HIF-1α对慢性肾脏病血管钙化作用的相关研究进展*

李姗姗，孙 倩，杨少宁，屈 凯，于小勇△

1 陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046； 2 陕西省中医医院，陕西 西安 710003

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）是各种原因导致的慢性肾脏结构和功能异常，或者肾小球滤过率低于60 mL/（min·1.73m2），肾脏损害病史大于3个月。我国CKD患者总体发病率呈逐年增加趋势，已造成巨大的社会和经济负担［1-2］。其中，心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）死亡人数约占CKD患者总死亡人数的1/2，已成为CKD 患者首要致死原因［3］。血管钙化（vascular calcification，VC）是由羟基磷灰石晶体（又称为羟磷灰石、碱式磷酸钙）异位沉积于血管壁而产生，类似于骨形成的主动调节过程，是CVD 发生的独立预测因子，已成为增加CKD患者心血管死亡率和全因死亡率的主要危险因素［4］。近年来，相关研究表明，缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor 1 alpha，HIF-1α）是诱发或加重血管钙化的重要转录因子，在CKD血管钙化大鼠血清中过表达，且与主动脉钙化损伤呈正相关［5］。HIF-1α不仅可通过调节血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）、骨相关因子runt 相关转录因子（runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein，BMP-2）等多种成骨细胞分化的关键转录因子及骨相关蛋白标志物的表达，促进VSMCs 成骨样分化，最终导致VC 形成［6］，还通过诱导炎症反应及氧化应激、诱导细胞凋亡及细胞自噬、参与糖酵解途径等诱导VC形成。现从HIF-1α对CKD血管钙化的影响进行综述。

1 HIF-1α的概念及机制

HIF 是由对氧敏感的活性功能性亚基α 和仅在细胞内稳定表达β亚基组成的异源二聚体，是细胞适应缺氧、维持氧稳态的关键转录调节因子，在低氧条件下稳定表达。HIF-α有3个亚基：HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α。其中，HIF-1α几乎在所有细胞中都有表达，而在肾组织中特异性表达于肾小管细胞（主要是集合管）。正常情况下，HIF-1α上的特异性脯氨酸残基被脯氨酰羟化酶（prolyl hydroxylase domain，PHD）羟基化，被E3 泛素连接酶（von hippel-lindau protein，VHL）识别并泛素化，然后通过蛋白酶快速降解［7］，这一过程使其表达和降解处于动态平衡。在低氧状态下，PHD活性被抑制，HIF-1α的降解被阻断，表达增加，HIF-1α由细胞质转移到细胞核内，与细胞核内HIF-1β结合形成转录起始复合物，启动下游相关靶基因转录，介导多种靶细胞适应性低氧反应［8］。HIF-1 参与调控的靶基因超过100 种，主要包括［9-10］：1）血管内皮生长因子相关基因；2）血红素加氧酶相关基因；3）促红细胞生成素相关基因；4）葡萄糖转运体1 和糖酵解酶类基因。这些靶基因在促进血管再生、调节铁代谢、促进红细胞生成、调节能量及细胞外基质代谢、诱导骨形成、炎性反应、细胞增殖等方面起重要作用。

2 CKD血管钙化的概念及机制

2.1 CKD 血管钙化的西医学认识近年研究发现，血管钙化是一个类似成骨分化的可调控主动生物学过程，是由羟基磷灰石异位沉积于血管壁上产生［11］，是多种常见病的共同病理表现，如高血压、糖尿病、CKD 及动脉粥样硬化等［12］。主要包括血管内膜钙化、血管中膜钙化、心脏瓣膜钙化和钙化防御。其中血管中膜钙化常发生于CKD 血管钙化过程。

2.2 CKD 血管钙化机制CKD 患者肾脏长期处于缺血、缺氧状态，可诱导多种机制促进VC 的发生发展。同时，VC的发生又可进一步加重肾脏缺血、缺氧，因此，VC 的发展与肾功能进展呈正相关。CKD 血管钙化发病机制错综复杂，尚未明确，目前研究发现可能与以下因素有关：1）各种刺激因子如尿毒症毒素、高磷血症、细胞因子、炎症反应、氧化应激等诱导VSMCs 成骨样转分化［13］；2）钙化促进因子/钙化抑制因子失衡［14］，钙化促进因子如BMP-2、骨钙素（bone gla protein，BGP）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）等蛋白表达上调，促进血管钙化形成；钙化抑制因子如胎球蛋白A（Fetuin A）、骨保护素（osteoprotegerin，OPG）、基质Gla蛋白（matrix protein Gla，MPG）等表达下调，抑制促钙化因子表达，抑制血管钙化［15］；3）氧化应激和炎症反应：CKD 后期由于尿素氮等毒素蓄积，活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）产生增加，ROS 作为促进血管钙化的独立危险因素，可通过氧化应激参与血管钙化的形成；CKD 后期尿毒症内环境有利于炎症细胞生长和炎症因子释放，这些炎症因子通过不同途径参与VSMCs 成骨样转分化，最终诱导血管钙化；4）细胞凋亡和细胞自噬：VSMCs 发生凋亡后产生的降解产物-基质囊泡是血管钙化的始动环节；自噬通过调控VSMCs 表型转换，减少VSMCs 基质囊泡释放［16］。近年来，关于信号通路对血管钙化影响的研究 较 多，如Klotho/FGF-23 轴［17］、Notch 信 号通路［18］、Wnt/β-catenin 信号通路［19］及HIF-1α［20］也参与血管钙化的发生发展。

综上所述，多种危险因素造成血管钙化形成的大环境，这种内环境的改变会诱导多种机制参与血管钙化的发生发展，同时会受到多种信号通路和细胞因子调控，这些因素相互作用，最终诱导VSMCs发生成骨样转分化，促进CKD血管钙化的形成。

2.3 CKD 的中医学认识CKD 属中医“关格”“肾痨”“水肿”等范畴，进展至后期，以脾肾亏虚为本，瘀毒湿浊蓄积为标。血管钙化是CKD尤其是ESRD最常见的并发症之一，是在“关格”基础上发生的虚实夹杂疾病，其基本病机仍以脾肾两虚为本，因虚致瘀血内阻，瘀血浊毒互结于血脉而致血脉痹阻，发为“胸痹”“脉痹”［3］，而本虚与标实之间又相互影响，相互促进。于思明等［21］认为VC 的发生与心不主血脉，或久病致瘀，瘀浊壅滞脉道，血行受阻有关。张璐芸等［22］基于“痰瘀毒”论治观点，运用健脾补肾通络方，以补气为主，通络为辅，在调节钙磷代谢平衡，降低血管钙化的发生方面疗效颇佳。近代学者认为CKD 血管钙化是在脾肾亏虚的基础上发生瘀血浊毒互结，痹阻于脉道，而瘀血浊毒反之又损伤人体正气，两者相互促进，相互影响，导致血管钙化的发生发展［23］。

综上所述，血管钙化属中医“脉”的范畴，归心所主，与心不主血脉有关，是由肾脏衰败累及五脏所致，其基本病机以脾肾两虚为本，浊毒、瘀血互结为标，而血瘀是血管钙化的基本病机，故治当补益脾肾，兼祛痰浊、清瘀血。

3 HIF-1α参与CKD血管钙化形成

3.1 HlF-1α 通过促进VSMCs 成骨样分化参与血管钙化在低氧、炎症等刺激下，VSMCs 失去收缩型标志物，从去分化状态的收缩表型转变为合成表型，发生成骨样分化，诱导血管钙化，增加CKD患者心血管疾病的发生率和全因死亡率［24］。其中VSMCs 收缩蛋白如α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、平 滑 肌22α（smooth muscle protein 22α，SM22α）表达减少，成骨表型标志物如Runx2、ALP、BMP-2 表达上调，提示VSMCs表型转化与血管钙化关系密切，在CKD血管钙化形成中发挥重要作用［25］。研究发现，HIF-1α作为关键低氧诱导因子，也是VSMCs 促进钙化的关键因子，低氧可强化无机磷酸盐介导的VSMCs成骨转分化和钙化［26］。研究发现，在5/6 肾切除联合高磷高钙饮食诱导的大鼠CKD 血管钙化模型中，血管钙化的VSMCs 相关标志物表达下调，相反，HIF-1α及其下游靶基因如VEGF-A mRNA、葡萄糖转运体1（glucose transporter type 1，GLUT1）mRNA 表达增加［26］。同时，VEGF-A 还可激活下游Notch1 信号通路，增加VSMCs 成骨表型标志物如BMP-2、RUNX2 等的表达，诱导VSMCs 成骨样转分化。VSMCs 在无机磷酸盐介导下，细胞中钙含量、HIF-1α及其靶基因、成骨表型标志物的表达均上调，而在缺氧状态下该表达更显著。但当HIF-1α表达被抑制后，VSMCs 中钙含量、成骨表型标志物表达较对照组无明显差异，说明HIF-1α信号通路能参与并加重无机磷酸盐介导的VSMCs 成骨样分化和钙化。

3.2 HlF-1α 通过糖代谢途径参与血管钙化丙酮酸脱氢酶激酶4（pyruvate dehydrogenase kinase 4，PDK4）是维持丙酮酸氧化和体内葡萄糖平衡的关键酶，在调节丙酮酸脱氢酶复合物活性中发挥重要作用。在低氧状态下，HIF-1α可诱导PDK4 表达［27］，而PDK4 则可通过氧化应激、细胞凋亡等机制诱导血管钙化的发生发展［28］。研究表明，晚期糖基化终末产物（advanced glyco-sylation end-products，AGEs）以剂量依赖方式提高HIF-1α和PDK4 表达，上调HIF-1α调控基因VEGFA和GLUT-1 表达，而HIF-1α的稳定表达增加了PDK4 表达水平［27］。此外，AGEs 诱导的VSMCs 钙化过程降低了葡萄糖消耗，减少了乳酸产生，下调了葡萄糖代谢的关键酶和氧消耗率，说明AGEs 可通过HIF-1α/PDK4 途径促进血管钙化并抑制葡萄糖代谢。骨钙素（bone gla protein，BGP）是一种由成骨细胞产生的能量代谢调节激素，是葡萄糖代谢和矿化的重要调节因子，在钙化血管中普遍存在［29］。HIF-1α作为软骨细胞在体内生存的必要因素与BGP关系密切。IDELEVICH等［30］研究发现，在1，25（OH）2D3诱导的血管钙化大鼠模型中，BGP、HIF-1α、磷酸果糖激酶（phosphor fructo kinase，PFK）mRNA 在钙化的主动脉上表达上调，且在BGP诱导的钙化中，VSMCs上HIF-1α、PFK、GLUT1、Runx2及ALP 表达增加，而利用SiRNA 抑制HIF-1α稳定表达后可缓解BGP 诱导的VSMCs 钙化。表明BGP可通过增加HIF-1α依赖的糖代谢途径，即促进葡萄糖摄取，增加GLUT 和糖酵解酶表达，激活胰岛素信号通路，上调葡萄糖转运，将葡萄糖导入糖酵解途径，并刺激软骨和血管钙化。此外，研究发现［31］，缺氧状态上调了HIF-1α及其靶基因GLUT1和VEGFA 表达，诱导软骨标记物RUNX2、SOX9、ALP 上调，导致VSMCs 钙化。说明低氧通过HIF-1α依赖和线粒体来源的活性氧依赖方式诱导血管钙化。然而，HIF-1α参与糖代谢途径介导血管钙化及肾脏代谢尚需要进一步研究其机制，以明确HIF-1α在糖酵解过程中的角色。

3.3 HlF-1α 通过诱导炎症及氧化应激参与血管钙化慢性炎症是血管钙化的一个重要诱导因素，炎症及炎症因子可直接或间接参与血管钙化的发生发展［32］，例如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）等炎症细胞激活及炎症因子释放可诱导氧化级联反应，通过诱导VSMCs 成骨样转分化导致血管钙化。AGHARAZII 等［33］研究发现，CKD 模型大鼠在发生血管钙化过程中，VSMCs 成骨样转分化伴随BMP-2 和BGP 表达上调，同时，炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达也上调。研究发现，冠状动脉钙化与血清IL-18 水平呈正相关。IL-18 通过激活TRPM7 通路，促进β-甘油磷酸诱导的VSMCs 成骨样转分化，最终导致血管钙化［34］。表明IL-18可能在促炎性疾病中诱导血管钙化发生。ROS 能够上调成骨表型转录因子表达，促进VSMCs 成骨样转分化，是诱导血管钙化的独立危险因素，可通过氧化应激诱导血管钙化。研究表明［35］，患有糖尿病的CKD 患者氧化应激和成骨细胞分化相关标志物增加，会发生更严重的血管钙化，而抗氧化疗法可预防VC进展。研究发现，HIF-1α可作用于内皮细胞、血管平滑肌细胞和巨噬细胞，上调诱导型NOS（inducible NOS，iNOS）、VEGF、ROS和血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF），激活核转录因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路，进而使TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-2、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等细胞因子表达增加，诱导炎症反应，最终促进VSMCs 成骨样转分化，导致血管钙化，而这些炎症相关因子又可上调HIF-1α表达，表明炎症与氧化应激协同作用共同参与血管钙化过程，而HIF-1α通过调控炎症反应、氧化应激途径参与血管钙化形成，使炎症、氧化应激、HIF-1α形成相互促进的复杂网络，最终形成“炎症-钙化”的恶性循环［36-37］。

3.4 HlF-1α 通过诱导细胞凋亡和细胞自噬参与血管钙化血管平滑肌细胞凋亡是血管钙化启动的关键过程之一，发生于血管钙化开始前，产生的凋亡小体被认为是血管钙化的始动因素，在CKD高磷环境的刺激下可诱导局部钙磷酸盐富集，为钙晶体的形成提供合适的微环境，从而启动血管钙化［38］。因此，控制细胞凋亡可直接影响血管钙化的发生发展。细胞自噬是一种细胞降解的生物学过程，是诱导细胞主动死亡的一种细胞死亡程序，增加血管内自噬水平能够减少细胞外基质囊泡的分泌，拮抗VSMCs 钙化［39］。研究表明［40］，AGEs通过HIF-1α/PDK4 信号通路增加VSMCs 自噬，增加的自噬在AGEs 诱导的血管钙化中发挥保护血管作用。因此，细胞凋亡、细胞自噬与血管钙化的发生发展密切相关。研究发现，HIF-1α 诱导细胞自噬［41-42］，并通过介导线粒体途径及死亡受体（death receptor，DR）途径介导缺氧诱导的GC-2细胞凋亡［43］。此外，EPO 可抑制内质网应激诱导的细胞凋亡，而HIF-1α可直接调控EPO，诱导肾脏内源型基因表达，进而抑制血管钙化［44］。虽然细胞自噬与细胞凋亡已被证实在血管钙化中发挥重要作用，但是相关信号通路及体内外实验研究较少，希望更深入的研究阐释细胞自噬和细胞凋亡在血管钙化中的作用机制。而HIF-1α通过细胞凋亡和细胞自噬途径在血管钙化中发挥重要作用也需要更深入的研究阐明其机制。

综上所述，HIF-1α通过促进VSMCs 成骨样分化、糖代谢途径、诱导炎症及氧化应激、诱导细胞凋亡和细胞自噬等途径参与血管钙化，通过促进多种细胞因子释放和信号通路激活，使促钙化因子和抑制钙化因子失去平衡，最终导致VSMCs 成骨样转分化，促进血管钙化的发生。

4 CKD血管钙化的防治

CKD 患者血管钙化是一个不可逆的快速进展过程。2017 年改善全球肾脏病预后组织（kidney disease：improving global outcomes，KDIGO）关于CKD 矿物质与骨异常新版指南指出：维持性血液透析G3a-G5D 期患者一旦合并血管或瓣膜钙化，应将其心血管风险升至最高级别［45］。由于血管钙化一旦发生难以治疗，CKD 血管钙化的重点在于早期防治，不仅要控制好高血压、高血糖、高血脂、营养不良等传统影响因素，也要控制高磷血症、避免高钙血症及控制甲状旁腺功能等非传统影响因素；维生素K、镁及焦磷酸盐等也成为防治CKD 血管钙化新型治疗靶点［46］。此外，有研究发现［47］，雌激素能通过调节HIF-1α 影响BMP-2 及其下游p-Smad1/5/8 蛋白水平，抑制VSMCs 钙化，在血管钙化中发挥重要作用，可能成为新的治疗靶点。

近年研究表明，通过中药保留灌肠等多种途径抑制相关细胞因子和相关通路表达，在防治血管钙化中发挥作用［48］。刘海林［49］通过体内实验发现葛根素可能通过抑制NLRP3/Caspasc1/IL-1β、NF-κB和ROS相关通路介导的炎症反应，进而有效抑制CKD 大鼠血管钙化。钟建等［50］基于“脾肾衰败、浊毒内蕴”的基本病机，对温阳通络泄浊方进行临床研究，结果显示，此方可能通过调控Klotho/FGF-23 轴，改善血脂代谢，降低炎症因子表达，缓解钙磷代谢紊乱，从而缓解维持性血液透析患者血管钙化。王岚等［51］认为肾精亏虚、脉络瘀阻是导致CKD-MBD 与血管钙化的主要病机，运用益气补肾、祛瘀化浊法可通过调节Klotho 及其下游FGF-23表达，改善CKD钙磷及骨代谢紊乱，缓解血管钙化。宋立群［52］在培补脾肾，调和阴阳，祛瘀泄浊，通利血脉的基础上自拟祛瘀化浊方，在调节矿物质代谢紊乱和PTH 异常升高方面发挥作用，能够缓解CKD 患者血管钙化，减少患者心血管并发症。补肾活血方［53］通过调节骨保护素（osteoprotegerin，OPG）和NF-κB 受 体 激 动 剂 配 体（receptor activator of the nuclear factorkappa b ligand，RANKL）的mRNA 表达，上调a-SMA蛋白表达，下调ALP，还能减少VSMCs 的碱性磷酸酶活性和钙沉积，从而抑制VSMCs 成骨表型转变。何锡坤等［54］观察化瘀益肾方灌肠联合腹膜透析疗法对CKD3-4 期患者血管钙化的作用，结果显示，联合疗法能够有效减轻血清ICAM-1、VCAM-1、NF-κB、TNF-α等炎性指标表达，减轻炎性反应，延缓血管钙化。目前CKD 血管钙化多以对症治疗为主，而中医药对血管钙化防治的临床与实验研究已逐渐显示出其独特优势。中药单体、中药复方及中药单体提取物可通过调控细胞因子和信号通路稳定钙磷代谢水平、控制炎症反应以及氧化应激，进而延缓血管钙化进程；此外，中药通过多途径给药如口服汤剂、中药灌肠、结肠透析、静脉滴注等干预措施在控制血管钙化进展中发挥了优势［55］。因此寻找中西医结合防治CKD患者血管钙化的有效手段有重要意义，而内外治法联合应用将成为中医药防治CKD 血管钙化的重点，同时深入的基础研究成果也将为临床应用提供基础。

5 总结与展望

HIF-1α作为调节机体氧稳态的关键核转录因子，生物学功能复杂，不仅受多种细胞因子调节，还能直接调控靶基因的转录激活，并且与多种信号通路相互作用，通过多种途径直接或间接参与CKD血管钙化的发生发展，可能成为CKD血管钙化的独立危险因素、潜在生物标志物以及新型防治靶点。然而，虽然众多证据表明HIF-1α通过多种途径参与血管钙化的形成与进展过程，但是其具体机制仍需要进一步探究。VSMCs 成骨样转分化过程中，有多种细胞因子和信号通路参与，HIF-1α与各种细胞因子的复杂机制尚不明确，与其他信号通路的相互关系尚不清楚。在CKD 早期，HIF-1α激活能改善肾功能和肾脏代谢，说明HIF-1α适当表达对于CKD 患者肾功能和肾脏代谢有一定改善作用。因此，HIF-1α 参与糖代谢途径诱导血管钙化以及肾脏代谢需要进一步的研究以阐释其机制，以明确HIF-1α 在糖酵解过程中的作用；HIF-1α通过诱导细胞凋亡及细胞自噬介导血管钙化过程中的具体机制尚不明确，需要更深入的研究；此外，细胞凋亡和细胞自噬之间的相互关系以及在血管钙化中的作用有待进一步研究。近年来研究发现，基因重塑以及miRNA 调控在血管钙化中发挥重要作用，但是HIF-1α在其中的作用鲜有研究。对于血管钙化的防治，中医药凭借多途径、多靶点、多通路在预防CKD 血管钙化过程中发挥作用，但是目前中医药对于CKD 血管钙化的研究方式和研究对象较单一，需要多中心、大样本、随机对照实验来深层次阐明其复杂机制。近年来，中药复方、中药单体通过抑制HIF-1α表达抑制炎症反应、氧化应激、细胞自噬等发挥重要作用，但是中医药通过调控HIF-1α途径防治血管钙化的研究较少。因此，科学规范地多角度探讨HIF-1α在CKD血管钙化中的作用机制，将为CKD血管钙化的防治提供新思路、新靶点。