KRT23激活AKT信号通路促进肝癌细胞增殖

梁杏花?刘佛球?颜蓉?胡娟

【摘要】目的 探讨角蛋白23（KRT23）高表达促进细胞增殖对肝癌的影响。方法 通过生物信息学分析KRT23在肝癌中的表达，过表达及抑制KRT23后采用噻唑兰（MTT）、克隆形成实验分析KRT23对肝癌细胞增殖能力的影响。通过软件预测，实时荧光定量PCR（qPCR）及蛋白免疫印迹法实验分析KRT23与AKT 信号通路的调节关系。结果 肝癌中KRT23的表达水平明显高于正常对照组织。MTT、克隆形成实验显示KRT23过表达后促进细胞增殖，而下调KRT23后抑制细胞增殖；通过基因富集分析（GSEA）， qPCR及蛋白免疫印迹法检测发现KRT23可激活AKT信号通路进而促进细胞增殖，同时在过表达KRT23细胞中抑制AKT信号通路后细胞增殖能力明显下调。结论 KRT23调控AKT信号通路影响肝癌细胞增殖，提示KRT23在肝癌的恶性进程中具有重要的作用，在肝癌的发生发展中可能扮演重要角色。

【关键词】KRT23；AKT信号通路；肝癌；增殖

KRT23 promotes the proliferation of liver cancer by activating AKT signaling pathway Liang Xinghua， Liu Foqiu， Yan Rong， Hu Juan. Department of Gastroenterology， the Fourth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University， Guangzhou 511300， China

Corresponding author， Liang Xinhua， E-mail： 122002858@qq.com

【Abstract】Objective To investigate the effect of high keratin 23 （KRT23） expression promoting cell proliferation on liver cancer. Methods The expression of KRT23 in liver cancer was analyzed by bioinformatics. After overexpression and inhibition of KRT23， the effect of KRT23 on the proliferation of liver cancer cells was analyzed by MTT and clone formation assay. The regulatory relationship between KRT23 and AKT signaling pathway was analyzed by software prediction， qPCRand Western blot. Results The expression level of KRT23 in liver cancer was significantly higher than that in normal control tissues. MTT and clone formation assay showed that overexpression of KRT23 promoted cell proliferation， while downregulation of KRT23 inhibited cell proliferation. GSEA analysis， qPCR and Western blot showed that KRT23 could activate the AKT signaling pathway and promote cell proliferation. Meanwhile， inhibition of AKT signaling pathway in overexpressing KRT23 cells significantly reduced cell proliferation. Conclusions KRT23 affects the proliferation of liver cancer cells by regulating the AKT signaling pathway. These results suggest that KRT23 exerts significant effects upon the malignant procession of liver cancer and may play an important role in the occurrence and development of liver cancer.

【Key words】KRT23；AKT signaling pathway；Liver cancer；Proliferation

肝細胞癌（肝癌，HCC）是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤。肝癌的发病率在各类肿瘤中排名第五，是世界上第六大常见病和第三大癌症相关死亡原因［1-2］。肝癌病死率之高主要由于其复发率较高，据报道肝癌两年复发率为50%，而这种高复发率主要是由于肿瘤的增殖能力和耐药性导致［3］。因此，迫切需要了解影响肝癌进展和恶性增殖的潜在机制。从数千个基因中区分促进肝癌恶性进程的关键基因对于抑制这一过程是必不可少的，但仍然是一个巨大的挑战。角蛋白分为Ⅰ型角蛋白（含 KRT9～KRT20）和Ⅱ型角蛋白（含KRT1～KRT8），可作为影响上皮细胞结构完整性的中间丝蛋白［4］。据报道角蛋白23 （KRT23）与肝脏疾病密切相关［5］。KRT23是过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARA）的靶基因，被MYC扩增，可能促进肝细胞增殖并导致肝癌［6］。然而，KRT23在肝癌中对肿瘤进程的影响及具体机制尚不清楚。本研究旨在观察KRT23在肝癌中的表达及其对细胞增殖功能的影响，探讨其能否作为肝癌预防及治疗靶点。

材料与方法

一、主要材料

HCCLM3细胞株购自中国医学科学院细胞资源中心；培养基相关试剂购自美国Hyclone公司；Lipo3000? Transfection Reagent试剂购自碧云天；双荧光素酶实验试剂盒由美国Promega公司生产；GAPDH抗体、KRT23抗体均由博士德公司生产；LY294002购买于Sigma公司；实时荧光定量PCR （qPCR）、逆转录试剂盒均由Takala公司生产。KRT23过表达pcDNA3.1质粒（KRT23）及空载pcDNA3.1质粒，干扰质粒及引物，均由广州艾基生物技术有限公司设计并构建；PCR仪器为美国R&D公司生产；BX43显微镜为日本奥林巴斯公司生产。肝癌组织样本收集于广州医科大学附属第四医院消化内科，并获得伦理委员会批准（批件号：2023-D-006）。

二、方 法

1.细胞培养

HCCLM3细胞用含10% FBS的1640 培养基于37℃、5% CO2条件下进行培养，并加入链霉素和青霉素预防污染。观察细胞状态，待细胞融合长至70%～80%时进行传代，取对数生长期细胞用于转染等实验。

2.细胞处理

将HCCLM3细胞接种于6孔板，使用Lipofectamine 3000转染细胞，细胞分组如下，过表达KRT23组（HCCLM3-KRT23）及其过表达对照组（HCCLM3-vector）、干扰KRT23组（HCCLM3-KRT23/RNAi）及其干扰对照组（HCCLM3-RNAi-vector）。转染后细胞置于37 ℃、5% CO2条件下培养6 h后，换为1640培养基（10% FBS）继续培养48 h。

3. 噻唑蘭（MTT）检测细胞活力

收集对数期细胞，将细胞种植于96孔板，调整细胞悬液浓度至2×103个细胞/孔，培养24 h后向待测孔中加入5 mg/mL MTT溶液，每孔20 μL；4 h后加入100 μL二甲基亚砜，置摇床上振荡10 min，

使结晶物充分溶解；酶联免疫检测仪570 nm处测量各孔的吸光度值。

4.克隆形成实验

收集对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度500细胞/mL接种于6孔板持续培养10～14 d，观察克隆出现日期及生长情况，大于50个细胞的集落算一个克隆，加固定液，1 mL/孔摇床上放置10 min后，加1 mL/孔结晶紫染色，计算每个孔的克隆数并拍照。

5.实时荧光定量PCR（qPCR）

采用Trizol法提取HCCLM3细胞样本中的总RNA，根据qPCR 体系说明书检测各组样本中KRT23 mRNA相对表达水平。以GAPDH为内参，用2-△△Ct方法计算分析各组样本中KRT23表达水平。

6.蛋白免疫印迹法

用蛋白裂解液裂解、提取各组HCCLM3细胞总蛋白，浓度测定用 BCA 法测定蛋白浓度。每组各取30 μg进行SDS-PAGE 凝胶电泳、转 PVDF膜、奶粉封闭、一抗KRT23抗体（1∶1 500）和GAPDH抗体（1∶3 000） 孵育、二抗山羊抗兔HRP抗体（1∶3 000） 孵育、ECL 发光液显色步骤依次进行实验检测蛋白表达水平。

三、统计学处理

采用SPSS 24.0 软件进行统计分析。计量资料采用 Shapiro-Wilk 进行正态性检验，服从正态分布的计量资料用表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验，采用配对t检验分析癌组织和癌旁组织间的差异。P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

一、KRT23在人类肝癌组织高表达

通过TCGA数据库分析发现KRT23在肝癌中表达高于正常对照（图1A），在组织样本中蛋白免疫印迹法检测KRT23蛋白表达高于癌旁对照组织（图1B），且qPCR检测KRT23 mRNA表达高于癌旁对照组织（图1C），差异均有统计学意义（P均< 0.05）。

二、KRT23过表达可促进肝癌细胞增殖能力

细胞转染后通过qPCR及蛋白免疫印迹法检测KRT23过表达组（HCCLM3-KRT23）与载体对照组（HCCLM3-vector）及KRT23干扰组（HCCLM3-KRT23/RNAi）与其干扰对照组（HCCLM3-RNAi-vector）中KRT23基因（图2A）及蛋白（图2B）表达情况，经过MTT检测发现在HCCLM3细胞中KRT23过表达组中细胞增殖能力强于过表达对照组，而KRT23干扰后细胞增殖能力弱于干扰对照组（图2C）；通过克隆形成实验发现KRT23过表达组中细胞克隆形成能力强于过表达对照组，而KRT23干扰后细胞克隆形成能力低于干扰对照组（图2D），2组比较差异均有统计学意义（P均< 0. 05）。

三、KRT23通过激活AKT信号通路促进细胞增殖

通过基因富集分析（GSEA）发现KRT23富集AKT信号通路相关分子，且与KRT23的表达正相关（图3A）。通过蛋白免疫印迹法发现载体对照组（HCCLM3-vector）相比KRT23过表达组（HCCLM3-KRT23）中p-AKT表达明显增高，然而KRT23的干扰组（HCCLM3-RNAi-vector）中p-AKT蛋白的表达水平低于干扰对照组（HCCLM3-RNAi-vector）（图3B）；通过qPCR检测发现与过表达载体对照组（HCCLM3-ector）相比，KRT23过表达组（HCCLM3-KRT23）中细胞周期相关分子CyclinD1表达增强，而细胞周期抑制分子p21表达降低；反之在KRT23的干扰组（HCCLM3-RNAi-vector）与干扰对照组（HCCLM3-RNAi-vector）中细胞周期相关分子CyclinD1表达降低，而细胞周期抑制分子p21表达升高（图3C）。

四、KRT23促进肝癌细胞增殖依赖于AKT信号通路

为了进一步验证KRT23通过AKT信号通路影响细胞增殖能力，我们在KRT23过表达细胞中用AKT信号通路抑制剂（LY294002）刺激后，通过MTT及克隆形成实验检测发现，AKT通路抑制剂刺激后细胞活力受到抑制（图4A），同时细胞克隆数明显降低（图4B）。

讨论

肝癌是一种常见的恶性肿瘤，尽管肝切除术、射频消融、肝移植等治疗方法取得了重大进展，但由于肝癌早期发现较难，大部分患者发现时已处于晚期，这使得肝癌成为世界范围内最棘手的肿瘤之一［7］。越来越多的证据表明，癌基因和肿瘤抑制因子的异常表达可能在肝癌发展进程中起着不可或缺的作用［8-9］。KRT23引起了我们的注意，因为有报道证实KRT23可作为肝癌诊断和预后的生物标志物［4］。然而KRT23在肝癌中的调节功能尚未有相关报道。在本研究中，我们发现KRT23在肝癌中升高，通过MTT及克隆形成实验表明在肝癌细胞中高表达KRT23可促进细胞增殖。

目前已有文獻报道，肿瘤细胞发生发展与PI3K/AKT信号通路相关［10-12］。同时许多研究发现AKT信号通路的激活对肿瘤细胞增殖，自噬调节等具有重要的作用［13］。与此同时，许多研究表明PI3K/AKT信号通路与肝癌密切相关。上述研究提示在肝癌中AKT信号通路的激活对肝癌的进程有重要作用。

本研究通过GSEA分析发现KRT23高表达与AKT信号通路的基因富集正相关。过表达KRT23后p-AKT活性增强，且细胞周期蛋白cyclinD1表达上调，细胞周期抑制分子p21表达下降。在KRT23高表达的基础上联合AKT抑制剂处理，细胞增殖能力降低。本研究证明 KRT23是肝癌中潜在的癌基因，并且能通过激活AKT 信号通路促进肝癌细胞增殖。因此，KRT23可能成为新的干预和治疗肝癌的潜在靶点。然而，我们的研究还存在不足，缺少KRT23在体内对肿瘤的影响研究及KRT23对AKT信号通路调节的机制研究。这也是我们未来研究应侧重于KRT23影响肝癌进程的机制。

综上所述，KRT23可通过调节AKT信号通路促进肝癌细胞增殖，为KRT23可以作为肝癌诊断及治疗的潜在靶点提供理论支持。

参 考 文 献

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（收稿日期：2023-12-11）

（本文编辑：杨江瑜）