糖原合成激酶-3β通过上皮间充质转化参与糖尿病肾病发生发展的研究进展

孙宣锋，曹慧霞，焦晓静，张丽娜，阎 磊，邵凤民

(郑州大学人民医院肾内科/河南省肾脏病免疫重点实验室,河南 郑州 450003)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是指由糖尿病所导致的慢性肾脏疾病,是糖尿病重要的并发症之一[1]。国际糖尿病联盟的最新统计数据显示,2021年全球约5.37亿人(20～79岁)患有糖尿病,并且有多达30%～50%的糖尿病患者合并DN[2-3]。DN不仅是糖尿病的重要并发症,也是全球终末期肾病最常见的病因[4]。因此,明确DN的发病机制并采取有效防治措施来延缓病情进展成为当前研究的热点。DN的发病机制比较复杂,近期研究发现,上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在DN发生发展过程中发挥着不可或缺的作用[5-6],而与糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)相关的EMT在DN发病过程中的作用尤为重要[7]。本文就GSK-3β通过EMT参与DN发生发展的研究进展进行综述,以期为DN的临床治疗提供参考。

1 GSK-3β

1.1 GSK-3β概述

GSK-3β是一种涉及多个细胞信号转导通路的丝/苏氨酸激酶,广泛存在于各种组织和细胞中[8]。GSK-3β生物学功能复杂,可通过控制糖原的合成来调节糖原的代谢,并通过影响线粒体的通透性和细胞色素C的释放来调节细胞凋亡[9],还在炎症、免疫调节、胚胎发生及组织损伤、修复和再生等生物学过程中发挥作用[10]。GSK-3β有2个磷酸化位点,分别为Ser9和Thr216。Ser9位点磷酸化可使GSK-3β 活性降低,相反,Thr216位点磷酸化可使GSK-3β 活性升高[11]。由磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)信号转导激活的蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)磷酸化GSK-3β的Ser9位点并抑制GSK-3β的活性,而蛋白磷酸酶2A在Ser9位点可使GSK-3β去磷酸化[12]。GSK-3β的Tyr216位点的酪氨酸磷酸化受钙依赖性酪氨酸激酶、富含脯氨酸的酪氨酸激酶 2、环磷酸腺苷激活的蛋白酪氨酸激酶、Zaphod激酶1等的调节[13]。

1.2 GSK-3β在EMT中的作用

有研究报道,肾纤维化在DN的进展中起重要作用,转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、细胞外因子等作为关键的调节分子参与肾纤维化过程[14-15]。EMT是在生理或病理条件下上皮细胞发生表型转变的一种生物学现象[16-17]。细胞在受到高糖诱导时失去原有特征,上皮细胞钙黏蛋白、紧密连接蛋白及裂隙素等上皮细胞样分子标志物表达下调,α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、铁死亡抑制蛋白-1(ferroptosis suppressor protein-1,FSP-1)、基质金属蛋白酶-9等间充质细胞样分子标志物表达上调[18]。WAN等[19]在GSK-3β 抑制剂延迟2型糖尿病 db/db小鼠肾脏和足细胞EMT的研究中发现,高糖可上调足细胞和肾皮质中GSK-3β的活性,(2′Z,3′E)-6-溴茚红素-3 ′-肟[(2′Z,3′E)-6-bromoindirubin-3′-oxime,BIO)]可下调GSK-3β的活性;高糖可降低上皮标志物裂隙素的表达,BIO可增加上皮标志物的表达,进而导致间充质标志物(如α-SMA和纤连蛋白)表达水平降低;随着EMT在db/db小鼠肾组织中的发展,总GSK-3β和第216位酪氨酸位点磷酸化的GSK-3β的表达水平以及GSK-3β的活性均增加,而第9位丝氨酸位点磷酸化的GSK-3β活性下降。因此,推测GSK-3β的激活在EMT中起重要作用,抑制GSK-3β的活性可能会延缓EMT的发展。

2 GSK-3β参与EMT影响DN发生发展的机制

2.1 EMT在DN发生发展中的作用

EMT被认为是DN中足细胞损伤的主要原因,且肾小球足细胞对肾小球滤过屏障发挥正常功能至关重要,足细胞损伤或丢失会导致DN的进展[20]。在高糖刺激下足细胞表型会发生改变,间充质标志物表达增多,上皮标志物表达减少,导致足细胞脱离或功能障碍,最终导致肾小球滤过功能障碍。TU等[21]研究发现,姜黄素可通过上调DN大鼠和小鼠足细胞克隆-5细胞中钙黏蛋白水平,并下调波形蛋白和扭曲蛋白水平来预防DN中足细胞的EMT、蛋白尿和肾损伤。LIU等[22]在体内试验中使用链脲佐菌素在CD-1小鼠中诱发糖尿病,并通过腹腔注射牛血清白蛋白来加速小鼠肾纤维化,结果发现,应用重组丙酮酸激酶同工酶M2激活剂TEPP-46抑制EMT可减轻小鼠肾纤维化;在体外实验中,TEPP-46可抑制由TGF-β1和(或)高葡萄糖培养诱导的EMT,恢复肾小管表型,减轻糖尿病小鼠肾脏纤维化。因此,EMT可能是促进DN进展的潜在途径。

2.2 GSK-3β通过参与EMT过程影响DN进展

GSK-3β通过参与相关信号转导通路调控肾脏细胞发生EMT,改变上皮细胞样分子标志物和间充质细胞样分子标志物的表达,造成细胞损伤,影响DN的进展[23]。GSK-3β主要通过介导TGF-β/Smad蛋白(TGF-β/Smad)、Wnt/β联环蛋白(Wnt/β-catenin)、整合素/免疫淋巴因子(integrins/immune lymphokines,integrins/ILK)等多个信号转导通路参与EMT。

2.2.1 GSK-3β通过TGF-β/Smad信号转导通路 参与EMT

TGF-β/Smad转导通路作为经典通路,在高糖诱导下参与一系列复杂的机制,引起肾脏上皮细胞发生EMT[24]。TGF-β与TGF-β Ⅰ型受体和TGF-β Ⅱ型受体形成配体受体复合物,同时,TGF-β Ⅰ型受体在细胞质区域被磷酸化,导致其下游Smad2和Smad3被磷酸化和激活。磷酸化的Smad2、Smad3与Smad4在细胞质结合形成Smad复合体并发生核易位[25-26]。Smad复合物进入细胞核后,与基因启动子区EMT相关的Smad结合元件整合,发挥调控作用,进一步影响DN的发生发展[27]。有报道指出,GSK-3β参与TGF-β/Smad信号通路的调控,在TGF-β的刺激下,GSK-3β磷酸化Smad1或Smad3,磷酸化后的Smad3与Smad4结合形成 Smad复合物,整合EMT相关的Smad结合元件,调节DN的发生发展[28]。CHEN等[29]用TGF-β1处理小鼠肾小管上皮细胞,结果发现,细胞中GSK-3β的表达量增加,且鹅卵石样立方形的肾小管上皮细胞转化为梭形间充质细胞;该研究还发现,高选择性非三磷腺苷竞争性小分子抑制剂4-苄基-2-甲基-1,2,4-噻二唑烷-3,5-二酮或锂盐等GSK-3β抑制剂可减轻TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞形态学变化;这表明,GSK-3β抑制剂可通过调节TGF-β1/Smad 信号通路活性驱动肾小管上皮细胞分子变化。赵凯等[30]研究发现,GSK-3β特异性抑制剂氯化锂可增加肾小管近端上皮细胞中GSK-3β的Ser9位点磷酸化,抑制GSK-3β过表达,降低TGF-β1诱导的Smad3磷酸化,进而影响Smad复合物进入细胞核调节基因转录,干扰EMT相关DN的进展过程。 除此之外,GSK-3β还参与TGF-β介导的Smad非依赖性通路。TGF-β磷酸化GSK-3β特定丝氨酸残基可导致其失活,进而诱导snail家族转录抑制因子1(snail family transcriptional repressor 1,Snail1)在细胞核中积累,而Snail1积累可导致其相应基因的表达显著升高,随之其转录效应显著增加,最终肾脏间充质细胞特异性蛋白(如α-SMA)的表达量增加,促进EMT发生[31]。KANLAYA等[32]研究指出,具有抗纤维化特性的儿茶素可通过GSK-3β/β-catenin/Snail1通路减弱肾小管细胞中TGF-β1诱导的EMT。 因此,GSK-3β很可能是通过TGF-β/Smad信号通路介导EMT来影响DN的发生发展,但具体机制还有待进一步研究。

2.2.2 GSK-3β通过介导Wnt/β-catenin信号转导通路参与EMT

Wnt/β-catenin信号通路是生物体内必不可少的信号通路,在DN患者发生EMT过程中发挥关键作用[33]。β-catenin是Wnt信号转导不可或缺的转录共激活因子,在无Wnt信号因子的刺激下,β-catenin在细胞质中受到由支架蛋白、酪蛋白激酶1和GSK-3β组成的支架蛋白复合体的抑制,其中GSK-3β可导致β-catenin氨基末端磷酸化和失活。GSK-3β通过与β-catenin的丝氨酸和苏氨酸位点靶向结合使β-catenin磷酸化,磷酸化的β-catenin可被识别并由泛素介导的蛋白酶体降解,从而无法进行核易位以到达靶基因而发挥作用[34]。当高糖诱导或各种细胞间刺激因子激活Wnt信号通路时,Wnt配体可与跨膜蛋白Frizzled (FZD)受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(low density lipoprotein receptor-associated protein 5/6,LRP5/6)结合激活Wnt信号通路,随之Wnt-FZD-LRP5/6复合物被散乱蛋白磷酸化并激活,激活的Wnt-FZD-LRP5/6复合物靶向调控支架蛋白复合物,导致GSK-3β磷酸化和β-catenin去磷酸化,从而导致β-catenin在细胞质溶胶中积累[35]。随后,积累的β-catenin被转移到细胞核,并通过T淋巴细胞因子/淋巴增强因子激活Wnt靶基因[33]。Wnt靶基因表达产物在体内通过参与多种生理机制引起肾脏细胞发生EMT,进而导致DN的进展[36]。

GSK-3β通过Wnt/β-catenin通路在肾脏细胞EMT的发生与进展中发挥重要的作用。CHANG等[37]研究发现,雷公藤处理后的糖尿病大鼠肾组织中Wnt-1、β-catenin及磷酸化GSK-3β的蛋白表达水平显著降低,GSK-3β的Tyr216位点磷酸化并使GSK-3β的活性受到抑制,进而改善了糖尿病诱导的大鼠肾脏功能障碍和结构损伤。LEE等[38]在研究高糖诱导的EMT功能障碍与肾近端小管细胞中的GSK-3β、Snail1和β-catenin关系中指出,高糖和氯化锂可阻断Snail1和β-catenin活化,高糖可通过GSK-3β、Snail和β-catenin 诱导EMT。有研究表明,GSK-3β在Wnt/β-catenin信号通路中与TGF-β也存在一定的联系,GSK-3β抑制剂和Wnt信号通路的激活可减弱肾小球间充质细胞中TGF-β1介导的细胞外基质积累,进而影响EMT过程[39]。相反,TGF-β 可以通过抑制GSK-3β对β-catenin和Wnt信号转导通路的激活来影响 EMT相关的DN过程[40]。

综上,GSK-3β可能通过Wnt/β-catenin信号通路影响EMT的发生发展,从而影响DN的进展。

2.2.3 GSK-3β通过介导integrins/ILK信号转导通路参与EMT

ILK是一种细胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其与β-catenin相互作用参与细胞周期、细胞凋亡、细胞增殖和细胞运动等多种细胞生理活动,这些作用与ILK的下游信号通路有关。ILK可直接磷酸化下游效应激酶Akt、p38丝裂原激活的蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)和GSK-3β,导致β-catenin积累,进而引起EMT的发生[41]。

有研究发现,ILK/β-catenin通过与其他信号通路相互作用调控GSK-3β水平,参与EMT的发生发展[23]。ILK可磷酸化Ser9位点使GSK-3β失活,失活的GSK-3β减少了β-catenin磷酸化,促进β-catenin在细胞质与细胞核内聚集,诱导靶基因的表达,促使EMT发生。有研究表明,贝那普利可降低高糖诱导的体内外TGF-β1和ILK的表达;在高糖条件下,ILK可以单独或协同调节足细胞中α-SMA的表达,进而影响GSK-3β的表达,从而通过调节EMT影响DN的发生发展[42]。白志勋等[43]研究表明,ILK作为TGF-β1信号通路下游的重要效应因子,可诱导成纤维细胞特异标志物FSP-1的表达,促进肾脏成纤维细胞增生,导致肾脏间质纤维化的形成;通过敲除ILK基因可以阻断TGF-β1诱导FSP-1表达,下调GSK-3β,减轻EMT。因此,推测抑制ILK表达可能会阻断EMT和TGF-β诱导的DN。

综上,TGF-β、ILK和Wnt信号通路参与GSK-3β的磷酸化和β-catenin的激活,从而导致 EMT转录程序的激活,最终影响DN的发生发展。

2.2.4 GSK-3β通过介导其他信号转导通路参与EMT

GSK-3β不仅参与以上3种信号通路,还参与p38 MAPK、PI3K/Akt等信号转导通路。p38 MAPK可以从细胞质转运到细胞核,调节转录因子活性,在肾脏足细胞EMT中起关键作用。p38 MAPK作为一种下游激酶,p38 MAPK通路可被多种方式激活[44]。有研究报道,p38 MAPK可通过细胞外信号调节蛋白激酶激活GSK-3β的Thr43位点(但不影响 GSK-3β活性)导致β-catenin的积累,从而在肾小管EMT中发挥重要作用[45-46]。因此,磷酸化氨基酸位点不同,所对应的GSK-3β活性也有差异。Akt是GSK-3β上游的蛋白激酶,可被PI3K磷酸化激活,激活的 Akt可以反向调节 GSK-3β。有研究报道,连翘苷可通过激活 PI3K/Akt 信号通路抑制GSK-3β活性[47]。RAI等[48]研究发现,四甲基吡嗪可通过激活Akt信号通路,增加Akt磷酸化水平,降低GSK-3β磷酸化水平,稳定β-catenin的活性,进而抑制EMT的进展。

GSK-3β可参与其他信号通路介导EMT的发生发展,但这些信号通路与TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin及integrins/ILK信号通路存在一定联系,形成一个机制网络,共同影响DN的过程。

3 结论

GSK-3β通过TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin和integrin/ILK等多个信号转导通路参与肾组织细胞EMT的过程,影响DN的进展。DN是引起慢性肾病和终末期肾病的重要原因,持续性蛋白尿和肾小球滤过率下降常会导致患者心脑血管事件及病死率增加。对于DN相关的未知生物学标志物及其机制,也需不断探索,相信随着研究的不断深入,会有更多有关DN的发病机制和生物学标志物被发现。