基于肠道菌群和代谢组学构建溃疡性结肠炎伴艰难梭菌感染的诊断模型

王 卓，万 健，张玉洁，贺文芳，吴开春

(1国家消化系统疾病临床医学研究中心，消化系肿瘤整合防治全国重点实验室，空军军医大学西京消化病医院，陕西 西安 710032；2西安医学院基础医学部组织学与胚胎学教研室，陕西 西安 710021)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)作为慢性肠道炎症性疾病，是炎症性肠病的一种，其主要临床表现为腹痛、腹泻和便血[1]。在我国，随着社会的发展、西方化饮食的普及和生活环境的改变，UC发病率逐年提高[2-3]。然而，UC确切发病机制仍不清楚，越来越多的证据表明UC的发病和进展与肠道微生物及其代谢物(如短链脂肪酸等)的改变存在密切联系[4-6]。另有研究表明，UC患者肠道微生态的紊乱，使患者更容易受到多种细菌感染[如艰难梭菌(Clostridioidesdifficile，CD)等][7]。

CD是临床常见的机会致病菌，CD感染目前已经成为一个全球范围内严重的医学和流行病学问题[8]。近年来研究发现，CD感染是UC患者最常见的感染性并发症。目前对于UC患者CD感染的诊断，主要依赖于实验室检查，包括产毒性CD菌株的培养，CD毒素检测以及毒素基因的核酸检测[9]。然而，产毒性和非产毒性CD均可在UC患者肠道定植，通过临床症状无法准确判断患者是否存在CD感染。目前的实验室检查无法对CD感染患者和定植患者做明确区分，且很少有研究对两者做区分[10]。本研究基于UC患者合并或/和未合并CD感染患者粪便的差异菌和代谢物，建立UC存在CD感染的协助诊断模型，以期帮助临床医生快速准确地发现存在CD感染的UC患者，从而精准制定治疗策略。

1 对象与方法

1.1 对象

对2018—2019年在空军军医大学西京医院就诊的58例UC患者进行回顾性研究，其中UC未合并CD感染的患者(UCN组)29例，UC合并CD感染的患者(UCP组)29例。所有参与者均已签署知情同意，该研究经中国临床试验注册中心伦理委员会(ChiECRT20190106)批准。纳入标准：①根据病史和临床症状，结合实验室检查、内镜和组织学检查确诊的UC患者；②CD感染的诊断标准符合《艰难梭菌感染诊断》指南[11]；③近3个月未使用抗生素。排除标准：①处于妊娠或哺乳期的女性；②同时诊断为其他感染性疾病、胃肠道穿孔或严重的心脏和肝脏疾病。

1.2 数据收集

由接受过统一培训的人员收集人口学特征(如年龄、性别)和身体质量指数、UC严重程度、近期用药情况；采集患者外周血，使用全自动血生化仪器检测白细胞、血红蛋白、血沉、C-反应蛋白、血小板、D-二聚体、尿素氮和肌酐8项生化指标；采集患者粪便，随后采用16S rRNA检测微生物菌种，用气相色谱-飞行时间谱的非靶标代谢组质谱法检测粪便代谢产物，课题组前期分析出两组间存在5种差异菌属和16种差异代谢物，记录差异菌属和代谢物相对丰度。16种差异代谢物分别是十六烷、腐胺、2，4-羟基丁酸、乳酸、氨基丙氨酸、3-羟基正赖氨酸2、4-羟基苯甲酸、3-苯基乳酸、来苏糖1、麦芽糖、槐糖2、甘露糖、尿苷2、2-脱氧尿苷、5-氢化可的松1和松柏醇。5种差异菌属包括Aggregatibacter、ClostridiumⅪ、Clostridiumsensustricto、Citrobacter和ClostridiumⅪⅤb。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 两组患者临床一般资料比较

UCP组C-反应蛋白升高者(C-反应蛋白>6 mg/L的研究对象)占比高于UCN组，差异存在统计学意义(P<0.05)；两组患者身体质量指数差异无显著性[(19.64±3.45)kg/m2vs(21.49±4.17)kg/m2，χ2=1.840，P=0.071]；其余指标组间差异无显著性(表1)。

表1 两组患者一般资料比较 [n=29，n(%)]

2.2 UC患者存在CD感染的单因素和多因素分析

前期研究筛选的差异代谢物和菌属合计21种，单因素logistic回归分析发现，在差异菌属中ClostridiumⅪ在2组之间有统计学差异。在代谢物方面，十六烷、乳酸、松柏醇、3-苯基乳酸存在显著差异(P<0.05)，而其他微生物和代谢物，两组间差异无统计学意义(P>0.05，表2)。以UC是否存在CD感染为因变量，将单因素分析中P<0.05的变量设为自变量纳入多因素logistic回归分析。结果显示，十六烷低含量、乳酸和ClostridiumⅪ菌高含量是UC患者存在CD感染的独立风险因素。将三者分别作为协变量X1(十六烷)、X2(乳酸)、X3(ClostridiumⅪ)，得出的模型表达式为：logit(P)=0.724-0.980×X1+1.512×X2+1.298×X3(表2)。

表2 UC患者存在CD感染的单因素和多因素logistic回归分析

2.3 UC患者存在CD感染诊断模型的评估

根据本研究建立的诊断模型绘制ROC曲线(图1)，曲线下面积(area under the curve，AUC)为0.873(95%CI：0.782～0.964)，提示该预测模型的区分能力较好；最佳临界值(0.655)时该模型的诊断阈值为0.411，此处敏感度为79.3%，特异度为86.2%，该模型使用Hosmer-Lemeshow拟合优度检验评估拟合效果，结果显示χ2=5.381，P=0.716，提示该预测模型校准度较好。

ROC：受试者工作特征。

3 讨论

近年来研究发现CD的感染能够诱发和加重UC。感染CD的UC患者药物治疗和医疗费用、紧急结肠切除术比率、住院时间、死亡率均明显增加[12]。因此，UC患者CD感染的准确判断对患者短期和长期预后的评估具有重要的临床价值，然而CD感染与定植的区分，一直没有很明确的界限，本研究应用logistic回归模型和ROC曲线建立UC患者存在CD感染的诊断模型，诊断模型ROC的AUC为0.873，灵敏度为79.3%，特异度为86.2%，提示模型区分度好。拟合优度检验χ2=5.381，P=0.716，提示模型准确性好，说明基于十六烷、乳酸和ClostridiumⅪ 3项指标构建的诊断模型对UC患者CD感染有较高的临床诊断价值，能够协助实验室检查正确诊断CD感染。

既往研究认为UC患者肠道微生物的紊乱，与CD定植和感染的机会增加有关[12-14]。同时，肠道微生物的改变与疾病状态相关[15]。已有的研究表明CD所属的ClostridiumⅪ菌属在健康人体中是普遍存在[16-17]，其中包含多种条件致病菌，如CD、索氏梭菌。该菌属也被认为是一种能够促进炎症和诱导结肠炎的细菌属[18]，是肠道有害细菌群之一。ClostridiumⅪ数目的增多与人类肠道炎症的加重相关[19]，也与小鼠肝癌发生进展存在一定联系[20]。在多种疾病的患者粪便中该菌属的数量增加[20-21]。因此，UC患者中该菌属数量的增高对UC患者存在CD感染的准确判断起到积极的提示作用。

除了肠道微生物外，微生物代谢物的改变在一定程度上也能够反映患者的疾病状态。既往研究发现肠道微生物的改变能够引起代谢物的改变[22]。本研究发现在UC合并CD感染的患者粪便代谢物中十六烷降低和乳酸升高，同时多因素分析发现十六烷和乳酸的含量高低也是UC患者CD感染的独立影响因素。

十六烷是一种碳氢化合物，烷烃类有机物。既往研究发现，在啮齿动物体内十六烷可以诱导关节炎、慢性腹膜炎和自身抗体的产生[23]，并作为佐剂诱导动物自身免疫，同时增强动物的特异性和非特异性免疫反应[24-25]。这些结果说明，十六烷可能在肠道炎性疾病的发病机制中起到一定的免疫作用，但其含量降低与UC患者CD感染之间相互联系的具体机制还有待进一步探索。

本研究诊断模型中还包含一种有机酸——乳酸。乳酸作为一种信号分子，参与葡萄糖代谢、脂肪酸合成、氧化还原稳态和蛋白质的翻译后修饰，调节人体生理状态[26]。此外，乳酸也能够参与炎症损伤，增强巨噬细胞分泌IL-6，基质金属蛋白酶1和IL-1β，增强NF-κB活性[26-27]。既往研究发现乳酸是慢性炎症组织中的信号分子，其在炎症部位的累积，可抑制T细胞的迁移，将T细胞保留在炎症部位，通过增加炎性细胞因子的产生和减少细胞溶解来延长慢性炎症，促进慢性炎症的进展[28-29]。另外，乳酸通过激活IL-23依赖性和非依赖性途径，影响肿瘤微环境，进而促进慢性炎症[30]。乳酸与RAF-ERK信号通路的激活存在一定的联系，调控炎症和血管生成[31]。乳酸的升高可能会导致机体整体或局部的炎症状态加重。课题组前期研究发现乳酸的含量与Haemophilus菌属含量有强的正相关[32]，说明乳酸的升高与该菌属中致病菌增多有关。考虑到肠道微生物与代谢物之间的联系，乳酸的改变可能与病原微生物的升高和有益菌的降低有关。乳酸在肠道堆积能够诱导慢性肠道疾病炎症加重，加重肠道微生物紊乱，从而给致病菌提供了适宜的生存条件，进一步导致或加重CD感染。本研究初次使用差异微生物和代谢物协助诊断存在CD的感染UC患者，发现差异微生物和代谢物对疾病的协助诊断潜能。

综上所述，十六烷、乳酸和ClostridiumⅪ相对含量与UC患者是否存在CD感染密切相关，使用3项指标建立UC患者CD感染的诊断模型，有良好的预测效果，为正确判断UC患者存在CD感染提供了新思路。但本研究具有样本量较少的局限性，有待未来更大样本研究加以补充和完善。该研究给予临床医师一定的启发，对于存在CD感染的UC患者在正确诊断的基础上，给予药物治疗的同时，调整肠道微生物和代谢物的种类和含量可能会有助于加快UC患者CD感染的治愈和UC的缓解。