低温放电等离子体处理对赭曲霉毒素A降解效果及对无核白葡萄干品质的影响

张文乐，张绍君，王艺诺，周嘉佳，李圣杰，汤雅楠，丁梦楠，王英

（新疆农业大学 食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

中国是世界上葡萄干的主要出口国之一，尤其是新疆吐鲁番、哈密等地生产的绿色葡萄干，一直是国内外市场上的热销产品[1]。吐鲁番葡萄干因其果肉柔软、含糖量高的优异品质驰名中外，备受消费者喜爱。葡萄干中含有丰富的营养物质，是新疆主要的干果品种之一[2]。无核白葡萄干是易感染赭曲霉菌的农产品之一，真菌毒素对葡萄干具有极高的亲和性。在葡萄干的种植、加工和贮藏过程中，极易发生真菌毒素的侵染导致其次级代谢产物的产生，其中以赭曲霉毒素最为突出[3]。赭曲霉毒素是由曲霉属和青霉属的一些真菌产生的次级代谢毒素，已测得葡萄干中赭曲霉毒素包括A、B、C、D 等7 种结构类似的化合物，其中赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）污染最为普遍、毒性最强，严重危害人体健康[4]。试验表明，OTA 具有严重的肾毒性、肝毒性、神经毒性以及免疫毒性[5]。因此，找到一种成本低廉、操作方便、安全有效、环境友好且不会对无核白葡萄干品质产生影响的赭曲霉毒素降解方法，确保葡萄干的食品安全，已成为我国葡萄干产业发展中亟待解决的关键问题。

目前工业上常用高温短时杀菌、超高温瞬时杀菌等热处理来确保食品的安全性[6-7]。然而热处理存在损害农产品营养品质、降解效率低、实践应用受到限制等问题[8-9]。低温等离子体作为一种新兴的非热灭菌技术，具有对食品品质影响小和无二次残留的优点[10-11]，是极具发展潜力的新兴技术，在食品行业显示出了巨大的应用潜力[12]。低温离子体是一种具有多种离子、电子以及激发态的原子等活性物质的电离气体，特性是在常压下即可产生且温度较低，在食品加工方面受到较大关注[13-14]。等离子体中的活性物质能使分子键断裂，形成低毒或无毒的小分子物质从而降解真菌毒素[15]。研究证明，低温等离子体能灭活榛子[16]、花生[17]中的黄曲霉菌，并能够降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇、伏马菌素B2和OTA[18]，因此，低温等离子体在降解真菌毒素中的效果已得到确认，但其在应用中普遍存在处理量较小和降解机制不明确的问题。建立一种大容量、高效率、安全无残留降解无核白葡萄干中赭曲霉毒素的方法，将有助于解决长期困扰我国葡萄干生产和出口中赭曲霉毒素污染问题，推动干果产业的发展。

Li 等[19]和Wang 等[20]报道了一种放电稳定均匀、具有较大等离子体产生区域的低温气相沿面放电设备，其一体式的特殊结构能够降低传输损耗，提高活性物质产量，可有效降解水溶液中的染料。在此基础上，本研究采用改进的低温气相沿面放电等离子体设备，发现采用外敷铝箔作为接地电极的情况下仍能触发丝状放电，产生大量活性物质，能够有效灭活赭曲霉毒素A。

鉴于此，本研究采用以空气为工作气体的低温放电等离子体降解OTA，研究等离子体在不同处理时间、不同电压和不同初始浓度下对目标毒素的降解效果，并评估低温放电等离子体处理对无核白葡萄干的理化指标及色差和香气成分的影响，以期为低温等离子体处理技术在无核白葡萄干赭曲霉毒素降解中的应用提供理论支撑，为干果中真菌毒素的降解提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

无核白葡萄干：北园春干果市场。无核白葡萄干大小均一，无机械损伤，无病害或腐烂。无核白葡萄干为当年采摘，洗净烘干备用。

赭曲霉毒素A（纯度99.8%）：山西点灿贸易有限公司；乙腈（色谱纯）、葡萄糖、淀粉、酚酞、盐酸、硫酸铜、亚甲基蓝、酒石酸钾钠、草酸（均为分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；硫代硫酸钠、碘化钾、三氯甲烷、氢氧化钠（均为分析纯）：天津市北联精细化学品开发有限公司；无水碳酸钠（分析纯）：天津市光复科技发展有限公司；异丙醇（分析纯）：天津市永晟精细化工有限公司。

1.2 仪器与设备

低温等离子体空气常压实验反应器（DBD-50）：美国泰克公司；紫外可见分光光度计（CN61M-752）：北京海富达科技有限公司；超高效液相色谱仪（LC20A）、Inert Sustain C18 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7µm）：日本岛津（中国）有限公司；气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）（7890B-5977）：中国安捷伦科技有限公司；手持式色差仪（NR10QC）：深圳市三恩时科技有限公司；水分活度测定仪（AW-60）：靖江市中诺仪器仪表有限公司；快速水分测定仪（FK-16A）：厦门弗布斯检测设备有限公司；电子分析天平（FA2004C）（精度0.000 01 g）：山东欧莱博仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 低温放电等离子体处理

低温放电等离子体反应器系统示意图如图1所示。

图1 低温等离子体反应器系统示意图Fig.1 Schematic diagram of low temperature plasma reactor system

该系统由交流（10 kHz）电源、等离子体发生器和处理室组成，因处理物基质与之前研究不同故将液态物质处理装置修改为固态物质处理装置[21]。将待处理物置于处理室曝气器周围（单层），螺旋电极（高压电极）与接地电极之间产生丝状放电，从而产生大量臭氧（O3）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（·OH）以及激发态粒子等活性物质处理无核白葡萄干[22]，并采用郭东权等[23]的方法对乙腈中OTA 进行处理，探究不同因素对OTA 降解效果影响。

1.3.2 不同因素对OTA 降解效果影响

1.3.2.1 不同处理时间对赭曲霉毒素A 降解效果的影响

取50µg/mL 的赭曲霉毒素A 溶液50µL 滴于盖玻片上，待液体干燥后选取低温放电等离子体处理时间为0、3、5、10 min，放电电压为25 kV。将处理后载玻片使用2 mL 乙腈洗脱24 h 吸出用于超高效液相色谱（ultra-performance liquid chromatography，UPLC）测定赭曲霉毒素A 含量并计算降解率，研究不同处理时间对OTA 降解效果的影响。

1.3.2.2 不同赭曲霉毒素A 初始浓度对其降解效果的影响

取10、30、50 µg/mL 的赭曲霉毒素A 溶液50 µL滴于盖玻片上，待液体干燥后于放电电压为25 kV 的低温放电等离子体下分别处理5 min。将处理后载玻片使用2 mL 乙腈洗脱24 h 吸出用于UPLC 测定赭曲霉毒素A 含量并计算降解率，研究不同赭曲霉毒素A初始浓度对OTA 降解效果的影响。

1.3.2.3 不同放电电压对赭曲霉毒素A 降解效果的影响

取50µg/mL 的赭曲霉毒素A 溶液50µL 滴于盖玻片上，待液体干燥后于放电电压为25、50、75 kV 的低温放电等离子体下分别处理5 min。将处理后载玻片使用2 mL 乙腈洗脱24 h 吸出用于UPLC 测定赭曲霉毒素A 含量并计算降解率，研究不同放电电压对OTA 降解效果的影响。

1.3.3 OTA 降解效果的测定

1.3.3.1 超高效液相色谱仪测试条件

将处理后样品以岛津液相系统测定赭曲霉毒素A含量。色谱柱C18 柱（150 mm×4.6 mm，5µm），或等效柱；柱温30 ℃；流动相A：冰乙酸+水（2+100），流动相B：乙腈；等度洗脱条件：A-B（50+50）；流速1 mL/min；进样量10µL；激发波长333 nm；发射波长460 nm。

1.3.3.2 赭曲霉毒素A 降解率计算方法

按以下公式计算赭曲霉毒素A 降解率。

式中：a为赭曲霉毒素A 的降解率，%；c为样品处理后赭曲霉毒素A 的浓度，µg/mL；c0为样品中赭曲霉毒素A 的初始浓度，µg/mL。

1.3.4 理化指标的测定

还原糖、总糖含量的测定采用斐林试剂滴定法[24]；可滴定酸含量的测定参照张辉等[25]方法；单宁含量的测定采用高锰酸钾滴定法[25]；L-抗坏血酸（vitamin C，VC）含量的测定采用2，6-二氯酚靛酚法[24]；水分活度采用水分活度仪测定[26]；褐变度采用紫外分光光度计法测定[26]；水分含量采用水分测定仪测定[27]；香气成分的测定采用高效气相色谱与质谱联用法[27]。

1.3.5 色差的测定及计算方法

色差值测定采用色差仪，每个样品测定重复10 次，取平均值。其中色差值用ΔE*ab表示，使用白色校准板进行校准。在白色背景下测量L*（亮度）、a*（绿色/红色）和b*（蓝色/黄色），读数一式3 份。根据下列公式计算确定色度（C*）、色相角（H*）和总色差（△E*ab）。

1.3.6 芳香物质的测定

1.3.6.1 挥发性化合物的富集

采用顶空固相微萃取（head space solid phase micro extraction，HS-SPME）的方式富集挥发性化合物。挥发性物质的定性及定量通过参考质谱数据库NIST14 和NIST14s，采用匹配度和保留时间对挥发物进行定性。

取（25±1）g 无核白葡萄干用25 mL 水浸泡过夜后匀浆，称取样品10 g，取2 g 氯化钠放入20 mL 顶空瓶内，平衡30 min 后，40 ℃萃取40 min。

1.3.6.2 GC-MS 条件

电子电离源的电子能量为70 eV，进样口温度260 ℃，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃。辅助加热温度250 ℃，扫描范围35～550 a.m.u。不分流进样，载气为氦气，流量1 mL/min，升温程序：40 ℃保持5 min，3 ℃/min 升至120 ℃保持5 min，10 ℃/min 升至250 ℃，保持10 min。

1.4 数据分析

所有试验进行3 次。数据表示为平均值±标准差，采用SPSS 19.0 对数据进行统计分析，用显著性分析（Tukey's honestly significant difference，Tukey HSD）检验对数据进行分析。处理结果的差异在P＜0.05 被认为显著，采用Origin 2018 软件分析显著性。

2 结果与分析

2.1 不同因素对赭曲霉毒素A 降解效果的影响

2.1.1 OTA 标准曲线

通过UPLC 法测定得出峰面积，并且进行标准曲线的绘制如图2 所示。

图2 OTA 标准曲线Fig.2 OTA standard curve

由图2 可知，标准品OTA 浓度与峰面积呈线性相关（R2=0.999 9），且线性关系良好，线性回归方程y=772.519x-248.959（式中：x为标准品OTA 浓度；y为峰面积）。

2.1.2 不同处理时间对赭曲霉毒素A 降解效果的影响

不同处理时间对赭曲霉毒素A 降解效果的影响如图3 所示。

图3 不同处理时间对赭曲霉毒素A 降解效果的影响Fig.3 Effect of different treatment times on the degradation of OTA

由图3 可知，在试验设定范围内，随着低温等离子体放电时间的延长，OTA 降解率呈明显上升趋势。处理3 min 时OTA 降解率仅（81.52±0.38）%，在5 min 时OTA 在相同条件下的降解率达到（90.79±0.43）%，在处理10 min 时OTA 的降解率为（99.12±0.01）%。可见，当放电电压与OTA 初始浓度一定时，在0～10 min 的处理时间内，处理时间越长OTA 的降解效果越好，且处理时间从3 min 增长至5 min 时，处理效果相较于5 min 增长至10 min 时降解速率明显提高。

2.1.3 不同赭曲霉毒素A 初始浓度对其降解效果的影响

不同赭曲霉毒素A 初始浓度对其降解效果的影响如图4 所示。

图4 不同赭曲霉毒素A 初始浓度对其降解率的影响Fig.4 Effect of different OTA initial concentrations on its degradation rate

由图4 可知，在试验设定范围内，随着OTA 初始浓度的增大，OTA 降解率呈先上升后下降趋势。初始浓度为10、30 µg/mL 的OTA 降解率高达（96.26±0.45）%、（96.52±0.13）%，初始浓度为50µg/mL 的OTA在相同条件下的降解率仅为（90.79±0.43）%。可见，当放电电压与处理时间一定时，OTA 溶液在10～50µg/mL范围内时，OTA 的浓度越低降解效果越好。这与张岩等[28]对乙腈中黄曲霉毒素B1降解的研究相似。

2.1.4 不同放电电压对赭曲霉毒素A 降解效果的影响

不同放电电压对赭曲霉毒素A 降解效果的影响如图5 所示。

图5 不同放电电压对OTA 降解率的影响Fig.5 Effect of different discharge voltages on the degradation rate of OTA

由图5 可知，在试验设定范围内，随着低温等离子体放电电压的增大，OTA 降解率呈明显上升趋势。放电电压为25 kV 时OTA 降解率为（90.79±0.43）%，放电电压为50、75 kV 时OTA 在相同条件下的降解率达到（97.89±0.11）%、（99.21±0.01）%。可见，当处理时间与OTA 初始浓度一定时，在25～75 kV 的放电电压范围内，放电电压越大OTA 的降解效果越好。

2.2 不同时间低温放电等离子体处理对无核白葡萄干理化指标的影响

为研究短时间OTA 快速降解对无核白葡萄干品质的影响，采用低温放电等离子体对无核白葡萄干处理0、3、5 min。经过0、3、5 min 低温放电等离子体处理后的无核白葡萄干品质对比见表1。

表1 不同时间处理后无核白葡萄干品质的对比Table 1 Comparison of the quality of seedless white raisins after different time treatments

由表1 可知，无核白葡萄干经过低温放电等离子体处理3、5 min 后，无核白葡萄干的各项品质没有发生改变且均没有显著性差异（P＞0.05），这些结果与用低温等离子体处理黄瓜表面的结果相似[29]，说明低温放电等离子体处理不会使食品理化指标发生改变。

2.3 不同时间低温放电等离子体处理对无核白葡萄干色泽的影响

经过低温放电等离子体以25 kV 的放电电压处理0、3、5 min 后的无核白葡萄干的颜色变化如表2 所示。对照样品是未经低温放电等离子体处理的无核白葡萄干。

表2 不同时间低温放电等离子体处理后无核白葡萄干色泽的对比Table 2 Color comparison of seedless white raisins after different times of low temperature discharge plasma treatment

由表2 可知，色度C*从21.444 升至21.875，意味着无核白葡萄干的颜色变得饱和。色相角H*从79.546 增加到79.833，表明无核白葡萄干经过低温等离子体处理后色相角更加趋近于黄色。总色差ΔE*ab从48.290 上升至49.697，这意味着无核白葡萄干的总色差有略微的提升。低温放电等离子体处理无核白葡萄干后色泽指标均有略微的提升，但并未出现显著性差异（P＞0.05），说明无核白葡萄干经过低温放电等离子体处理后仍保持较为良好的色泽，不会随着处理时间的延长而发生改变。

2.4 不同时间低温放电等离子体处理对葡萄干挥发性化合物的影响

挥发性物质的定性及定量通过参考质谱数据库，并通过保留时间对挥发性物质进行定性[30]，无核白葡萄干共检测出31 种挥发性物质，结果如表3 所示。

表3 低温放电等离子体处理对无核白葡萄干挥发性化合物的效果Table 3 Volatile compounds of seedless white raisins treated by low temperature discharge plasma

由表3 可知，无核白葡萄干中挥发性成分较为丰富，主要由醛类、酮类、酯类、醇类、酸类、烷烃类以及杂环化合物等组成。不同时间低温放电等离子体处理后无核白葡萄干中香气成分主要为酸类物质、醛类物质、醇类物质、酮类物质组成。其中甲酸、3-甲基丁酸、乙酸、3-甲基丁醛、己醛、（Z）-2-庚醛、3-甲基-2-丁醇、1-己醇、1-辛烯-3-醇9 种物质为无核白葡萄干的主要风味物质[27]。

由表3 可知，与0 min 处理的样品相比，3、5 min处理后无核白葡萄干中的大部分酸、醛、醇和酮类物质的相对含量未出现明显变化。无核白葡萄干经过低温放电等离子体处理后，酸类物质中3-甲基丁酸、己酸、辛酸出现明显的下降，而甲酸、戊酸、2-乙基己酸出现明显上升。其他物质中己醛、（Z）-2-庚醛、1-己醇、1-辛烯-3-醇、（E）-2-辛烯-1-醇、2，6-二叔丁基-4-羟基-4-甲基环己-2，5-二烯-1-酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、3，4-二甲基-2，5-呋喃二酮发生变化，可能是因为无核白葡萄干经过不同时间低温放电等离子体处理其中各类物质发生相互转换。其他的挥发性化合物均得到了较好地保持，未出现明显变化。

3 讨论与结论

本研究采用低温放电等离子体对OTA 进行降解，并研究其对无核白葡萄干品质的影响。结果表明，低温放电等离子体不同处理条件对OTA 的降解效果显著。随着低温等离子体放电时间的增长OTA 降解率增高，OTA 经25 kV 等离子体处理10 min，50 µg/mL的OTA 降解率可达99.12%；OTA 溶液在10～50µg/mL范围内时，初始浓度越低OTA 降解率越高，OTA 经25 kV 等离子体处理5 min，10 µg/mL 的OTA 降解率可达96.26%；放电电压对OTA 降解率影响最为明显，随着低温等离子体放电电压的增大，OTA 降解率不断增大，OTA 经75 kV 等离子体处理5 min，50µg/mL 的OTA 降解率可达99.21%。低温放电等离子体处理对无核白葡萄干的理化性质、蛋白浓度、色差均未产生显著影响（P＞0.05）；与0 min 处理的样品相比，3、5 min处理后无核白葡萄干中的大部分酸、醛、醇和酮类物质的相对含量未出现明显变化，其中个别酸类物质含量出现明显下降或上升，一些物质有略微的变化，其余挥发性化合物均得到了较好地保持。这些结果表明低温放电等离子体可以有效地降解OTA，并能保持无核白葡萄干的理化性质及色泽和香气。本研究对低温放电等离子体灭活OTA 进行探究，后续还需要进一步优化试验过程，并对降解产物进行分析，为低温放电等离子体在食品杀菌中应用及安全性评价提供重要依据。