经皮穴位电刺激对去势后大鼠血清骨代谢平衡的影响

郑小花 徐颖 林超琴 胡德婷 郑启斌

1.福建省妇幼保健院 福建医科大学妇儿临床医学院,福建 福州 350001

2.中国人民解放军联勤保障部队第九○○医院仓山院区妇产科,福建 福州 350025

3.福建医科大学附属第一医院神经外科,福建 福州 350001

4.福建医科大学附属第一医院滨海院区国家区域医疗中心神经外科,福建 福州 350212

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是原发性骨质疏松症(osteoporosis,OP)中最常见的一种类型,常发生于女性绝经后 5～10 年内[1]。目前我国OP患病人数约为9 000万,女性约7 000万[2]。2023年国家统计局发布2022年末我国60岁及以上人口占19.8%,65岁及以上占14.9%[3]。人口的老龄化使PMOP在女性中的患病率快速攀升。PMOP最严重的后果是骨质疏松性骨折,更年期的女性发生较严重的骨折后的剩余寿命较发生乳腺癌后的剩余寿命要短[4]。高发病率及其并发症的高致残率、高致死率等问题使PMOP成为我国医疗卫生面临的重大挑战,亟需有效的PMOP防治措施[5]。电刺激作为一种传统安全且经济有效的康复治疗手段在OP的应用较多,经皮穴位电刺激(transcutaneous electrical acupoint stimulation,TEAS)治疗可缓解疼痛、增强肌力、促进神经修复,改善肢体功能[6]。TEAS 是以经络穴位理论为指导,并结合经皮神经电刺激的一种物理疗法[7],其将电极片贴在目标穴位对应的皮肤,设定所需要的频率、脉宽等参数电流输入人体,刺激人体的穴位和周围神经或经络以达到治疗OP等疾病的目的,较传统针灸更无创及可控性。本实验通过观察TEAS对去卵巢骨质疏松模型大鼠血清骨代谢指标及骨密度的影响,探讨不同频率TEAS在调节骨平衡方面的疗效,为其防治PMOP的机理提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物:32只清洁级Sprague-Dawley(SD)雌性健康大鼠,5月龄,体重为320～388 g,购于中国斯贝福(北京)生物技术有限公司[许可证号:SCXK(京)2019-0010],动物饲养于联勤保障部队第九○○医院基础医学实验室实验动物中心,并由实验动物中心提供专用饲料饲养,通风良好的洁净层流环境(SPF级环境),室温18 ℃～25 ℃,模拟昼夜各12 h的光照,相对湿度(50±5)%,每周更换2次垫。自由摄食和饮洁净水,所有进入实验室的物品均严格高温消毒或紫外线消毒处理。本实验依照实验动物管理委员会指导方案进行实验及管理,已得到福建省妇幼保健院动物实验伦理委员会的批准(伦理号:2021KLD667)。

1.1.2主要仪器与试剂:LGT-231手持神经肌肉电刺激仪(广州龙之杰科技有限公司),双能X线骨密度仪(美国HOLOGIC DISCOVERY W型);上海西唐生物科技有限公司ELISA检测试剂盒:骨特异性碱性磷酸酶(BALP)、Ⅰ型原胶原C端前肽(PICP)、Ⅰ型原胶原N端前肽(PINP)、Ⅰ型胶原羧基端肽(ICTP)、吡啶啉(Pyr)、脱氧吡啶啉(D-Pyr)。

1.2 实验方法

1.2.1分组与造模:SD大鼠适应性生长1周后采取随机编号,分为假手术组(Sham组)、OVX 组(模型对照组)、2 Hz组(0VX+TEAS 2 Hz组)、50 Hz组(0VX+TEAS 50 Hz组)。后3组均进行卵巢去势骨质疏松模型的建立:采用国内外公认的雌性大鼠PMOP模型[8]。术前注射10%水合氯醛溶液麻醉(0.2 mL/100 g体质量),无菌操作下摘除大鼠双侧卵巢,Sham组则只切除卵巢附近等体积的脂肪,术后缝皮封口,每日观察大鼠皮肤伤口情况,碘伏消毒伤口,根据伤口情况腹腔注射青霉素G 5万～10万单位,1 次/d,连续 3 d,防止术后感染。

1.2.2干预方法:造模后1个月2 Hz 组、50 Hz 组大鼠背部进行消毒,剃毛、脱毛,暴露出需要贴电极片的皮肤,根据大鼠穴位图谱,在大鼠背部“命门穴”(双侧)、“环跳穴”(双侧)相应的部位粘上电极片(电极片定期更换),LGT-231手持神经肌肉电刺激仪,调整相应频率,电流强度设置为大鼠局部肌肉轻度收缩为度,4～10 mA,治疗时间为 30 min,每日1次,每周治疗 5 d休息2 d,连同休息日,共12周。Sham组、OVX组不予TEAS治疗及其他干预,同实验组一同饲养、管理。

1.2.3指标检测:3个月后左心室采血并处死各组大鼠,全血室温放置30 min后离心10 min,取上层血清于无菌冻存管中,行ELISA测定,按照各定量测定试剂盒操作规程进行,所有样品同批次测定,以避免批间误差。分离出腰椎和右侧股骨,剥除附着的软组织,用经生理盐水浸透的医用纱布包裹右侧股骨和椎骨,放置于-80 ℃冰箱中保存待用。检测时将解冻后的骨样本整齐地摆放在检测床上开始检测,用双能X线骨密度仪对大鼠第4～6腰椎及右股骨颈Ward’s三角区BMD进行测量。选择大鼠骨密度高分辨模式,行间距0.070 0 cm,点分辨率0.062 2 cm,6.10×0.10 Coll,140/100kVp。结果用g/cm2表示。

1.3 统计学方法

采用 SPSS 20.0 软件进行统计分析,组间比较采用单因素方差分析进行方差齐性检验,正态分布且方差齐者采用LSD检验,方差不齐者采用Games-Howell检验,非正态分布数据采用非参数检验(秩和检验),结果均以均值±标准差表示,检验水准 ɑ=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠骨形成标志物

OVX组较Sham组血清BALP、PICP、PINP均显著增高(P<0.05),TEAS 2 Hz组较OVX组血清BALP、PICP、PINP均显著降低(P<0.05),且与Sham组无差别;50 Hz组较OVX组相比无显著变化,与Sham组相比血清BALP、PINP升高,PICP与Sham组无差别(P=0.336)。2 Hz组较50 Hz组相比差异均无统计学意义,见表1。

表1 各组大鼠血清骨形成标志物比较

2.2 各组大鼠骨吸收标志物

OVX组较Sham组血清ICTP、Pyr、D-Pyr均显著增高(P<0.05),TEAS 2 Hz组、50 Hz组较OVX组血清ICTP、Pyr、D-Pyr均显著降低(P<0.05),TEAS 50 Hz组较Sham组血清ICTP、Pyr、D-Pyr无明显区别(P>0.05),2 Hz较50 Hz组差异无统计学意义(P均>0.05),见表2。

表2 各组大鼠血清骨吸收标志物比较

2.3 腰椎及右股骨骨密度的影响

OVX组较Sham组腰椎及右股骨骨密度均显著降低(P<0.05 ),TEAS 2 Hz组较OVX组腰椎及股骨骨密度均显著增高(P<0.05),且腰椎骨密度较Sham组无差异;TEAS 50 Hz组较Sham组显著降低(P<0.05 ),较OVX组骨密度无区别,2 Hz腰椎骨密度较50 Hz组高(P=0.048),但股骨骨密度均无区别,见表3。

表3 各组大鼠腰椎及右股骨骨密度比较

3 讨论

PMOP是由于女性绝经后雌激素缺乏,进而引起骨代谢紊乱,导致骨量丢失、BMD下降及骨微结构破坏、骨折风险增加的全身代谢性骨病。骨组织通过骨重塑的过程不断发生变化[9]。PMOP是一种高转换代谢型骨病,骨吸收率大于骨形成率,从而导致骨丢失。细胞因子、骨吸收标志物、骨形成标志物、基因、受体等决定骨代谢的内环境和代谢调节过程,而且也是决定骨质量、骨强度的重要因素[10]。骨形成标志物反映成骨细胞活性及骨吸收水平,骨吸收标志物反映破骨细胞活性及骨形成状态。推荐敏感性较高的骨形成标志物包括BALP、PICP、PINP等,以及骨吸收标志物主要包括ICTP、Pyr、D-Pyr等[11]。既往临床及实验研究证实TEAS在OP中治疗有效,本实验通过骨形成及骨吸收标志物探讨TEAS在骨转换生化标志物中的作用,以期探讨其抗OP机制。

BALP是成骨细胞的一种细胞外酶,其主要作用是在成骨过程中水解磷酸酶,为羟基磷灰石的沉积提供磷酸,同时水解焦磷酸盐,有利于成骨[11]。高转换型骨质疏松、骨折患者中,血清BALP明显升高。本实验中,与Sham组相比,OVX组术后3个月BALP显著升高,体现了OVX造模术后呈高转换代谢型OP模型。TEAS 2 Hz干预后较OVX组相比降低,50 Hz无明显变化,说明2 Hz TEAS可能参与BALP的调节促进骨形成。血清Ⅰ型前胶原水解,去除其羧基及氨基端的附加肽段,生成原胶原,前胶原去除下来的羧基端附加肽段称PICP,氨基端附加肽段称PINP。PICP、PINP由成骨细胞合成,其在血清中的含量反映成骨细胞合成骨胶原的能力,即Ⅰ型胶原的合成速率,是新骨形成的特异性的敏感指标[12]。TEAS 2 Hz组PINP、PICP较OVX组降低,体现了TEAS可能通过促进PICP、PINP从而促进Ⅰ型胶原的合成,干预OP的过程。

本研究结果显示,OVX大鼠 ALP、PINP、PICP等较Sham组升高,提示模型组大鼠骨代谢处于高转换状态,成骨细胞代谢活跃所致。经电刺激干预后,TEAS 2 Hz组较OVX组血清BALP、PICP、PINP均显著降低(P<0.05),且与Sham组无差别,提示其参与骨形成过程,且促进新骨的形成疗效显著,可能通过骨形成途径。结论与其他学者一致,如王巧灵[13]予补肾壮骨汤联合针灸对骨质疏松患者进行治疗,ALP、PINP均低于对照组。Wiesmann等[14]研究显示,电刺激能明显调节成骨细胞的增殖及分化,进而影响骨代谢和重建,达到抑制骨吸收,促进骨形成和逆转骨质疏松的作用。50 Hz组血清骨形成标志物与OVX组相比无显著变化,但血清BALP、PINP与Sham组相比,差异有统计学意义,且50 Hz TEAS干预后与OVX组相比腰椎、股骨骨密度均未增加,提示其可能未参与骨形成过程。

ICTP是Ⅰ型胶原在骨吸收过程中的降解产物之一,是骨吸收的特异及敏感的生化指标,同时不受饮食和肾滤过率的影响,是反映破骨细胞胶原降解的重要指标[15]。Pyr和D-Pyr是骨Ⅰ型胶原的特异组分,在骨胶原合成胶原纤维时,骨溶解时在羟赖氨酰氧化酶的作用下,由骨胶原分子蛋白水解释放出来,进入血循环,排入尿中[16]。Pyr和D-Pyr几乎仅存在于骨骼和牙组织中,在血液和尿中以游离和肽结合形态存在。以上3种骨吸收标志物能够及时直观地反映骨溶解程度和敏感反应骨丢失范围。本实验中OVX组术后ICTP、Pyr、D-Pyr均高于Sham组,说明OVX术后破骨细胞的骨吸收活性增强,骨丢失增加,但经TEAS治疗后两组骨吸收指标均较OVX组降低,且与Sham组无区别,TEAS可能通过调节骨吸收标志物干预骨代谢平衡,增加腰椎、股骨骨密度以达到抗PMOP的作用。

2020年发布的《中医药防治原发性骨质疏松症专家共识》中明确指出针刺、穴位贴敷法可有效缓解骨质疏松性疼痛[17]。电针是应用中医理论,用针刺入腧穴得气后,在针上连接人体生物电的微量电流波以加强持续刺激穴位,从而达到治疗疾病的一种疗法。TEAS 兼具针刺及低频电刺激的疗效,通过刺激肌纤维的收缩带动骨骼肌的运动,提高肌肉的质量,维持对骨的应力刺激,促进骨重建[18]。TEAS能避免患者对传统针刺疼痛的顾虑,依从性好。时克昌等[19]的临床研究证实,TEAS可改善骨质疏松症状,但其未阐述相关作用机制。本实验TEAS组ALP、PINP、PICP等较OVX组低,同时ICTP、Pyr、D-Pyr降低,提示可能通过骨代谢平衡参与其调节OP。

低频电的参数包括频率、周期、波宽、通断比、波形等,临床仪器中很多参数相对固定,对生物效应影响较大的是频率及强度[20],陈善堂等[21]指出固定频率(15 Hz)脉冲电磁场在1.10～4.10 mT的强度下对小鼠MC3T3-E1细胞的增殖能力无明显影响,因此对频率的可调节性及争议也较大。低频电流式指频率1 000 Hz以下的脉冲电流,每次通电能使运动神经发生兴奋,超过1 000 Hz则不能引起兴奋。临床常用的低频电是在100 Hz以下。有学者将电极连接到100 MHz任意波形发生器以各种频率(1、2.5、5、10、15、20、30、40、50、60和100 Hz)行电刺激,探讨动态骨骼肌电刺激在刺激肌肉收缩、诱导骨骼髓内压变化的最佳频率。发现在20、50 Hz肌肉电刺激时股骨骨小梁质量改善更明显[22]。但Swift等[23]对脊髓损伤患者股四头肌、腘绳肌和臀肌进行连续性刺激电刺激(50 Hz),结果发现腰椎和股骨颈区域的BMD均无变化。本实验中选择TEAS频率为2 Hz及50 Hz,是文献报道比较常见的两种频率,以此作为低频率及中高频的代表,结果证实这两种频率均有参与血清骨代谢的调节,2 Hz的TEAS均可降低骨形成标志物BALP、PINP、PICP及骨吸收标志物ICTP、Pyr、D-Pyr,50 Hz仅降低骨吸收标志物,表明2 Hz TEAS参与骨吸收及骨形成过程,且干预后腰椎及股骨BMD均升高,50 Hz TEAS只参与骨吸收过程,且50 Hz干预的大鼠的骨密度并未升高,考虑2 Hz频率的TEAS可能更有利于临床抗OP的治疗。

在电针治疗中,多数文献报道的频率低于10 Hz,结论均提示抗OP效果显著。如柏中喜等[24]以电脉冲频率2 Hz(120 r/min),强度为1 mA行经皮穴位电刺激,发现增加绝经后骨质疏松症大鼠模型的骨密度及生物力学。经皮电刺激的治疗模式中针灸样刺激频率是1～4 Hz,脉冲宽度是0.2～0.3 ms,出现脉冲式肌肉抽搐,适用于急慢性疼痛、长期止痛及周围循环障碍。绝经后肌肉骨关节症状常见肩、颈腰背部肌肉和肌腱疼痛,肩、膝、腰骶关节和手指关节等部位的疼痛,常伴有骨关节炎[25]。因此2 Hz频率的TEAS可能较50 Hz频率更适合缓解PMOP引起的急慢性骨关节肌肉疼痛症状。

综上所述,本研究采用TEAS干预PMOP大鼠模型,结果提示2 Hz TEAS参与骨吸收及骨形成过程,且干预后腰椎及股骨BMD均升高,50 Hz TEAS只参与骨吸收过程,且50 Hz干预的大鼠的BMD并未升高,考虑TEAS改善 PMOP 可能与其参与血清骨转化标志物调节骨平衡代谢有关,且2 Hz频率的TEAS可能更有利于临床抗OP的治疗。本实验初步探讨了TEAS改善PMOP及方案,为TEAS防治PMOP的临床应用提供了理论依据。