甘草联合顺铂对H22 荷瘤小鼠肿瘤抑制作用及肾损伤保护作用

连小龙，张尚龙，邓 毅，2*，张 楠，叶礼巧，马趣环，3，杨志军

（1.甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730000； 2.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，甘肃 兰州 730000； 3.甘肃省医学科学研究院药物研究所，甘肃 兰州 730050）

顺铂作为临床常用抗肿瘤药物，广泛用于肝癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多种实体瘤的治疗［1］，因其具有的毒副作用，临床使用受到严重的剂量依赖性限制，表现最为明显的是肾毒性［2］。而肾损伤是顺铂肾毒性最常见和最严重的表现形式［3］，直接影响化疗患者的疗效和耐受性。故寻找化疗药的辅助药物成为癌症研究领域急需解决的热点问题。

传统中医药在辅助临床用药方面效果显著且逐步广泛应用。甘草为豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、胀果甘草GlycyrrhizainflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根和根茎［4］。现代药理学研究表明，甘草具有抗肿瘤、抑菌抗炎、抗病毒、调节免疫等作用。此外，据《本草正》 记载甘草“味至甘，得中和之性，有调补之功，故毒药得之解其毒，刚药得之和其性”，为解毒“圣药”。课题组前期研究表明，甘草能够缓解顺铂诱导的机体急性毒性［5］。但甘草与顺铂联合用药在抗肿瘤中的研究较少，故本研究通过建立H22荷瘤小鼠模型，探讨甘草对顺铂化疗的增效及其肾毒性的保护作用，以期为甘草和抗肿瘤药物的联合应用提供参考。

1 材料

1.1 动物 SPF 级雌雄各半的昆明种小鼠60 只，体质量（20±2） g，购自甘肃中医药大学实验动物中心，实验动物生产许可证号SCXK （甘） 2020-0001。小鼠饲养于甘肃中医药大学SPF 级实验动物中心，实验动物使用许可证号SYXK （甘） 2020-0009，饲养环境温度为23 ～25 ℃，相对湿度55% ～65%，自由饮水进食。实验经甘肃中医药大学实验动物伦理委员会审核通过（伦理号2019-049）。

1.2 细胞株 小鼠H22肝癌细胞购自于武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.3 试剂与药物 甘草采自甘肃省酒泉市，经甘肃中医药大学药学院中药教研室马晓辉鉴定为正品； 顺铂（批号1A0115B03），购自齐鲁制药有限公司。一抗B 细胞淋巴瘤2 （Bcl-2，批号C82721042103）、B 细胞淋巴瘤2 相关X 蛋白（Bax，批号12616090906）、二抗辣根过氧化酶标记的山羊抗兔抗体（HRP-IgG，批号CR2207031） 购自武汉赛维尔生物科技有限公司； 超氧化物歧化酶（SOD，批号20220505）、丙二醛（MDA，批号20220506） 试剂盒购自于南京建成生物工程研究所。

1.4 仪器 cobas-c-311 全自动生化分析仪（日本日立公司）； 3K15 台式高速冷冻离心机（美国Sigma 公司）； JBP5 包埋机（武汉俊杰电子有限公司）； RM2016 切片机（上海徕卡仪器有限公司）； E100 显微镜（日本Nikon 公司）； DZF-6210 真空干燥箱 （上海和呈仪器制造有限公司）。

2 方法

2.1 模型建立 取两次传代的H22肝癌细胞悬液，调整密度为1×106/mL，于小鼠右前肢腋窝下接种0.2 mL 细胞悬液，5 d 后可触及结节表示建模成功［6-7］。

2.2 分组与给药 将建模成功的荷瘤小鼠随机分为模型组、顺铂组（3 mg/kg） 和顺铂联合甘草低、中、高剂量组（3 mg/kg＋0.65、1.30、2.60 g/kg）。2020 年版《中国药典》 记载甘草的常用剂量为2～10 g，依据体表面积换算法得到甘草0.65、1.30、2.60 g/kg 相当于0.5 倍、1 倍、2倍临床用量（称取粉碎后的甘草粉末置于圆底烧瓶中，加入10 倍量70%乙醇热回流提取2 次，每次3 h，合并药液，浓缩，在60 ℃、-0.07 MPa 条件下真空干燥，备用）。除模型组外，其余各组小鼠灌胃给予相应药物，每天1 次，顺铂隔天腹腔注射1 次，连续给药12 d。隔天测量瘤体长直径和短直径，计算肿瘤体积，末次给药24 h 后，禁食不禁水，采血，剥离肿瘤组织和肾组织。

2.3 抑瘤率和肾脏指数 用生理盐水清洗各组小鼠肿瘤组织和肾脏表面血渍后，称定质量，分别计算抑瘤率和肾脏指数。公式为抑瘤率＝ ［（模型组平均瘤质量-给药组平均瘤质量） /模型组平均瘤质量］ ×100%，肾脏指数＝ （肾脏质量/体质量） ×100%。

2.4 血清BUN、Cr 水平检测 采集的血液静置2 h 后，4 ℃、3 000 r/min 离心10 min，收集血清，使用全自动生化分析仪检测尿素氮（BUN）、肌酐（Cr） 水平。

2.5 HE 染色 将剥离的肿瘤组织用4%多聚甲醛固定24 h后，脱水、石蜡包埋、切片，常规HE 染色，在光学显微镜下观察肿瘤和肾脏的病理形态变化。其中肾脏的病理形态变化通过肾小管损伤（如肾小管扩张、破坏和肾小管坏死等） 百分比来评估。评分标准［8-9］为0% （正常） 计0分； 1% ～10%计1 分； 11% ～25% 计2 分； 26% ～45% 计3分； 46% ～75%计4 分； 76% ～100%计5 分。

2.6 免疫组化法检测Bcl-2、Bax 蛋白表达 将各组小鼠石蜡包埋的肿瘤和肾组织脱蜡至水化，抗原修复，加入3%H2O2阻断内源性过氧化物，用3%BSA 溶液在室温下封闭30 min。加Bcl-2 （1 ∶500）、Bax （1 ∶400） 一抗4 ℃下孵育过夜。PBS 洗涤后，用辣根过氧化物酶（HRP） 标记的二抗在室温下孵育50 min，DAB 显色和苏木精复染，封片，于显微镜下观察，黄色或棕色沉积即为阳性表达。每张切片选取中央和四周共5 个区域，每个区域再随机选取5 个视野，用Image J 软件计算平均光密度值，分析Bcl-2、Bax蛋白表达。

2.7 肾组织SOD 活性和MDA 水平检测 严格按照相关试剂盒说明书操作，采用WST-1 法检测SOD 活性，TBA 法检测MDA 水平。

2.8 统计学分析 通过SPSS 21.0 软件进行处理，数据均以（±s） 表示，2 组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 顺铂联合甘草对肿瘤生长的影响 由表1 可知，与模型组比较，在第7 天后，顺铂组与顺铂联合甘草各剂量组小鼠肿瘤体积减小（P＜0.05，P＜0.01）； 与顺铂组比较，在第9 天后，顺铂联合甘草高剂量组小鼠肿瘤体积减小（P＜0.05，P＜0.01）。由表2 可知，与模型组比较，顺铂组和顺铂联合甘草各剂量组小鼠肿瘤质量降低（P＜0.01），并呈剂量依赖性。

表1 各组荷瘤小鼠肿瘤体积比较（±s，n＝12）

表1 各组荷瘤小鼠肿瘤体积比较（±s，n＝12）

注： 与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01； 与顺铂组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别肿瘤体积/mm3第1 天第3 天第5 天第7 天第9 天第11 天模型组111.31±36.52546.03±112.53862.17±215.311 239.59±350.511 622.78±318.542 086.48±322.34顺铂组115.63±34.12491.65±98.16776.00±171.50929.89±261.26* 1 098.43±177.35**1 235.12±275.71**顺铂联合甘草低剂量组119.96±24.95499.85±162.97760.31±275.03880.41±213.54* 1 093.35±225.31**1 194.83±372.36**顺铂联合甘草中剂量组117.75±24.82487.60±143.11739.93±129.93864.16±169.08**946.76±205.94**1 067.93±304.16**顺铂联合甘草高剂量组116.38±32.46475.64±95.22635.46±145.59*681.39±213.04**698.48±181.60**＃＃708.40±282.41**＃

表2 各组荷瘤小鼠肿瘤质量和抑制率比较（±s，n＝12）

表2 各组荷瘤小鼠肿瘤质量和抑制率比较（±s，n＝12）

注： 与模型组比较，**P＜0.01； 与顺铂组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别肿瘤质量/mg抑制率/%模型组2 625.32±576.71—顺铂组1 591.71±373.37**39.37顺铂联合甘草低剂量组1 462.96±367.14**44.27顺铂联合甘草中剂量组1 205.10±361.19**＃54.10顺铂联合甘草高剂量组1 007.14±213.28**＃＃61.64

3.2 顺铂联合甘草对肿瘤组织病理形态学的影响 由图1可知，模型组小鼠肿瘤组织细胞排列紧密且均匀，形态完整，周围无坏死肿瘤细胞； 顺铂组和顺铂联合甘草各剂量组小鼠肿瘤组织细胞间隙较大，可见大量坏死的肿瘤细胞，细胞核碎裂、消失。

图1 各组荷瘤小鼠肿瘤组织病理形态变化（HE，×400）

3.3 顺铂联合甘草对肿瘤组织Bcl-2、Bax 表达的影响 由图2～3、表3 可知，与模型组比较，顺铂组和顺铂联合甘草各剂量组小鼠肿瘤组织Bcl-2 蛋白表达降低（P＜0.05，P＜0.01），Bax 蛋白表达升高（P＜0.05，P＜0.01）； 与顺铂组比较，顺铂联合甘草高剂量组小鼠肿瘤组织Bcl-2 蛋白表达降低（P＜0.05），Bax 蛋白表达升高（P＜0.05）。

图3 各组荷瘤小鼠肿瘤组织Bax 表达（×400）

表3 各组荷瘤小鼠肿瘤组织Bcl-2、Bax 表达比较（±s，n＝12）

表3 各组荷瘤小鼠肿瘤组织Bcl-2、Bax 表达比较（±s，n＝12）

注： 与模型组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01； 与顺铂组比较，＃P＜0.05。

组别Bcl-2Bax模型组0.48±0.060.21±0.02顺铂组0.34±0.05*0.30±0.05*顺铂联合甘草低剂量组0.32±0.06**0.34±0.05**顺铂联合甘草中剂量组0.31±0.05**0.36±0.03**顺铂联合甘草高剂量组0.24±0.03**＃0.39±0.05**＃

3.4 顺铂联合甘草对肾脏指数和血清BUN、Cr 水平的影响 由表4 可知，与模型组比较，顺铂组小鼠肾脏指数和血清BUN、Cr 水平升高（P＜0.01）； 与顺铂组比较，顺铂联合甘草各剂量组小鼠肾脏指数和血清BUN、Cr 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表4 各组荷瘤小鼠肾脏指数和血清BUN、Cr 水平比较（±s，n＝12）

表4 各组荷瘤小鼠肾脏指数和血清BUN、Cr 水平比较（±s，n＝12）

注： 与模型组比较，**P＜0.01； 与顺铂组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别肾脏指数/%BUN/（mmol·L-1）Cr/（μmol·L-1）模型组1.09±0.349.52±1.5911.17±2.04顺铂组1.46±0.30**31.01±10.83**33.20±10.44**顺铂联合甘草低剂量组1.17±0.14＃＃24.43±8.86＃25.43±7.59＃＃顺铂联合甘草中剂量组1.04±0.09＃＃21.15±7.86＃＃21.55±6.36＃＃顺铂联合甘草高剂量组0.96±0.08＃＃13.89±4.90＃＃16.19±4.23＃＃

3.5 顺铂联合甘草对肾组织病理形态学的影响 由图4 可知，模型组肾小管结构清楚，未见上皮细胞水肿及变性；顺铂组肾小管结构不清，细胞明显浊肿，胞质疏松网状化，细胞排列紊乱，部分小管管腔可见坏死、脱落细胞，出现肾小管扩张及蛋白管型； 顺铂联合甘草各剂量组小鼠肾脏病变有所改善，仅观察到肾小管细胞轻度肿胀及空泡变性，管腔内有少量脱落的上皮细胞。与模型组比较，顺铂组小鼠肾损伤评分升高（P＜0.01）； 与顺铂组比较，顺铂联合甘草各剂量组小鼠肾损伤评分降低（P＜0.05，P＜0.01）。

图4 各组荷瘤小鼠肾组织病理形态变化（HE，×400，±s，n＝12）

3.6 顺铂联合甘草对肾组织SOD 活性、MDA 水平的影响 由表5 可知，与模型组比较，顺铂组小鼠肾组织SOD活性降低（P＜0.01），MDA 水平升高（P＜0.01）； 与顺铂组比较，顺铂联合甘草各剂量组小鼠肾组织SOD 活性升高（P＜0.01），MDA 水平降低（P＜0.01）。

表5 各组荷瘤小鼠肾组织中SOD 活性和MDA 水平比较（±s，n ＝12）

表5 各组荷瘤小鼠肾组织中SOD 活性和MDA 水平比较（±s，n ＝12）

注： 与模型组比较，**P＜0.01； 与顺铂组比较，＃＃P＜0.01。

组别SOD/（U·mg prot-1）MDA/（nmol·mg prot-1）模型组185.40±17.4414.74±2.01顺铂组116.58±27.64**20.85±2.69**顺铂联合甘草低剂量组172.42±30.01＃＃13.72±2.41＃＃顺铂联合甘草中剂量组189.19±18.53＃＃12.09±2.03＃＃顺铂联合甘草高剂量组196.32±25.92＃＃12.86±4.07＃＃

4 讨论

肝癌因已成为全球第三大癌症死亡原因［10］，具有高隐匿性、高病死率、预后差等特征，其五年生存率约为14.1%［11］。肝癌的早期诊断困难并且病情发展迅速，故放化疗成为主要的治疗策略。但抗肿瘤药物在灭杀肿瘤细胞时导致正常细胞凋亡引起的组织器官损伤是当前肿瘤治疗中需突破的瓶颈。近年来，中药因其副作用小、毒性小等优点，在抗肿瘤研究领域受到广泛关注，特别是在辅助用药方面。甘草素有“十方九草” 之说，是传统中医药的常用中药，也是“调和诸药” 主要药物，能够缓解毒性药物引起的毒性反应［12］，而与抗肿瘤药物联用的研究较少，本研究借助H22荷瘤小鼠模型，探讨甘草和顺铂联用后在化疗中的“增效减毒” 作用。

目前，促细胞凋亡被认为是抗肿瘤最直接有效的方式。Bcl-2 家族蛋白与细胞凋亡密切相关，主要分为2类［13］，一类为促凋亡蛋白，包括Bax、Bad、Bid、Bik等； 另一类为抗凋亡蛋白，包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-W等。Bcl-2 蛋白是细胞凋亡的关键抑制剂，与Bax 结合形成Bax/Bcl-2 二聚体，增加细胞对凋亡刺激的敏感性［14］。因此，通过升高Bax 蛋白和降低Bcl-2 蛋白可以促进癌细胞凋亡［15］。本研究结果显示，甘草与顺铂联用较顺铂单用Bax 表达升高，Bcl-2 表达降低，表明甘草可以增强顺铂的抗肿瘤作用。

此外，摄入机体的顺铂主要积聚在肾脏中，会诱导肾细胞凋亡，临床上最严重和更常见的表现是急性肾损伤［16］。本研究显示，顺铂单用组荷瘤小鼠肾小管结构不清，胞质疏松网状化，细胞排列紊乱，部分小管管腔可见坏死、脱落细胞，出现肾小管扩张及蛋白管型，肾功能生化指标（BUN、Cr） 升高，反映了肾组织受到损伤； 而与甘草联用后，损伤有所改善。已有研究证实，氧化应激是顺铂毒性中最重要的机制之一［17］。正常生理状态下，产生的自由基被细胞内抗氧化酶（如SOD） 消除，从而维持自由基产生和消除之间的平衡［18］。MDA 是脂质过氧化的最终产物，造成细胞凋亡［19］。顺铂可以增加超氧化物的产生并抑制SOD 活性，造成肾损伤［20］。本研究结果显示，甘草与顺铂联用较顺铂单用组小鼠肾组织中SOD 活性升高，MDA水平降低，表明甘草通过抑制顺铂引起的氧化应激，阻止细胞凋亡，与前期研究相一致［5］。

综上所述，甘草与顺铂联合用药，可以增强顺铂的抗肿瘤作用且能预防其诱导的肾毒性，可能是一种有前途的顺铂临床应用的辅助药物，故对其增效和减毒作用机制的研究值得进一步探索。