为研究具有重要的环境意义.

2 畜禽粪便中雌激素的控制技术

2.1 好氧堆肥

堆肥因其操作便捷、处理规模大、对雌激素的降解能力强而受到人们的广泛关注[6].已有部分研究揭示了好氧堆肥具有较好的雌激素去除效果,Han等[35]测定了鸡粪、牛粪、猪粪堆肥后的雌激素含量变化,堆肥32d 后,鸡粪中E3、17β-E2、EE2 去除率分别为90.0%、54.5%、93.3%,而猪粪中17β-E2、E3 的去除率为91.2%和63.7%,牛粪在堆肥16d时,17β-E2 和E3 的去除率为90.3%和87.4%,32d 后已经检测不到雌激素存在,并且发现堆肥过程中雌激素的降解速度呈现先升高后降低的趋势.

目前已有报道指出堆肥时外加微生物和吸附材料可以显著提高堆肥效果[36].Sun 等[37]通过外加微生物菌剂和腐殖酸来提高堆肥的温度和加速雌激素的降解,他们在低温条件下将雌激素降解菌和腐殖酸加入到堆肥粪便中,雌激素降解菌增加了总菌群中具有降解和转化雌激素能力的菌属,加快了堆肥进程并提高了雌激素降解率,腐殖酸不仅可以加速雌激素的吸附和积累,还能减少氨氮的挥发和丰富粪肥中的养分.Li[38]在研究中发现外加硫也会增加堆肥温度和减少氨氮的消散,添加量低于5%还促进了对4 种雌激素(E1、17β-E2、E3、EE2)的降解.李欣[39]利用固定化菌剂处理牛粪12h,牛粪中天然雌激素E3、E2、E1 去除96.06%以上,合成雌激素DES 也去除了93.83%.近年来,也有许多关于堆肥与生物炭相互作用[40]的报道,添加生物炭能够减少温室气体的排放、减少肥料需求,同时能增加微生物活性,影响微生物菌群[41].因此,堆肥时添加生物炭固定的雌激素降解菌群将是很有前景的研究方向.

2.2 高级氧化

高级氧化技术应用于新型污染物的降解方面的研究目前受到广泛关注,污水处理中通常采用过硫酸盐氧化、芬顿试剂氧化、TiO2光催化氧化、臭氧氧化等技术来去除雌激素,但畜禽粪便中作为雌激素的一个重要源头,却很少有关于高级氧化技术直接降解畜禽粪便中雌激素的研究.Sun 等[15]利用芬顿试剂对牛粪中进行处理,反应24h 后粪便中初始浓度为 97.40,96.54,100.22,95.01,72.49mg/kg 的E3、BPA、DES、E2 和EE25 种雌激素去除率分别达到84.9%、99.5%、99.1%、97.8%和84.5%.Wang等[42]优化了芬顿氧化工艺并应用于多种畜禽粪便中雌激素和抗生素的降解,目标污染物的降解率都能达到70%以上.将芬顿氧化工艺与传统好氧堆肥相结合不仅能更有效去除雌激素,而且绿色环保于环境无害.只有从源头将雌激素加以控制,才能防止因迁移而造成更严重的环境影响.

2.3 微生物降解

微生物降解在去除环境雌激素方面的应用受到广泛关注,据报道的雌激素降解细菌多为厚壁菌门、变形菌门、放线菌门,拟杆菌门相对较少[43].其中如表4 所示,红球菌属(Rhodococcus sp.)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、沙雷氏菌属(Serratia sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas sp.)和丛毛单胞菌属(Comamonas sp.)等为常见的雌激素降解菌.而近8 年内国内外学者又先后分别从深海沉积物、活性污泥、沙子、土壤、咸水湖、鸡粪等环境中分离出枝芽孢杆菌属(Virgibacillus sp.)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus sp.)、农杆菌属(Agromyces sp.)、窄食单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)、戈登氏菌属(Gordonia sp.)、苍白杆菌属(Ochrobactrum sp.)、交替赤杆菌属(Altererythrobacter sp.)等新雌激素降解菌属,分离环境也不再局限于传统的污泥与土壤,在一些极端环境中分离出新菌株.研究者[44-45]从深海沉积物和人工咸水湖中分离的耐盐枝芽孢杆菌、交替赤杆菌作为耐盐株,对于天然雌激素的降解效率高于部分从淡水环境分离的雌激素菌,这一发现表明在某些极端环境中亦存在雌激素,探索新环境将有利于发现更多雌激素降解新菌属,推动雌激素生物降解的研究进程.

表4 雌激素降解功能细菌Table 4 The estrogens-degrading bacteria

目前对于雌激素降解单菌的研究和报道较多,但在实际应用中单菌的环境适应性仍较低且底物降解谱窄.因此,功能菌群的筛选与构建成为雌激素生物降解的研究热点,表5 所示为应用功能菌群降解雌激素的最新研究进展.其中前4 组菌群属于人工复合菌群,复合菌群相对于组成菌群的菌株雌激素降解效率更高.韩施宁[46]研究发现组成BC-2 的2种菌株对于EE2 的降解率皆低于25%,而将二者复合之后的降解率能达到36.4%;Ke 等[47]所构建的菌群BC-3 在2d 之内就将3 种天然雌激素完全去除,菌群中多株菌的协同作用与多种酶的参与,显著提高了雌激素的降解效率.除了人工复合菌群,从雌激素污染环境中分离的天然菌群,在原位修复方面更具优势,一方面大部分菌都是属于土著菌,驯化后投加能减少菌间拮抗的风险,另一方面天然菌群的菌数量远高于人工菌群,相对来说更加稳定.BC-5 和BC-6 是分别从猪粪污水和活性污泥中分离的天然菌群,Isabelle 等[48]发现BC-5 中高效降解E2 和E1的主要菌属是甲基杆菌属(Methylobacterium sp.)、苍白杆菌属(Ochrobactrum sp.) 、 假单胞菌属(Pseudomonas sp.)和分枝杆菌属(Mycobacterium sp.),Bernardelli 等[49]应用活性污泥反应器降解雌激素,反应器运行30d 后E2、E1 被完全降解,此时污泥中的主要菌属是假单胞菌属(Pseudomonas sp.)和硝化螺旋菌属(Nitrospira sp.),这两种菌在降解天然雌激素时发挥主要作用,而当E2 和E1 消耗完时,拟杆菌门中的Emticicia sp., Nubsella sp., Sphingobacterium sp.属以及变形菌门中的 Novosphingobium sp.,Sphingomonas sp., Altererythrobacter sp., Acinetobacter sp.属成为降解EE2 的主要菌属.目前对于雌激素降解菌群的报道仍然较少,人工复合菌群或是天然菌群的研究只停留在效果验证和菌群组成的阶段,对于细菌之间的互作关系和机制方面可以成为未来研究的新方向.

表5 雌激素降解菌群Table 5 The estrogen-degrading bacterial consortiums

实际环境中,生物降解很多情况下会面临极端条件,例如干旱、过酸过碱、高温等.土著菌存在于任何环境中,游离菌株在不良环境或是土著菌的影响下,其降解效率都会大幅降低.采用适当的固定化材料吸附、包埋微生物,既能避免微生物直接接触不良环境,载体中的营养物质又能促进生物降解,某些多孔介质还能富集环境中的污染物,提高降解效果.表6 所列举的是目前报道的雌激素固定化菌剂,大部分较游离菌剂的降解效果都有所提升.Wu等[50]制备的Lysinibacillus sp. GG242 的固定化菌剂是在pH 值为5.0 的条件下进行降解,在该酸性条件下,游离菌剂对E2 降解效果只有38%,但固定化之后降解效果维持在92.3%,说明固定化材料能在菌和实际环境中起到缓冲的作用,维持菌的活性.合成雌激素通常降解时间长、难度大,研究者[39,51]将Pseudomonas putida SJTE-3 和实验室分离得到的菌群固定,固定后促进了合成雌激素如炔雌醇、己烯雌酚等的降解效果,固定化提高了菌和酶的稳定性并保持其降解的高效性.可见固定化能够有效促进雌激素生物降解,提高稳定性,制备时有针对性地选择固定材料,优化固定时间和配比更有利于增强雌激素降解效果.

3 结论与展望

3.1 畜禽粪便中雌激素的降解途径及分子机制.畜禽粪便中雌激素的降解受到有机质、酸碱度、温度等因素的影响,而且雌激素的种类繁多,特别是像BPA 和DES 等合成雌激素,对于其降解途径与具有雌激素效应的产物研究尚少.因此在关心畜禽粪便中天然雌激素环境危害的同时,也应控制合成雌激素的用量和降解过程.近些年,雌激素降解的研究逐步向分子领域过渡,为雌激素微生物降解寻求更科学的理论支撑,如雌激素降解菌的基因调控、功能基因注释、雌激素降解菌基因组学研究和雌激素降解酶研究等.

3.2 畜禽粪便中雌激素的生态和人群健康风险.采集多种环境中的畜禽粪便样本,并对所在场地周围的土壤、径流、地下水等环境实行多点分析,采用实际测定值进行风险评估,更能科学地反映雌激素生态危害的真实情况.未来研究雌激素在不同环境中迁移的同时,应关注不同种类雌激素的生理毒性,评估粪便-土壤-蔬菜-人体或粪便-水体-水生生物等多条实际迁移途径所造成的生态风险和对人体健康的影响.

3.3 开发雌激素生物降解新技术.单菌难以适应实际环境,解决实际污染问题,将单菌复配成菌群,一方面菌与菌之间的协同作用能够提高降解的效果,另一方面针对实际环境中复杂且苛刻的条件,菌群中具有更广底物谱.功能菌群与合适的材料固定为菌剂,提高雌激素的生物降解效果的同时,也便于工程化量产和使用.

3.4 应用菌剂去除畜禽粪便中雌激素.雌激素降解菌的应用大都在水体或土壤环境中,使用菌剂增强畜禽粪便雌激素降解的研究仍然较少,倘若在畜禽粪便堆肥的同时外加菌剂辅助降解,则能够在源头最大程度降低雌激素的环境风险,为畜禽粪便资源化安全利用提供保障.