液相阻断ELISA口蹄疫抗体检测原理及技巧

文│孙贺 王国岩 王长鹏 崔贞爱 孙晓萍 （吉林省永吉县动物疫病预防控制中心）

谢晓岩 （吉林永吉经济开发区综合服务中心）

口蹄疫是一种严重威胁（如猪、牛、羊等）偶蹄目动物健康的一类传染性动物疫病，给猪牛羊等养殖场/户带来巨大的经济损失。县级兽医实验室口蹄疫抗体检测是我国基层动物防疫部门防控口蹄疫的重要方法，准确检测出当地猪牛等动物的口蹄疫抗体水平，对预防和控制当地口蹄疫疫病具有重要的指导作用和参考意义。

口蹄疫抗体ELISA检测是县级兽医实验室最复杂的检测试验。试验难度大，操作步骤多，试验原理难以理解。笔者力求用简单通俗的语言把该试验的原理阐述清晰，希望能够对广大同行有所帮助。

一、液相阻断ELISA抗体检测的试验步骤和试验原理

液相阻断ELISA抗体检测试验的基本原理是将已知的抗原或抗体结合在固相载体表面，然后利用酶标记（偶联）的抗体或抗原与之孵育，再通过显色物显色，其显色深浅与待测物质的含量成正比或反比。上述是较学术的原理描述，对于刚接触试验的人员较难理解，笔者按待检样品有或无抗体两个情况分别讲解各试验步骤中的试验原理。

1.试剂厂家提供的抗原和待检血清中的抗体反应。本检测试验中提到的抗原都是指试剂厂家提供的冻干病毒抗原，在检测试验中我们要先溶解，按照使用说明书的稀释比例稀释后使用。这里的抗体是指待检血清样品中抗体和阳性对照抗体。第一步我们把稀释后的血清样品和稀释后的抗原先后加入U型反应孔里4℃过夜或者37℃温育90分钟，其原因就是为了抗原抗体充分反应结合。我们分两种情况来看，第一种情况是待检血清样品里有抗体（这里以样品内抗体含量足够多为例），其结果是所有抗原和抗体结合，没有了游离状态的抗原（笔者把没有结合的物质称之为游离状态）。第二种情况是样品里没有抗体，那么抗原没有被结合，反应孔中存在加入游离状态的抗原物质。

2.抗原抗体混合液移到包被有兔抗的ELISA板上温育反应。试验中使用的包被板可以理解成这种反应板上固定有另外一种能和抗原结合的抗体，这种抗体可结合第一步反应中没有被样品抗体结合而剩下的抗原。这里继续分待检血清样品是否有抗体来看其试验原理，第一种情况若样品有抗体，这个反应孔里由于第一步抗原和样品抗体结合了没有余下的抗原，就没有抗原和包被板上抗体的结合，此时的“样品抗体＋抗原”结合物处于游离状态。第二种情况若样品没有抗体，由于第一步加入的抗原是游离状态，该状态下的抗原会和包被板上的抗体结合，此时的抗原和包被板上的抗体结合成“包被抗体＋抗原”结合物，并且该结合物是固定在反应板上的状态。温育洗板后，有样品抗体的反应孔，由于“样品抗体＋抗原”结合物是游离状态，会被洗掉，反应孔只留有包被抗体，相当于空孔。没有样品抗体的反应孔由于“包被抗体＋抗原”结合物呈固定状态，不会因洗板过程而洗掉，依然留在包被板上。

3.加入豚鼠抗体工作液进行温育反应。豚鼠抗体可以称之为I号抗体，这个抗体也能和抗原结合。我们知道一个抗原可以结合多个抗体。在本步骤中，第一种情况若是待检血清样品有抗体，该反应孔由于洗板操作会把所有游离状态的“样品抗体＋抗原”清洗掉，反应孔里没有抗原的存在，所以这一步没有抗原抗体结合反应，此时加入的I号抗体处于游离状态。第二种情况待检血清样品没有抗体的反应孔这一步会形成“包被抗体＋抗原＋I号抗体”结合体，并且固定在反应板上。通过洗板后有样品抗体的反应孔由于I号抗体是游离状态会被洗掉，孔内只有包被抗体；无样品抗体的反应孔则在反应孔里固定了“包被抗体＋抗原＋I号抗体”结合体。

4.加入兔抗豚鼠IgG-HRP工作液进行温育反应。兔抗豚鼠IgGHRP工作液可以称之为酶标Ⅱ号抗体。该步骤加入的酶标Ⅱ号抗体能与第三步加入的I号抗体特异性结合。第一种情况若待检血清样品有抗体，该反应孔由于只有包被抗体的存在，所以本次加入的酶标Ⅱ号抗体也是不能发生特异性结合反应，进而呈游离状态。第二种情况若没有样品抗体，该反应孔这一步会形成“包被抗体＋抗原＋I号抗体＋酶标Ⅱ号抗体”的结合体，并且固定在反应孔里。洗板后有样品抗体的反应孔由于加入的酶标Ⅱ号抗体呈游离状态所以会被洗掉，孔内依然只有包被抗体；无样品抗体的反应孔则在反应板上固定了“包被抗体＋抗原＋I号抗体＋酶标Ⅱ号抗体”的结合体。

5.加入TMB底物显色。加入底物之所以会发生显色反应是由于第四步中的酶催化导致的。所以这一步待检血清样品中含有抗体的反应孔中由于没有催化酶，加入底物不会发生显色反应。待检血清样品中无抗体的反应孔由于存在“包被抗体＋抗原＋I号抗体＋酶标Ⅱ号抗体”的结合体，其中酶标Ⅱ号抗体所含的酶会使底物溶液变成蓝色。此时我们肉眼所见深蓝色反应孔的样品是没有抗体，或者抗体效价较低。

6.加入终止液，终止反应并在酶标仪上读取D450纳米值。显色反应结束后加入终止液。终止液为强酸溶液，强酸会使显色终止，并且将显示出的蓝色变成黄色。这一步依旧是有样品抗体的反应孔不发生显色终止反应。没有样品抗体的反应孔发生显色终止反应。此时显示黄色的反应孔是抗体阴性孔。D450值表示被检测物吸收掉的光密度，该值越高表示被吸收掉的光越多。由于无样品抗体反应孔中含有“包被抗体＋抗原＋I号抗体＋酶标Ⅱ号抗体”结合物能够催化TMB底物，形成可以吸收光的物质，所以该反应孔的D450纳米值较高，反之有样品抗体的反应孔无酶标抗体，不能催化底物形成吸光物质，所以D450纳米值较低。

上述内容只是就有无样品抗体两个极限做的原理说明，但实际检测试验中需要检验抗体效价，效价可以通俗地理解成抗体的多少。若某样品含有的抗体足够多，稀释该样品到1∶128后样品中的抗体还能全部结合掉加入的抗原，那么说明该样品效价高，该牲畜口蹄疫抗体水平高。若是某个样品在1∶128的稀释倍数后，该样品所含有的抗体数量无法完全结合掉加入的抗原，就会形成后续一系列的抗体抗原结合反应，最终形成吸光物质，D450纳米值大于临界值说明该样品中不含有抗体或含有的抗体较少，判定为该牲畜口蹄疫抗体水平低或者无抗体。

二、试验操作的实用技巧

1.批量定性检测法。在县级兽医实验室进行大批量口蹄疫抗体水平检测时，通常采取定性检测法。这样一块96孔兔抗包被板可检测80个样品，能有效降低检测成本，并且能大量降低试验人员的工作量。具体做法是先在96孔反应板上稀释样品，对待检样品做64倍稀释，即1份样品加入63份PBST缓冲液体。该稀释过程可以用1毫升容量的96孔深孔反应板（试剂盒里不提供，笔者是另外单独购买的深孔反应板）。由于稀释步骤越少越能保证稀释效果，笔者采用较多的稀释方法是先在容量为1毫升的96孔的反应板上的前10列分别加入630微升PBST缓冲液，之后依次在每个孔里加入10微升待检血清样品。这样会获得64倍稀释的待检样品。然后抽取50微升64倍稀释样品后加入50微升抗原，进一步稀释到128倍，若此时该样品的D450纳米值大于临界值，说明该样品按说明要求做最小稀释倍数依然没有足够多的抗体，说明该样品抗体含量较少，抗体阴性，抗体检测不合格。

2.试验设计技巧。笔者认为试验设计是关系整个试验的关键所在，特别是在大批量检测任务中，如春秋防疫验收的试验过程中由几百上千份样品要进行检测，这时候的试验设计非常重要，如采样单元采样数量设计。不同的采样单位如全县每个乡镇的采样结构要尽量相同，如定下每个乡镇30头份猪血清，20头份牛血清，那么每个乡镇都要按照这个采样任务进行采样。由于我们反应板一行可以检测10份，所以单畜种采样数量尽量做到10的倍数。如10份，20份等，这样做的好处是每个乡镇相同畜种的待检血清都能占满反应板的一行，这样在后期核对结果、出具检验报告时都会容易很多。

3.抗原的使用技巧。口蹄疫病毒抗原在稀释后保存温度为-20℃，若是开展的检测数量少，不能一次用完，会出现因抗原反复冻融出现失活的情况，进而造成试验结果不成立或者试验结果不准确的情况。因此，笔者在每次开新的病毒抗原时都是分成5等份，稀释后的1毫升病毒抗原每份200微升写好标签放于带有胶塞的安培瓶中置于-20℃冷冻保存，每次检测领取一份，这样可以很好地避免抗原反复冻融，保证后续试验的准确性。

县级兽医实验室是我国基层动物疫病预防控制机构的检验检测单位，对我国动物疫病防控具有重要的作用。兽医实验室检验员做好口蹄疫抗体检测对预防和控制本地口蹄疫疫情具有重大作用。作为兽医实验室检验人员要善于总结经验，理解并且掌握检验原理，力求把检验检测工作做到更好，为我国基层口蹄疫疫情防控贡献自己的力量。