不同光质组合的LED灯对小白菜生长及氮代谢生理机制的研究

刘玉兵 刘新华 刘明月 王军伟 张伟春 曹春信

摘 要 以‘早熟五号小白菜为试材，采用5种光质处理，研究不同光处理下小白菜生长、品质以及氮代谢主要相关酶活性及基因相对表达量的影响机理。与CK相比，其他4个处理均显著提高了小白菜的株高、茎粗、地上部分鲜质量、地上部分干质量、地下部分鲜质量和地下部分干质量。所有处理中，RBP处理下可溶性糖、可溶性蛋白、维生素C、铵态氮（NH4+-N）和硝态氮（NO3--N）含量达到最高，亚硝酸盐含量降低。RBP处理下硝酸还原酶（NR）活性和亚硝酸还原酶（NiR）活性最高，RB和RBP处理明显增加了谷氨酸合成酶（GOGAT）活性。RB、RBG和RBP处理下谷氨酰胺合成酶（Gs）活性显著高于CK，谷氨酸脱氢酶（GDH）活性則在RBP处理下最低。基因表达方面，RBP处理下NR、NiR、Gs和GDH的mRNA表达水平最高，GOGAT的mRNA表达量以RB处理最高，RBP处理其次。结合生长量、氮代谢和相关基因表达的综合表现，在红蓝光基础上增加紫光对小白菜的生长最为有利。

关键词 光质；小白菜；生长；氮代谢；基因表达

众所周知，植物生长发育离不开光照，除光强和光周期外，光质及其组成成分也起着至关重要的作用。光质不仅影响植物种子萌发、幼苗生长、茎的生长以及根系活力，还影响植物品质、代谢并参与调控其基因表达[1-2]。蔬菜中的代谢物积累会受到基因型、光照条件、环境温度、灌溉和施肥的显著影响，光质在光合生物合成和光形态建成中起着重要作用[3]。

发光二极管（LED）光源系统是近年来逐步发展起来的新型节能照明光源，可发出与光合色素吸收光谱相一致的单色光，也可以根据植物对光质需求的不同，调节光质比例，为植物生长提供适宜的光环境参数[4]。LED光现已被广泛应用在各种水果、蔬菜、农作物、花卉、药用植物及部分林木植物树种幼苗的生产培育等各类植物中，其对于植物种苗生长和品质的明显改善以及药用有效植物成分的大量累加等多个方面均可能会有着较大的不同程度的影响。然而目前的研究主要集中在单色红光、蓝光或不同比例的红蓝组合光。在此基础上，本试验添加其他颜色的光质，研究不同光质对小白菜生长量、营养品质以及氮代谢主要相关酶活性及其基因相对表达量的影响机理，为植物工厂选择适宜小白菜生长的最佳光质配比提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料选用小白菜，品种为‘早熟五号，采购于杭州六和种子有限公司。LED灯光（型号：T8）订购于广东中山善栽农林科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 试验于2020年5月6日—7月5日在湖南农业大学人工气候室内进行。将种子直播于50孔穴盘中进行育苗，待幼苗长到2叶1心时，选取长势一致的定植于水培槽中，随即进行光质处理。人工气候室白天温度设定为25 ℃，夜间温度为18 ℃，空气湿度60%；栽培营养液采用日本园试配方，pH保持在6.0～6.5。在定植30 d后取样采收，随后立即用液氮冷冻储存于  -80 ℃超低温冰箱中，以便测试相关生理指标和基因表达。

1.2.2 试验方法 试验共设置5种光质处理：（1）白炽光（W，对照）；（2）红蓝光（RB=  3∶1）；（3）红蓝绿光（RBG=3∶1∶1）；（4）红蓝紫光（RBP=3∶1∶1）；（5）红蓝近红外光（RBF=  3∶1∶1）共5种不同组合光质处理；每个处理重复3次，共15个小区，每小区培养30株。

灯管比例按照灯珠数量之比设置，试验全程采用黑布进行遮盖，防止受到外界自然光的干扰；各处理之间也采用银黑双色薄膜间隔，避免相互影响。通过调整灯管的数量和设置水培架的高度设置光照强度为150 μmol/（m2·s），光周期为昼夜14 h/10 h。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 形态指标测定 每个小区随机选取3株。用直尺直接测量小白菜叶节部位到顶部的距离作为株高；将游标卡尺测量平行于子叶展开方向的子叶节粗度作为茎粗；剪断植株根茎相连部分，用电子天平分别测量植株的地上部分鲜质量和地下部分鲜质量；设置烘箱温度为105 ℃，杀青30 min后再调至65 ℃烘干至恒量，测定植株地上部分干质量和地下部分干质量（精确到0.01 g）。

1.3.2 叶绿素含量的测定 采用丙酮∶乙醇∶水=4.5∶4.5∶1（体积比）浸泡的方法对叶绿素进行提取，用紫外可见分光光度计检测叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素峰值，计算各叶绿素含量。

1.3.3 品质指标测定 利用蒽酮比色法原理测定可溶性糖含量。维生素C含量、亚硝酸盐含量、可溶性蛋白含量均使用苏州科铭生物技术有限公司提供的试剂盒测定。

1.3.4 氮含量及代谢相关酶活性测定 铵态氮和硝态氮含量测定均使用苏州科铭生物技术有限公司提供的试剂盒测定。参照上海茁彩生物科技有限公司生产的硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、谷氨酸合成酶测定试剂盒、谷氨酰胺合成酶测定试剂盒和谷氨酸脱氢酶测定试剂盒的说明书测定硝酸还原酶（NR）、亚硝酸还原酶（NiR）、谷氨酸合成酶（GOGAT）、谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸脱氢酶（GDH）活性。

1.3.5 氮代谢相关酶活性基因表达测定 总RNA提取及cDNA的合成：小白菜总RNA提取使用TIANGEN公司生产的RNAperp Pure Plant Plus Kit植物总RNA提取试剂盒，操作步骤参照试剂盒的说明书，对总RNA进行提取，对所有被提取出来的RNA进行OD值和RNA浓度测定，并用电泳确认RNA是否已经降解。随后置于-80 ℃超低温冰箱中保存，备用。采用TIANGEN公司生产的FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix试剂盒进行cDNA第一链的合成。

荧光定量PCR：（1）引物设计试验选取了小白菜氮代谢的5个编码关键酶的基因进行荧光定量PCR分析。以Actin作为内参基因，利用引物设计软件premier 5设计基因特异性引物，引物由生物工程技术服务有限公司合成。内参及引物设计如表1所示。

（2）反应体系：采用诺唯赞生物科技有限公司生产的2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒进行荧光定量PCR（表2）。

（3）反应程序：采用3步法PCR扩增程序进行PCR反应：第一步，95 ℃ 30 s；第二步，95 ℃  10 s，60 ℃  30 s，40个循坏；第三步，95 ℃15 s，  60 ℃ 60 s，95 ℃15 s。以上所有指标均生物学重复3次，求平均值。

1.4 数据处理

分别使用软件Excel 2010和GraphPad Prism 5处理试验数据和作图，采用SPSS 20.0进行单因素显著性方差分析，用Duncans检验法对显著性差异（P<0.05）进行多重性比较。利用2-△△CT计算定量相对基因表达。

2 结果与分析

2.1 不同光质对小白菜生长及叶片色素含量的影响

由表3可以看出，不同光质处理对小白菜生长量影响显著。与CK相比，RB、RBP和RBF处理显著增加了小白菜的株高，茎粗以RB和RBP处理下最明显；RB、RBP、RBG和RBF处理都不同程度地提高了植株的地上部分鲜质量、地下部分鲜质量和地上部分干质量，且以RBP处理提高最为明显。表明RBP处理有利于小白菜地上部和地下部干物质的积累。

由表4可看出，除RBG处理外，RB、RBP和RBF处理下小白菜叶绿素a含量明显高于CK，其中以RBP处理最高，与其他处理达到显著差异；叶绿素b含量除RB处理略低于CK外，其余各处理都高于CK，但各处理间差异并不显著。RBP 处理下小白菜的叶绿素（a+b）总含量最高，RBG处理最低；叶绿素（a/b）值在RB处理下最大，但各处理间未达到显著。RBP处理下类胡萝卜素含量最高，并显著高于其他处理。

2.2 光质对小白菜营养品质的影响

由表5可知，不同光质处理对小白菜的营养品质有明显不同的影响。RB、RBG、RBP和RBF处理下可溶性糖含量均高于CK，且达到显著水平，其中RB处理达到最高；可溶性蛋白含量以RBP处理最高，说明紫光有利于植株体内蛋白质的积累。此外，RB和RBP处理下维生素C含量均显著高于CK处理。与CK相比，只有RBF处理下亚硝酸盐含量高于CK，其余各处理均表现为降低。

2.3 光质对小白菜氮代谢的影响

2.3.1 光质对小白菜铵态氮和硝态氮含量的影响 铵态氮和硝态氮是植物吸收、利用氮素的主要来源。由图1可知，与CK相比，RB、RBG、RBP和RBF处理都明显地增加了小白菜叶片铵态氮含量，其中RB处理未与CK达到显著差异，RBG、RBP和RBF处理则显著高于CK；硝态氮含量以RBP处理最高，并显著高于其他处理。表明RBP处理更有利于小白菜对氮素的吸收和  利用。

2.3.2 光质对小白菜氮代谢关键酶活性的影响 由图2可以看出，硝酸还原酶活性（NR）以RBP处理最高，RB、RBG、RBP和RBF处理均显著提高小白菜叶片的亚硝酸还原酶活性（NiR），谷氨酸合成酶活性（GOGAT）以RB处理最大，RBP处理其次，谷氨酰胺合成酶活性（Gs）除RBF处理与CK无显著差异外，其余处理都显著提高了其活性，谷氨酸脱氢酶（GDH）活性只有在RB处理下得到提高，其余处理均明显低于CK，其中RBP和RBF处理更是显著降低。综上表明RBP处理对促进碳的同化、转化及氮的吸收与利用，增加氮代谢产物的积累的效果最佳。

2.3.3 光质对小白菜氮代谢关键酶基因表达量的影响 从图3可以看到，不同光质处理对小白菜叶片氮代谢关键酶基因表达量水平的影响有着显著差异。RBP处理下NR和NiR的mRNA表达水平显著高于其他处理，RB和RBG处理下NR和NiR的mRNA表达水平虽明显上调，但与CK未达到显著差异；RBF处理下NiR的基因表达水平更是显著低于CK。GOGAT的基因表达量以RB处理最高，其次是RBP处理。与GOGAT类似，Gs的mRNA表达水平以RB和RBP处理最高，且两处理间无显著差异。RB和RBP处理下GDH的mRNA表达水平显著上调，且RBP处理显著高于RB处理。表明RBP处理更能促进小白菜叶片NR、NiR、Gs和GDH基因表达水平的上调。

3 讨  论

生长量可以直观地表达植株生长的情况。研究表明，红光处理促进植物茎的伸长，而蓝光则促进植物的茎粗生长[5]。本试验中，与CK相比，RB、RBP和RBF处理都显著增加了小白菜株高，这与高波等[6]、孙娜等[7]的研究报道类似。相比RB处理，RBP处理下小白菜地上部分干质量、地下部分鲜质量和地下部分干质量显著性地分别提高3.2%、30.3%和19.0%。表明，RBP处理更有利于促进小白菜的生长发育，促进地下部分向地上部分干物质的运输和积累。

糖类物质是植物新陈代谢的主要原料和储存物质。本试验中，与CK处理相比，其他处理均显著提高了小白菜的可溶性糖含量，RB处理提升最多，RBP处理次之，这与王晓晶等人在生菜上的试验结果一致[8]。随着蓝光比例的增加，西兰花芽苗菜维素素C和蛋白逐渐上升[9]，而紫光处理也可以提高生菜[10]和番茄果实[11]的可溶性蛋白含量。本试验中，除RBG处理降低外，其余各处理均不同程度地提高了小白菜叶片可溶性蛋白含量，其中以RBP和RBF处理最高。此外，除RBF处理明显低于CK外，各处理均提高了小白菜的维生素C含量，其中RB和RBP处理显著高于其他处理，分别比CK提高了13.7%和  38.1%。因此，相比于紅蓝混合光，红蓝紫混合光更有利于促进小白菜叶片维生素C含量积累，这一结论与王晓晶等[8]和班甜甜等[12]试验结果不同，基于这种现象可能由于处理方法、光源类型及选用试材不同所导致。

在連续光处理下，将绿光添加到红光和蓝光中对降低莴苣中的硝酸盐含量具有积极作用[13]。本试验中，除RBF处理下小白菜叶片亚硝酸盐含量要高于CK处理，其余各处理均得到了降低，其中RBG处理降低最多，这与前人研究的结果一致[14]。不同光质处理对植株光合作用的影响最终反映在对其生长和物质积累上[15]。本试验中，除RBG处理外，RB、RBP和RBF处理都明显地增加了叶片中叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素（a+b）和类胡萝卜素的含量，这与陈艺群等[16]的研究结果一致。

硝酸还原酶主要作为一种能够调节各类亚硝酸盐酶的共聚性和酶的主要关键还原酶之一[17]。研究表明，当增加蓝光比例，可提高莴苣和菠菜的NR活性，增强氮代谢[18-19]。本试验中，NR活性以RBP处理最高，且与其他处理达到显著差异，与CK相比，RB、RBG、RBP和RBF处理下NiR活性，较CK分别提高了224.6%、116.7%、  244.8%和199.5%。RB和RBP处理提高了叶片GOGAT活性。另外，与CK相比，RB、RBG、RBP和RBF处理都明显地提高了小白菜叶片中谷氨酰胺合成酶（Gs）活性。GDH活性只有RB处理高于CK，RBG、RBP和RBF处理分别低于对照20.6%、40.5%和33.7%。这与前人表示红蓝混合光可显著提高番茄幼苗的GS、GOGAT活性的研究结果相似[7]。

光可以直接参与Gs2基因的表达及其活性。本试验中，RBP处理下小白菜叶片Gs的mRNA表达水平最高，且显著高于其他处理，RB和RBG处理下NR和NiR的mRNA表达水平与对照无显著差异，RBF处理则显著低于CK。Bian等[20]报道了在短期连续光照下补充绿光对提高NR和NiR的mRNA表达水平具有积极作用。可见，即使采用同一种光，设置不同光照时间和不同植株，最终结果也不相同。此外，RBG和RBF处理下Gs的mRNA表达水平都低于CK。GOGAT的mRNA表达量以RB处理最高，RBP处理其次，RBG和RBF处理均低于CK，但差异不显著。在所有处理中，RBP处理下GDH的mRNA表达水平显著高于其他处理。

4 结  论

综上，RBP处理诱导NR、NiR、Gs和GDH的mRNA表达水平的上调，提高了植株NR、NiR、GOGAT和GS活性，增强植株光合作用，改善小白菜的营养品质，显著提高了地上部分鲜质量、地上部分干质量、地下部分鲜质量和地下部分干质量，促进植株生长及同化产物向营养器官的运输和积累

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Physiological Mechanism of LED Lights with Different

Light Quality Combinations on Growth and Nitrogen Metabolism of Mini Chinese Cabbage

Abstract The effects of different light treatments on the growth，quality，as well as the activities of main related enzymes and gene expression of nitrogen metabolism involved in nitrogen metabolism were investigated. Using ‘Zaoshu No.5 as the test material，five different light quality treatments were applied，and compared with control （CK），the other four treatments significantly improved the various growth parameters of mini  Chinese cabbage，including plant height，stem diameter，fresh  mass of aboveground part，dry  mass  of aboveground part，fresh weight of underground part and dry weight of underground part.Among the treatments，the highest levels of soluble sugar，soluble protein，vitamin C，ammonium nitrogen （NH+4-N），and nitrate nitrogen （NO-3-N） were observed under the red，blue，and purple （RBP） treatment，with a decrease in nitrite content.Nitrate reductase （NR） activity and nitrite reductase （NiR） activity were highest under RBP treatment，while the RB and RBP treatment significantly increased glutamate synthase （GOGAT） activity. Glutamine synthase （Gs） activity was significantly higher than CK under RB，RBG and RBP treatment，while glutamate dehydrogenase （GDH） activity was the lowest under RBP treatment.In terms of gene expression，the mRNA expression levels of NR，NiR，Gs and GDH were the highest under RBP treatment，and the mRNA expression of GOGAT was the highest in RB treatment，followed by RBP treatment. Combined with the comprehensive performance of growth amount，nitrogen metabolism and related gene expression，adding purple light on the basis of red and blue light is most beneficial to the growth of pakchoi.

Key words Light quality; Chinese cabbage; Growth; Nitrogen metabolism; Gene expression