类器官技术在肺部疾病研究中的应用

周梦雪 卢锡南 俞万钧 王华英

在成人器官中，生理功能的完成取决于以三维（3 dimensional，3D）结构构建的各种类型细胞的协同相互作用。目前大多数体外实验均使用二维（2 dimensional，2D）细胞培养，无法模拟器官间相互作用的复杂生理病理学和药代动力学过程。类器官是一种来自于多能干细胞和器官特异性成体干细胞的体外3D 培养细胞结构，是具有类似于体内器官或组织的结构特点并兼备部分功能的一种体外模型。目前科研人员已成功建立多种正常组织及肿瘤组织来源的类器官，涉及人体内各大系统。

肺作为人体内最大的呼吸器官，与人类健康息息相关。近年来，慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）、支气管哮喘、间质性肺疾病（interstitial lung disease，ILD）、各种病原体所致肺部感染及肺部肿瘤的发病率均有增高趋势，严重危害国民健康。随着类器官技术的发展，其在肺部疾病中的应用探索日渐增多，在非特异性炎症、感染及肺部肿瘤等方面均有涉及。因此，本文就类器官技术在肺部疾病研究中的应用作一综述，以期为肺部疾病的研究发展提供参考方向。

1 肺类器官的培养

既往文献报道，基底细胞、Club 细胞和2 型肺泡细胞（alveolar type II cells，AT2）分别是肺气管、支气管和肺泡的主要内源性干细胞群，并且可在支气管肺泡上皮细胞受损时被激活，参与肺修复与再生过程[1-5]。位于支气管肺泡管交界处的支气管肺泡干细胞也被证实在肺修复和再生过程中具有多能性和自我更新能力，发现这些细胞的多向分化能力为肺类器官的培养奠定了理论基础[6]。自Rock 等[2]成功使用气道基底细胞首次培养类器官以来，肺类器官陆续成功地从成体干细胞、人类多能干细胞（包括胚胎干细胞和诱导性多能干细胞）中生长出来，并在肺纤维化、COPD、感染性疾病及肺癌等肺部疾病的研究中广泛应用。

呼吸道类器官的培养根据所要得到的疾病模型的差异，具体培养方法也不尽相同。如上文所述，“类器官”这个术语通常用于描述具有多个细胞谱系和组织结构的3D 结构，但有学者提出该术语仅限于包含上皮和间充质细胞的培养物[7]。因此同时包含上皮和间充质细胞的气液界面培养物也被某些学者称为类器官[8]。

培养人气道肺类器官的样本可取自气管抽吸物、支气管肺泡灌洗液、活检组织、恶性积液及手术样本[9]，培养成功率与样本中的干细胞丰度相关。在研究COPD[10]、流感病毒感染等与纤毛细胞高度关联的病理模型时，气液界面模型及纤毛细胞在外的极化肺类器官模型更为适用，能够高度模拟人体中气道纤毛细胞受损的过程。Zhou 等[11]在评估新型流感病毒的传染性过程中同时建立了纤毛细胞朝向腔内的3D 类器官及纤毛细胞朝向气液平面的2D 类器官模型，比较两者后得出这种具有纤毛顶端暴露在外的2D 类器官模型更加符合人类呼吸道流感病毒感染的自然模式。但在进行类器官培养时，相较于3D 模型，气液界面模型培养所需细胞数较多，而这些细胞难以直接从患者身上获得。为弥补气液界面模型培养过程中细胞数量不足这一缺点，Eenjes 等[12]提出一种基于3D 扩增的气液培养模型，以从气道上皮细胞数量较少的患者样本中获得足够数量的细胞。顶端细胞在外的3D 气道类器官[13]被开发出来作为研究病毒感染及筛选抗病毒药物的工具，弥补了传统气道类器官的极化结构，且比传统气液界面模型拥有更高的研究宿主-病原体相互作用的敏感性。

2 肺部疾病模型

2.1 细菌感染模型

2.1.1 肺结核 肺结核是一种由结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的传染性疾病，严重危害人体健康。现今已有研究人员将人肺类器官应用于模拟MTB 感染及产生的免疫应答，为临床上肺结核的治疗提供参考。多项研究结果表明，MTB 主要通过入侵肺泡巨噬细胞并在吞噬体内复制引起肺部的感染。Iakobachvili 等[14]首次使用气道类器官作为人类体外3D 系统来研究MTB 感染的早期步骤。通过显微注射的方法将MTB 注射入含有基底细胞、纤毛细胞和杯状细胞的人气道类器官管腔内，建立感染模型。该团队进一步研究发现MTB 感染的气道类器官上皮细胞中IL-8 和β-防御素1 表达显著增加，可能是感染早期炎症控制的原因。此外，该团队还发现MTB 显著下调了与气道分泌物产生有关的黏蛋白5B 和黏蛋白4 等基因的表达，MTB 对这些黏蛋白基因表达的抑制可能有助于其在气道中定植。

鉴于巨噬细胞在肺结核中的重要地位[15]，Iakobachvili 等[14]将人单核细胞来源的巨噬细胞与注射了MTB 的气道类器官进行共培养，观察到巨噬细胞迁移到气道类器官基底边缘并与其相互作用，捕获和摄取细菌，与细支气管周围巨噬细胞迁移到感染部位和吞噬病原体物质的自然过程相类似。以上结果表明气道类器官提供了一个有价值的3D 系统来评估MTB 与人类气道的早期相互作用。

类器官技术应用于肺结核的研究具有一定的局限性，目前相关报道较少。气道类器官模型中肺泡细胞的缺失、免疫微环境的缺乏、3D 囊性结构使MTB 感染模型的场所受到限制等都是阻碍类器官技术在肺结核中研究应用发展的原因。而现今气液界面模型及纤毛细胞在外的极化肺类器官模型培养技术已较成熟，但这些模型在肺结核中的研究应用还有待完善。

2.1.2 铜绿假单胞菌肺部感染 铜绿假单胞菌表达磷脂酶ExoU，ExoU 通过一种特征不明确的途径触发病理性宿主细胞坏死[16]。Bagayoko 等[17]培养正常人肺类器官，并通过显微注射铜绿假单胞菌感染类器官，结果显示ExoU 在人支气管类器官中引发病理性脂质过氧化依赖性细胞坏死，类器官完全崩解。能引起肺部感染的细菌多种多样，目前肺类器官模型对于肺部细菌感染的研究开展相对较少，仍待进一步发展。

2.2 病毒感染模型 新型冠状病毒感染（coronavirus disease 2019，COVID-19）可能导致急性呼吸窘迫综合征、多器官衰竭和死亡。COVID-19 由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引起，传染性极强，在几个月的时间内即引起全球范围内的大流行。在COVID-19 疫情的大环境下，不少研究人员尝试探索COVID-19 的研究模型及治疗方案。

早在COVID-19 疫情之前，人气道类器官就已被用来建立流感感染体外模型。在正常肺类器官中，甲流病毒（influenza A virus，IAV）感染后的未成熟及成熟类器官之间的病毒载量无明显差异，同样在肿瘤类器官中，IAV 可以感染并从人肺肿瘤细胞建立的类器官中复制。3D 肺类器官在IAV 感染后激活先天免疫反应基因，并且AT2 细胞可能在损伤后的肺再生中发挥重要作用[18]。

原代人支气管呼吸道上皮细胞可以在气液界面上分化为成熟的呼吸道细胞[9]。有研究组发现使用小气道基底细胞建立的气液界面类器官模型很容易被SARS-CoV-2 所感染[19]，同时还发现纤毛细胞是SARSCoV-2 的主要靶点，并通过IFN-K1 验证该模型可用于SARS-CoV-2 的药物筛选。此外，在探索COVID-19 引起的过度活跃的免疫反应导致的肺部广泛受损的机制中也运用了上述培养方法[20]。既往研究发现近端气道会引起持续的病毒感染，但致命性的过度活跃的免疫反应主要与远端肺泡细胞有关，单纯的近端气道或远端肺泡3D 类器官模型SARS-CoV-2 感染很难引起弥漫性肺泡损伤，无法高度还原人体中的病理状态[11]。由支气管肺泡干细胞所形成的模型可模拟支气管肺泡室的3D 形态和细胞组成[21]，增加了肺类器官内部多元性及复杂性，最大程度模拟人体中肺的生理病理状态。

COPD 是COVID-19 患者预后不良的高危因素。最新研究发现，SARS-CoV-2 在COPD 类器官中表现出更高的复制能力，且与正常肺类器官相比，COPD 模型中的IL-6 和IFN-β 显著减少，并且有抑制C-X-C 基序趋化因子配体10 的趋势[22]。因此证明类器官病毒感染模型不仅可以在正常肺类器官上建立，还可以在COPD 等疾病状态下的肺类器官模型上建立，极大程度地模拟了患COPD 等基础疾病患者感染病毒后的病理生理变化。

2.3 寄生虫感染模型 肠道是隐孢子虫的主要感染部位，呼吸道同样可被感染，从而导致呼吸道隐孢子虫病。然而呼吸道隐孢子虫感染的病理生理学机制在很大程度上仍是未知，有研究者在进行人类小肠类器官研究的同时，尝试使用人肺类器官来模拟寄生虫的呼吸道感染[23]，将隐孢子虫的卵囊显微注射至类器官中，在不同时间节点收集类器官，以证明隐孢子虫可在人小肠类器官及肺类器官中繁殖并完成其整个生命周期，该研究发现从类器官中新产生的卵囊具有传染性，其结构及生物学行为同在宿主体内无较大差异。

2.4 COPD 模型 肺类器官可作为研究COPD 病理生理学和治疗发展的体外模型。COPD类器官模型可通过暴露于香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract，CSE）[24]或细颗粒物2.5（particular matter 2.5，PM2.5）[25]形成，也可直接使用取自COPD 患病个体鼻咽及支气管上皮细胞[22]建立。Chen 等[24]研究发现COPD 类器官中磷酸化混合谱系激酶结构域样蛋白和高迁移率族蛋白B1 高表达，且以受体相互作用蛋白激酶3 依赖性的细胞坏死途径参与COPD 的发生、发展。暴露于PM2.5 的COPD 类器官中的AT2 细胞分化为1 型肺泡细胞的进程被抑制，这可能是PM2.5 导致COPD 的原因之一[25]。支气管杯状细胞化生是COPD 的病理生理基础之一，Li 等[26]发现抑癌肝激酶B1（tumor suppressor liver kinase B1，LKB1）可消除肺上皮细胞促进杯状细胞化生，并使用小鼠肺类器官模型印证气道Club 祖细胞LKB1 缺陷会促进抵抗素样分子-α 的表达，从而推动气道杯状细胞分化和肺巨噬细胞募集。

近年来，关于COPD 的组织再生疗法成为一个热点。Wu 等[27]在寻找用于COPD 肺修复的新的潜在药物靶点的过程中确定E 型前列腺素受体（eseries of prostaglandin receptor，EP）和前列环素受体（prostacyclin receptor，IP）两个潜在靶点，并使用肺类器官进行药物筛选，得出EP4 及IP 激动剂对于CSE 暴露受损的类器官显示出有益作用。晚期糖基化终产物受体（receptor for advanced glycation end-products，RAGE）与COPD 的病理生理学有关，在类器官中，RAGE 配体降低了类器官形成效率和上皮细胞分化为肺类器官的能力，而类器官的平均直径增加[28]，推测RAGE 抑制剂可能是肺气肿肺组织修复的潜在靶点。

2.5 肺纤维化模型 ILD 是一组主要累及肺间质及肺泡腔，导致毛细血管功能单位丧失的弥漫性肺疾病，可最终发展成弥漫性肺纤维化，导致呼吸衰竭而死亡。绝大部分肺纤维化原因不明，称为特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF），是ILD 中的一大类。近年来IPF 发病率有明显上升的趋势，严重危害人体健康。

白化病-血小板病综合征（hermansky-pudlak syndrome，HPS）是一种罕见的常染色体隐性遗传病，通常以血小板功能障碍、眼皮肤白化病、蜡样脂褐素在溶酶体中的积累、肉芽肿性结肠炎和肺纤维化为特征，HPS 患者的肺纤维化称为HPS 相关间质性肺炎（HPSassociated interstitial pneumonia，HPSIP）[29]。Chen 等[30]首次通过HPS1 基因缺失诱导了纤维化样肺类器官。Strikoudis 等[31]以此为基础也成功诱导出HPSIP 类器官，认为其可作为IPF 的早期模型。同时他们利用HPSIP 类器官模型发现IL-11 表达增加，认为IL-11 可能是驱动IPF 发生的重要因子。Kim 等[32]使用转化生长因子β1 诱导后的肺类器官表现出间质区域的胶原蛋白积累和纤维化变化，成功诱导出肺纤维化类器官模型，并在此基础上进行体外药物测试，证实乳脂球表皮生长因子8 的短链形式拥有与尼达尼布和吡非尼酮同样的抗纤维化作用。

囊性纤维化是由囊性纤维化跨膜电导调节因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）基因突变引起的[33]。有研究使用气液培养的气道类器官进行药物筛选，证实FDA 新批准的CFTR 调节剂Trikafta 三重组合的功效显著优于单独CFTR 调节剂[34]。与其他类器官培养技术不同的是，该研究提出了培养重编程条件（culture reprogramming condition，CRC），该技术可在体外培养出高效扩增的气道上皮干细胞，CRC 培养物在体外重复传代后仍保持干细胞表型，遗传缺陷得以维持，即使在低温保存后，也保证了大量扩增和储存这些细胞以供后续研究的可能性。这种CRC 技术可被用于扩增大量培养类器官所需的原代细胞。

2.6 肺癌模型 类器官技术在肺癌中的研究较为成熟，对肺癌的大规模基因组分析表明，个体患者之间的表型和基因组多样性表现为肿瘤间和肿瘤内的异质性。癌细胞株一般不能保持其原始的异质性和3D器官结构；因此，它们在表现肺癌的复杂性方面是有限的。类器官代表了一个由干细胞和分化细胞组成的功能单元。此外，肿瘤类器官比人源肿瘤异种移植模型建立所需时间更短，并已证明即使在长期扩增后也能稳定地保留致瘤性，如恶性肿瘤的细胞学特征、异种移植物的形成、突变的保存、拷贝数畸变等，还保留了匹配的亲本肿瘤对靶向治疗的敏感性[35]，逐渐被广大研究者所采纳，作为肺癌相关研究的有效体外模型。Kim 等[36]提取不同患者原发性肺癌组织和配对的非肿瘤性气道组织，成功培养出来源于腺癌、鳞状细胞癌、腺鳞癌、大细胞癌和小细胞癌及正常气道上皮的类器官，他们发现不同肺癌亚型的类器官培养成功率比较差异无统计学意义。源自腺癌的肺癌类器官（lung cancer organoid，LCO）产生腺泡或大腺体模式，并保留肺腺癌标志物napsin-A、甲状腺转录因子1 和细胞角蛋白7 的表达[37]。鳞状细胞LCO 显示出明显的细胞边界和细胞质角化，符合鳞状细胞癌组织的组织学特征，还高表达鳞状细胞癌的特征标志物p63 和细胞角蛋白5/6[38]，腺鳞状LCO 保留了在原始患者肿瘤组织中观察到的腺癌和鳞状细胞癌的混合组织学特征[37]。

LCO 可应用于肺癌生长、侵袭及转移等机制的探索。Lin 等[39]通过建立小鼠的LCO，经Fascin 抑制剂处理后进行下游因子的分析得出Fascin 通过促进糖酵解和PFKFB3 的表达促进肺癌的生长和转移。

类器官技术可用于建立一个高效的药物筛选平台[36，40-41]，应用于各种肺部疾病新药疗效及药物联合使用方案的疗效评价，主要用于肺部肿瘤药物的筛选。在对建立的各肺癌类器官及正常气道上皮类器官使用细胞毒性药物多西他赛及不同靶向药物测试后发现，相比靶向药物，正常气道上皮类器官更容易受到多西他赛损伤，不同个体中获取培养的肿瘤类器官对药物的反应也不尽相同[36]。

嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）工程化T 细胞的免疫疗法在血液系统恶性肿瘤中取得了显著的成功[42]，但在实体瘤中仅表现出适度的临床活性。Li 等[43]发现非小细胞肺癌中表达Ⅰ型跨膜蛋白B7-H3，靶向B7-H3 的CAR-T 细胞在体外对肿瘤细胞系和肺癌类器官表现出抗肿瘤活性，这可能是肺癌治疗的一个新方向。

类器官同时也是一种高效的临床预测模型，包括药物测试中类器官的变化能够预测患者用药后的临床反应。Kim 等[40]从恶性积液、脑转移灶、骨转移灶及肺原发肿瘤取得样本并培养出LCO，在临床批准酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）治疗患者的队列中，对其相应LCO 进行TKI 单药处理，结果显示LCO 能够以75.0%的准确度预测患者无进展生存期，并能够成功预测患者用药后的临床反应。最新发布的一项研究中，在纳入肺癌类器官药物筛选测试的5例患者中，其临床药物应用后的反应与相对应的肺癌类器官药物筛选测试100%一致，化疗药物测试中的结果也大致相同[44]。

3 类器官技术在肺部疾病中的临床应用

类器官技术自2016 年起被纳入临床试验中，且有逐年递增的趋势。截至2023 年10 月10 日，在FDA 官方备案的肺相关类器官的临床试验已有19 项，半数以上研究旨在探索类器官技术指导肺癌患者临床用药和个体化医疗的临床价值。

一项临床Ⅱ期研究通过从HER2-A775_G776YVMA 插入突变的晚期肺腺癌患者肿瘤标本建立的LCO，分别用阿法替尼及吡咯替尼刺激后得出吡咯替尼这种泛人类表皮生长因子受体TKI 对人类表皮生长因子受体2 外显子20 突变的非小细胞肺癌具有强大的抗肿瘤活性[45]。肺癌类器官也可作为临床研究中重要的体外部分的补充及完善。Yun 等[46]发现埃万妥单抗抑制上皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）外显子20插入驱动突变型非小细胞肺癌类器官的生长，且呈浓度依赖性。对于双靶点突变的肺癌患者，类器官依然是有效的体外药物测试模型。使用达拉非尼、曲美替尼联合处理源自某位同时携带EGFR 和鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1 基因突变的非小细胞肺癌患者的LCO，可观察到明显的类器官生长抑制，然而布加替尼、西妥昔单抗单药使用或布加替尼、西妥昔单抗联合处理方案反而导致肿瘤类器官生长，该患者接受达拉非尼及曲美替尼联合治疗后在影像表现上病灶明显缩小，与其LCO反应一致[40]。

4 小结

类器官具有与人体器官组织的高度同源性，长期保持原始组织特征及遗传一致性，由不同类型的上皮细胞形成的3D 空间结构，所需样本量较少，构建时间短等优点，弥补传统2D 细胞培养和动物模型的缺陷，是作为肺部疾病研究、药物筛选、疾病预测的高效体外模型，同时满足实验的伦理要求，因此在肺部疾病中的研究运用越来越广泛。随着类器官技术的发展，其在个性化医疗领域也显现出良好前景。以患者来源的非小细胞肺癌类器官的药物筛选所制定的个性化治疗方案在临床上已被小范围应用，也表现出令人满意的治疗效果。

当前的类器官模型仍受限于无法有效模拟人体中肿瘤微环境，无法重现人体中各组织或器官相互作用等，无法完全还原所建立的疾病模型在人体中的实际状态。如果能够攻克这些难题，类器官技术在解决肺部疾病甚至是人体各系统中疾病的研究中将具有更为广阔的应用前景。