基于代谢组学和肠道菌群研究黄芪甲苷对心肌梗死大鼠的作用

闫俊元，钟鑫勤，赵玉翠，王小莹

天津中医药大学中药学院，天津 301617

心肌梗死是指因冠状动脉出现阻塞，心脏肌肉因缺乏血液供应出现坏死，使心脏功能受损的一种病症。临床表现一般为胸痛为主、呼吸短促、心绞痛等[1-2]。其主要发作原因为冠状动脉脂肪物质的堆积，进而造成冠状动脉的堵塞[3]。近些年，心肌梗死因具有极高的患病率和死亡率，已成为影响全球人类健康的重要因素之一[4-5]。目前全球公认的治疗手段为服用阿司匹林、硝酸甘油和抗高血压药物，治疗机制为分解血凝块、降低血压以及降低心脏需氧量[3]。虽然这些药物具有较好的药效，但也伴随着较多的不良反应。阿司匹林会伴随肠胃不适以及耐药性[6]，β 受体阻断剂的不良反应包括直立性低血压、心动过缓、诱发支气管痉挛、加重慢性支气管炎症等[7]。因此，目前临床采用化学药物治疗心肌梗死的策略仍有改善空间。近些年，中医药治疗逐渐得到大众认可[8]。

2.2 不同b值下的诊断指标 对不同b值下肺部结节良恶性的相关诊断指标进行统计，结果显示，b值为400 s/mm2时特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值均为最高，而b值为400或800 s/mm2时，其敏感度均为91.28%，不同b值间敏感度相比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

黄芪始载于《神农本草经》，性温味甘，归肺脾经，具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌的功效[9-10]。中医临床中，通常用黄芪与其他中药配伍进行心血管病治疗。研究发现，黄芪桂枝五味加减方在临床上可以改善心肌病患者的心功能[11]；防己黄芪汤加麻黄可以显著改善慢性心衰患者病情[12]。黄芪甲苷是黄芪的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、促进血管生成的药理作用[13-14]。黄芪甲苷可以通过抑制Toll 样受体4（Toll-like factor 4，TLR4）/髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路缓解心肌梗死导致的炎症反应，改善心功能指标[15]。此外，黄芪甲苷能够通过抑制miRNA-1 介导的炎症和自噬，从而抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）导致的心功能不全[16]。虽然目前关于黄芪甲苷对心肌梗死治疗效果的研究相对完善，但是治疗机制以及量-时-效关系方面还有很多可以探究的空间。因此，本研究旨在利用药效学指标探究黄芪甲苷量-时-效关系，并且利用非靶向代谢组学探讨其治疗机制通路，为今后临床用药提供理论依据。

1 材料

1.1 动物

SPF 级雄性SD 大鼠，体质量（220±10）g，购自北京维通利华动物实验中心，动物许可证编号SCXK（京）2016-0011。动物饲养于SPF 级动物房，自由进水饮食。动物实验经天津中医药大学伦理委员会批准（批准号TCM-LAEC2020089）。

对于搜集时已初步理解的内容，学生只要抓住教师的重点观点和内容，去掉无用信息，比对自己的理解和老师的讲解有哪些差距，找到欠缺的方面，加深课本内容的理解，课后就可以节约复习时间。

对照组给予头孢曲松治疗，静脉给予注射用头孢曲松钠（上海罗氏制药有限公司，国药准字H10983036，1.0 g/支，批号 SH6345、SH6314），每次80 mg/kg，每日1次。

1.2 药品与试剂

黄芪甲苷（质量分数为98%，批号AB0162-1000）购自埃法生物有限公司；10%多聚甲醛（批号3501）购自北京益利精细化学品有限公司；无水乙醇、二甲苯、苯胺蓝、盐酸、氨水、中性树脂、生理盐水（批号10009259、10023418、71003644、10011018、10002108、10004160、69900793）购自国药集团化学试剂有限公司；苏木素-伊红染液（批号G1076）购自武汉谷歌生物科技；磷钨酸、磷钼酸（批号3705、3790）购自天津市大茂化学试剂厂；PBS 缓冲液、十二烷基硫酸钠、Tris、甘氨酸、过硫酸铵、聚山梨酯20、MRS 肉汤（批号P1020、S8010、T8060、G8200、A1030、T8220、M8540）购自北京索莱宝生物科技有限公司；肌酸激酶（creatine kinase，CK）、心肌钙蛋白T（cardiac troponin-T，CTn-T）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）ELISA 试剂盒（批号MM-20460R1、MM-0795R1、MM-0873R1）购自江苏酶免实业有限公司；甲醇、乙腈、蛋白酶抑制剂（批号R40121、4340863、36978）购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；异丙醇、Immobilon Western 化学发光HRP 底物、PVDF 膜（批号34863、WBKLS、IPVH00010）购自Merck 公司；2-氯-L-苯丙氨酸（批号B25643）购自上海源叶生物科技生物有限公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（批号AR1189）购自博士德生物工程有限公司；RIPA 强裂解液、SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液（批号P0013B、P0015L）购自江苏碧云天生物技术公司；磷酸酶抑制剂（批号K1015）购自APExBio 生物科技有限公司；酪氨酸激酶2（Janus kinase2，JAK2）、p-JAK2、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、JAK1抗体（批号AF6022、AF3024、DF6087、AF5012）购自 Affinity 公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体、HRP 标记的山羊抗小鼠IgG 二抗（批号ABS132004、ABS20163）购自北京爱必信生物技术有限公司；信号传导转录激活因子6（signal transducer and activator of transcription 6，STAT6）、p-STAT6 抗体（批号ab217998、ab263947）购自英国Abcam 公司；HRP 标记的山羊抗兔IgG 二抗（批号14786）购自美国CST 公司；Stripping Buffer（批号CW0056S）购自北京康为世纪生物科技有限公司；DNA 抽提试剂盒（批号D6538）购自美国Bio-Tek 公司。

1.3 仪器

MX-F 型涡旋混合器（Servicebio Technology 公司）；JA1003 型千分之一电子天平（上海恒平科技仪器有限公司）；MDF-F-682 型−80 ℃低温冰箱（Panasonic 电器有限公司）；BCD-256KT 型−20 ℃冰箱（青岛海尔股份有限公司）；PL6500 型4 ℃冰箱、Legend Micri17R 型高速冷冻离心机、EVOS M7000 型细胞成像系统、UHPLC 液相色谱系统、质谱仪、NanoDrop2000 型超微量分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；DK-98-11A 型电热恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）；INFINIRE M200型多功能酶标仪（Nano Quant公司）；Vevo2100型小动物超声实时影像系统（加拿大Visual Sonics公司）；CN6-180 型超声波清洗机（宁波新芝生物科技公司）；DNP-9082 型电热恒温培养箱（苏州威尔实验有限公司）；R500 型动物呼吸麻醉机（瑞沃德生命科技有限公司）；台式快速离心浓缩干燥器（太仓市华美生化仪器厂）；氮气吹扫仪（上海净信实业发展有限公司）；ES1000 型热盖金属浴（杭州瑞诚仪器有限公司）；552BR070914 小型垂直电泳槽、基础电泳仪（美国Bio-Rad 公司）；组织研磨仪（武汉赛维尔生物科技有限公司）；多功能成像分析系统（美国GE 公司）；PCR 仪（美国ABI 公司）；MISEQ测序仪、HISEQ 测序仪、Illumina MiSeq Platform（美国Illumina 公司）；微型荧光计（美国Turner Bio Systems 公司）。

2 方法

2.1 黄芪甲苷对心肌梗死大鼠的量-时-效关系考察

2.1.1 心肌梗死大鼠的模型建立及心功能评价 大鼠适应性饲养1 周后，术前禁食12 h，根据体质量腹腔麻醉后进行手术，在心脏处从外皮依次分离至胸肌，在左胸第4 肋间处用止血钳撑开胸廓，肉眼可见心脏；将心包膜破开，挤压右胸使心脏暴露于胸壁外；持提前备好浸没于生理盐水的5/0 无损伤丝线结扎冠状动脉左前降支。结扎后再次撑开胸廓令心脏跳回胸腔，松开止血钳使胸肌和外皮恢复闭合，排空空气后关闭胸腔，以2/0 无损伤丝线分别缝合肌层及皮肤。假手术组采用同样方法开胸腔挤出心脏，以5/0 丝线只穿过不结扎，之后进行排气缝皮。手术操作后将大鼠仰面朝上平躺放至电热毯，待其苏醒后放回鼠笼进行常规饲养。

传统的节日和节俗历史悠久，源远流长，集中体现了中华传统文化的核心价值，生动展示了中国人丰富多彩的精神世界，是民族特色和民族个性的具体反映。 同时，它们与民众生活密切相连，深具活力和影响力，是活态的传统文化表现形式，并在世代传承中起到加强血缘和社会纽带、促进团结与文化认同的作用。 它们记录着中华民族数千年的历史，凝聚了民众的生活和情感，以全民参与的方式传承文化血脉、提振民族精神、强化历史记忆，具有深刻的意义和深远的影响。 绚丽多彩的节日，是我国人民代代传承的珍贵文化，也是世界文明的瑰宝。 它们照亮了五千年的历史，也照耀着未来的天空。

所有大鼠造模1 d 后进行心动超声检测。运用超高分辨率小动物超声实时影像仪检测大鼠左心室功能，将大鼠放置于小动物麻醉盒中进行气体麻醉，麻醉后将大鼠用胶带绑于操作台，操作台向右下倾斜30°，调整探头，利用B 型超声切面获得左心室、主动脉和二尖瓣瓣叶图像，进一步切换至M 超声界面，并调整取样线的位置，截取M 界面超声图像，通过对大鼠收缩期和舒张期进行测量，获得左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左室短轴缩短率（left ventricular fraction shorting，LVFS）、左心室后壁（left ventricular posterior wall，LVPW）等。采用射血分数（ejection fraction，EF）数值＜55%作为造模成功评判标准，予以保留分组，不符合条件的大鼠予以剔除。

2.1.2 动物分组、给药及给药后心功能评价 取8只正常SD 大鼠作为空白组，经过假手术操作的8只大鼠作为假手术组，将造模成功的大鼠分为模型组及黄芪甲苷低、中、高剂量（10、20、40 mg/kg）组和阿托伐他汀（20 mg/kg）组，每组8 只。各给药组ig 相应药物（5 mL/kg），对照组、假手术组和模型组ig 等体积的水，1 次/d，连续给药14、28 d。给药后心功能评价方法同“2.1.1”项。

2.1.3 样品采集 各组大鼠分别于各组时间点取材。大鼠麻醉后腹主动脉取血，分离血清，放置于−80 ℃冰箱。取血后迅速取下心、肺、肝、脾、肾，每组随机取3 只大鼠的心脏放入10%多聚甲醛固定，用于病理染色。其余迅速放入冻存管，置于液氮过夜，放入−80 ℃冰箱保存。分别于给药14、28 d 采集各组大鼠粪便样本，用75%乙醇消毒的镊子和无菌EP 管取大鼠新鲜粪便2～3 粒，放于−80 ℃冰箱保存。

2.1.4 ELISA 检测血清中CK、CTn-T、LDH 水平根据试剂盒说明书检测各组大鼠血清中CK、CTn-T、LDH 水平。

节庆型滨水动态人文景观活动主要包括水上飘色、龙舟活动、各水神诞、行通济、水陆法会和中秋赏月等等活动。其中，（图3、表2）是对节庆型传统滨水动态人文景观活动的活动类型、活动时间、主要行为、主要载体及活动性质的初步总结。

（1）HE 染色：取病理切片，二甲苯脱蜡2 次，无水乙醇清洗2 次，梯度乙醇冲洗，自来水洗，然后用苏木素染色，10%盐酸乙醇分化，再用稀氨水返蓝，伊红染色，脱水，二甲苯处理后封片，于显微镜下观察并拍照。

3.2.2 差异代谢物鉴定与筛选 通过数据库的对比与分析，鉴定得到化合物，进一步筛选给药后回调代谢物。通过比较筛选找出给药后回调的代谢物共有48 个差异代谢物（表4）。

2.2 黄芪甲苷治疗心肌梗死的作用机制研究

2.2.1 样品预处理 根据结果，选取给药28 d 后空白组、模型组、黄芪甲苷中剂量组大鼠血清进行后续实验。吸取50 μL 血清样品，加入200 μL 预冷的色谱纯乙腈，4 ℃、13 000 r/min 离心10 min。吸取上清液，真空干燥，用含内标物（2-氯-L-苯丙氨酸）的100 μL 乙腈-水（3∶1）复溶后，4 ℃、13 000 r/min 离心15 min，吸取上清液至进样瓶中，上机并进行分析。

2.2.2 LC-MS 检测

（1）色谱条件：Waters Acquity UPLC HSS T3 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 µm），流动相A 为95%水＋5%乙腈（含0.1%甲酸），流动相B 为47.5%乙腈＋47.5%异丙醇＋5%水（含0.1%甲酸）。正离子梯度洗脱程序：0～3 min，0～20% B；3～4.5 min，20%～35% B；4.5～5 min，35%～100% B；5～6.3 min，100% B；6.3～6.4 min，100% B～100% A；6.4～8 min，100% A。负离子梯度洗脱程序：0～1.5 min，0～5%B；1.5～2 min，5%～10% B；2～4.5 min，10%～30%B；4.5～5 min，30%～100% B；5～6.3 min，100% B；6.3～6.4 min，100% B～100% A；6.4～8 min，100%A。体积流量0.40 mL/min；进样量4 μL；柱温40 ℃。

（2）质谱条件：样品质谱信号采集采用正负离子扫描模式，扫描范围为m/z70～1 050。鞘气体积流量为50 arb，辅助气体积流量为13 arb，辅助气加热温度为425 ℃，正模式离子喷雾电压设置为3 500 V，负模式离子喷雾电压设置为−3 500 V，离子传输管温度为325 ℃，归一化的碰撞能为20、40、60 V 循环碰撞能。一级质谱分辨率60 000 Hz，二级质谱分辨率7 500 Hz，采用DDA 模式采集数据。

2.2.3 数据处理 采用代谢组学软件Progenesis QI进行峰提取、对齐、鉴定等，最终得到含保留时间、峰面积、质荷比以及鉴定信息的数据矩阵。并通过该软件特征峰进行搜库鉴定，将MS 和MS/MS 质谱信息与代谢数据库进行匹配，设定MS 误差小于1×10−5，同时根据二级质谱匹配得分鉴定代谢物。所用数据库包括http://www.hmdb.ca/、https://metlin.scripps.edu/等主流公共数据库以及平台自建的数据库。将相关代谢物代入Ingenuity Pathway Analysis 数据库进行分析。

2.2.4 Western blotting 检测心肌组织IL-6、JAK1、JAK2、p-JAK2、STAT6、p-STAT6 蛋白表达 取给药28 d各组大鼠左心室样品加入裂解液破碎，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，吸取上清液进行蛋白定量，100 ℃加热10 min 使蛋白变性。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，于5%脱脂牛奶中封闭90 min，分别加入一抗，4 ℃摇床孵育过夜，TBST 洗涤3 次，加入二抗孵育2 h，TBST 洗涤3 次，显色曝光。

2.3 黄芪甲苷对大鼠肠道微生物多样性的改善作用研究

2.3.1 DNA 抽提和PCR 扩增 根据结果，取给药28 d 后空白组、模型组、黄芪甲苷中剂量组大鼠粪便进行后续实验。根据E.Z.N.A.®soil 试剂盒说明书进行操作提取DNA，对V3～V4 可变区进行PCR扩增，扩增程序为95 ℃、3 min，随后27 个循环（95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s），最后72 ℃、10 min。扩增体系总体积为20 μL。

转发锦鲤的背后，是人们对吉祥欢乐、好运的向往，尽管只有千万分之几乃至更低的中奖几率，这种人性的需求是不会过时的。此外，转发一条企业的相关微博，并不需要很高的成本，也不需要花费很多的时间成本，因此即便是小概率的中奖几率，加上锦鲤的寓意以及吸引力极强的礼单，使得人们都抱有试一试的心态，是一种“高投机性行为”。

3.1.2 各组大鼠心脏形态及病理观察 如图3、4 所示，给药14、28 d 的空白组、假手术组大鼠心脏形态正常，而模型组大鼠心脏的左前降支冠状动脉区域明显有大面积的梗死，心室部位变白梗死，心室壁显著变薄，心脏结构松散；各给药组大鼠心脏结构趋近正常，心室壁厚度也有明显改善。

2.3.3 生物信息学分析 基于Illumina HiSeq 测序平台对扩增的16S 区域特点构建相对应的小片段文库进行双末端测序。通过对Reads 拼接滤过，使用UPARSE 软件（ version 7.1 http://drive5.com/uparse/），通过97%的相似度对序列进行操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）聚类，且在聚类的过程中去除单序列和嵌合体。对序列进行注释并设定阈值为70%根据数据库对其进行比对，同时采用α 多样性分析、β 多样性分析等比较各组之间的差异，挖掘心梗对肠道微生物的影响以及黄芪甲苷对心梗大鼠肠道微生物的改善作用。

2.3.4 益生菌丰度体外验证实验 黄芪甲苷用MRS 肉汤配制0.500 000、0.250 000、0.125 000、0.062 500、0.031 250、0.015 625 mg/mL 的给药溶液，在96 孔板中分别加入100 μL 最佳稀释倍数的Lactobacillus_johnsonii菌液以及100 μL 药液，放入酶标仪中，设置25 个循环，每循环2 h，波长600 nm，温度37 ℃，测定吸光度（A）值。

2.4 统计学分析

使用SPSS 17.0 软件进行统计分析，实验结果以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。

3 结果

3.1 黄芪甲苷对心梗大鼠的量-时-效关系

3.1.1 黄芪甲苷对心肌梗死大鼠心功能的影响 给药14 d 后，如图1 所示，与空白组和假手术组比较，模型组大鼠左心室容积明显扩张，左室壁显著变窄，收缩能力减弱。如表1 所示，与假手术组比较，模型组大鼠EF、FS 显著降低（P＜0.001）；与模型组比较，黄芪甲苷中、高剂量组大鼠EF、FS 均显著改善（P＜0.05、0.01、0.001）。

表1 给药14 d 各组大鼠EF 和FS (±s )Table 1 EF and FS of rats in each group after 14 d of administration (±s )

表1 给药14 d 各组大鼠EF 和FS (±s )Table 1 EF and FS of rats in each group after 14 d of administration (±s )

组别 剂量/(mg·kg−1) n/只 EF/% FS/%空白 — 8 79.170±5.705 49.723±5.698假手术 — 8 77.391±4.226 47.730±4.229模型 — 8 35.900±10.519*** 18.121±5.903***黄芪甲苷 10 8 55.030±12.162 30.261±8.179##20 8 60.937±10.254## 34.378±7.619###40 8 58.798±12.352# 32.609±8.427###阿托伐他汀 20 8 63.672±11.047## 36.341±7.842###

与假手术组比较：**P＜0.01 ***P＜0.001；与模型组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001，下表同。**P < 0.01 ***P < 0.001 vs sham group; #P < 0.05 ##P < 0.01 ###P <0.001 vs model group, same as below tables.

图1 给药14 d 各组大鼠超声M 模式图Fig.1 Ultrasonic M-mode long axis section of rats in each group after 14 d of administration

给药28 d 后，如图2 所示，相比于给药14 d组，模型组左心室损伤更加严重，且各给药组可明显改善。由表2 可知，与假手术组相比，模型组EF、FS 显著降低（P＜0.001）；与模型组相比，黄芪甲苷低、中、高剂量组的EF、FS 均显著改善（P＜0.01、0.001）。

表2 给药28 d 各组大鼠EF 和FS (±s)Table 2 EF and FS of rats in each group after 28 d of administration (±s)

表2 给药28 d 各组大鼠EF 和FS (±s)Table 2 EF and FS of rats in each group after 28 d of administration (±s)

组别 剂量/(mg·kg−1) n/只 EF/% FS/%空白 — 8 82.280±4.603 52.947±5.191假手术 — 8 81.628±5.544 52.242±6.262模型 — 8 34.486±7.032*** 17.456±3.941***黄芪甲苷 10 7 51.176±10.003## 27.604±6.153##20 6 58.390±10.871### 32.681±7.613###40 7 52.452±13.357### 29.021±10.069##阿托伐他汀 20 8 50.888±10.315## 27.516±6.677##

图2 给药28 d 各组大鼠超声M 模式图Fig.2 Ultrasonic M-mode long axis section of rats in each group after 28 d of administration

2.3.2 Illumina Miseq 测序 PCR 产物利用Axy Prep DNA Gel Extraction Kit 进行纯化，Tris-HCl 洗脱，2%琼脂糖电泳检测。利用Quanti Fluor™-ST 进行检测定量。PE 2×300 文库为上海美吉生物医药科技有限公司根据Illumina MiSeq 平台标准操作规程将纯化后的扩增片段所构建。

2.1.5 心脏病理染色

图3 给药14 d 各组大鼠心脏形态 (A)、HE 染色 (B) 和Masson 染色 (C)Fig.3 Cardiac morphology (A), HE staining (B) and Masson staining (C) of rats in each group after 14 d of administration

图4 给药28 d 各组大鼠心脏形态 (A)、HE 染色 (B) 和Masson 染色 (C)Fig.4 Cardiac morphology (A), HE staining (B) and Masson staining (C) of rats in each group after 28 d of administration

HE 染色结果显示，空白组、假手术组心脏形态规整，心肌细胞形态正常，无严重细胞破损情况；模型组心室部位有大面积梗死，并有心室腔扩大、心室壁变薄的现象，梗死区域心肌细胞坏死现象严重，大部分细胞发生炎性浸润、水肿，细胞形态不整齐；与给药14 d 模型组比较，给药28 d 模型组更加严重；给药14 d 黄芪甲苷低、中剂量组相比模型组改善作用不明显；给药14 d 黄芪甲苷高剂量组恢复较明显，心室壁变厚，梗死面积缩小，炎性浸润减少；给药28 d 黄芪甲苷低剂量组改善效果不明显，而给药28 d 黄芪甲苷中、高剂量组改善效果较好，炎性浸润明显减少。

Masson 染色结果显示，模型组胶原纤维沉积最严重，且给药28 d 的模型组更严重。给药14 d 黄芪甲苷低剂量组胶原纤维沉积略有减少，心室腔以及心室壁有所改善；给药14 d 黄芪甲苷中、高剂量组和阿托伐他汀组改善效果非常明显，胶原纤维沉淀明显减少。与给药28 d 模型组比较，黄芪甲苷低剂量组和阿托伐他汀组的改善效果并不明显；而黄芪甲苷中、高剂量组改善明显。

Graham的本职工作是音乐制作人，在摄影方面他是个新手，但这丝毫不会阻碍他的全情投入。他平时最常用的一台相机是索尼 Sony A7 II，对他而言，电子取景器是必不可少的功能之一。伦敦相机交易所在Bristol的鲍德温街有一家分店，Graham和Craig都是这家店的客户。而这家分店正好有多余的索尼相机可以提供，趁此便利，Graham在本次拍摄中取来了一台最新的索尼A9，想要感受一下这台旗舰级相机。

3.1.3 各组大鼠心梗标志物水平 如表3 所示，给药28 d，与假手术组比较，模型组大鼠血清中心梗标志物CK、CTn-T、LDH 水平显著升高（P＜0.01、0.001）；与模型组比较，黄芪甲苷各剂量组心梗标志物水平均显著降低（P＜0.05、0.01、0.001）。综合结果可知，给药28 d 治疗效果优于给药14 d，且给药28 d 黄芪甲苷中剂量组效果最优，因此后续代谢组学和肠道菌群研究采用给药28 d 空白组、模型组、黄芪甲苷中剂量组的样品进行实验。

实施创新驱动战略，关乎东营市经济社会发展全局和“两个率先”进程，必须在工作推进上有更大力度，在政策支持上有更大举措，在营造环境上有更大作为。围绕“黄蓝两大战略”和“两个率先”目标任务要求，应当加快探索对策措施，有效促进科技与经济社会衔接融合，推动区域发展向创新驱动转变。

表3 给药28 d 各组大鼠血清中CK、CTn-T 和LDH 水平 (±s)Table 3 CK, CTn-T and LDH levels in serum of rats in each group after 28 d of administration (±s)

表3 给药28 d 各组大鼠血清中CK、CTn-T 和LDH 水平 (±s)Table 3 CK, CTn-T and LDH levels in serum of rats in each group after 28 d of administration (±s)

组别 剂量/(mg·kg−1) n/只 CK/(ng·L−1) CTn-T/(ng·L−1) LDH/(ng·L−1)空白 — 8 148.533±8.769 39.434±3.008 26.381±0.306假手术 — 8 157.700±5.602 38.524±1.893 25.153±0.981模型 — 8 170.890±6.211** 47.475±4.482*** 29.296±1.468***黄芪甲苷 10 7 150.895±3.732### 41.229±2.100## 26.788±1.284###20 6 151.295±9.257### 39.032±3.297## 26.495±0.708###40 7 154.723±3.157## 42.188±3.687# 26.474±0.710###阿托伐他汀 20 8 169.804±8.639 46.336±5.329 28.391±0.333

3.2 黄芪甲苷治疗心肌梗死的作用机制研究

3.3.1 物种组成分析 如图8 所示，与空白组比较，模型组 unclassified_f_Oscillospiraceae、g_Adlercreutzia、g_Papillibacter、g_Rodentibacter属水平丰度显著降低（P＜0.05），g_Dubosiella、g_Dorea属水平丰度显著上调（P＜0.05）；与模型组比较，黄芪甲苷中剂量组unclassified_f_Oscillospiraceae、g_Adlercreutzia、g_Papillibacter、g_Rodentibacter属水平丰度显著升高（P＜0.05），g_Dubosiella、g_Dorea属水平丰度显著下调（P＜0.05）。

图5 正 (A)、负 (B) 离子模式下质控样本的总离子流图Fig.5 Total ion flow of quality control sample under positive (A) and negative (B) ion modes

（2）Masson 染色：与HE 染色操作步骤相同，直至稀氨水返蓝后用丽春红染色，用冰醋酸水溶液浸洗，用磷钼酸分化，苯胺蓝染后脱水，二甲苯浸洗后封片，于显微镜下观察并拍照。

表4 黄芪甲苷给药后回调差异代谢物Table 4 Callback of differential metabolites after administration of astragaloside IV

3.2.3 差异代谢物影响的相关基因 利用IPA 对48个回调差异代谢物进行网络分析，构建“代谢物-靶点”网络（图6），可知代谢物参与的相关靶点及通路。其中，STAT6 经过磷酸化发挥调控免疫、炎症反应的作用，且其他靶点也多与炎症相关，如IL-6、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGFβ）等。

图6 给药后回调差异代谢物网络分析Fig.6 Network analysis of callback differential metabolites after administration

3.2.4 黄芪甲苷对心肌梗死大鼠心脏组织中IL-6/JAK/STAT6 通路相关蛋白表达的影响 如图7 所示，与假手术组比较，模型组大鼠心脏组织IL-6、p-JAK2/JAK2、p-STAT6/STAT6 和JAK1 蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05、0.001）；与模型组比较，黄芪甲苷中剂量组IL-6 和JAK1 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），黄芪甲苷低剂量组p-JAK2/JAK2蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），黄芪甲苷低、中剂量组p-STAT6/STAT6 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05、0.01）。

图7 黄芪甲苷对心肌梗死大鼠心脏组织中IL-6/JAK/STAT6 通路相关蛋白表达的影响 (±s , n = 3)Fig.7 Effect of astragaloside IV on expressions of IL-6/JAK/STAT6 pathway related-proteins in cardiac tissue of rats with myocardial infarction (±s , n = 3)

3.3 黄芪甲苷对大鼠肠道微生物多样性的改善作用

3.2.1 总离子色谱 正、负离子模式下，质控样品的总离子色谱图见图5。表明该检测条件下，峰形良好，分布相对均匀。

图8 属 (A)、种 (B) 水平物种组成组间差异Fig.8 Genus (A) and species (B) level differences between groups of species composition

与空白组比较，模型组 unclassified_f_Oscillospiraceae、uncultured_bacterium_g_Adlercreutzia等菌种水平丰度显著下调（P＜0.05 ），uncultured_bacterium_g_Dubosiella、uncultured_bacterium_g_Dorea等菌种水平丰度显著上调（P＜0.05）；与模型组比较，黄芪甲苷中剂量组unclassified_f_Oscillospiraceae、uncultured_bacterium_g_Adlercreutzia等菌种水平丰度显著上调（P＜0.05），uncultured_bacterium_g_Dubosiella、uncultured_bacterium_g_Dorea等菌丰度显著降低（P＜0.05）。

3.3.2 差异代谢物与肠道菌群结果联合分析 将肠道生物多样性结果与48 种代谢物进行联合分析，属水平物种g_Dubosiella、g_norank_f_Muribaculaceae与4-乙烯基苯酚硫酸盐、2-苯乙醇葡萄糖醛酸等代谢物呈正相关（P＜0.05、0.01）；与3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸、12-羟基十七烷酸等代谢物呈负相关（P＜0.05）；属水平物种g_Intestinimonas、g_Roseburia、Oscillospiraceae与苯甲酸、N-乙酰基对氨基苯甲酸、马尿酸等代谢物呈负相关（P＜0.05，图9）。

为确认SL-ASIA量表测量的有效性，本文将3个村寨获得的样本按各村寨人数比例随机分成人数基本相同的两组（Ecklund，2005；Reynolds，Ecklund &Terrance，2011）。使用一组样本借助探索性因子分析检验侗寨原住民的文化适应情况及内在维度，使用另一组样本借助验证性因子分析来交叉验证第一组样本里提出的维度模型，以观察和确认派生出的各个维度的内部一致性。

图9 属水平代谢组学和微生物组学联合分析Fig.9 Combined analysis of metabolomics and microbiome at genus level

3.3.3 益生菌体外验证 0～12 h，各质量浓度的黄芪甲苷可在体外上调益生菌Lactobacillus_johnsonii种水平丰度，且0.062 500 mg/mL 的黄芪甲苷促进益生菌生长程度最明显（图10）。

图10 0～12 h 内Lactobacillus_johnsonii 生长程度Fig.10 Degree of Lactobacillus_johnsonii growth in 0—12 h

4 讨论

目前临床中治疗心肌梗死的常用药为β 受体阻滞剂[17-18]，可通过降低心肌细胞收缩力的负性肌力等作用，减少心肌耗氧量[19]。但此类药物的临床治疗需要在患者发病短时间内使用小剂量治疗并长时期使用才可降低患者发病率及死亡率[20]，且在停药之后会出现心绞痛等严重不良反应[21]。中医药治疗因具有多成分、多靶点且不良反应较小的特点，逐渐得到大众认可。防己黄芪汤是中医临床治疗心血管疾病的常用方之一，课题组前期已探讨防己黄芪汤加减方对心血管疾病的治疗作用，本研究拟探究其君药黄芪的主要有效成分的量-时-效关系及作用机制，为新药开发及组分中药开发提供理论依据。

阿东心里一直都悲伤着。听罗爹爹跟母亲唠叨，像他们活着时那样说话，便心生感动。再听到后面两句，他险些想笑了。

综上,对任意的ε>0,存在N,当n>N时, ρG(xn,1)

在体内实验中，通过检测超声心动图，发现相比给药14 d 模型组，给药28 d 模型组更严重；且给药14 d 黄芪甲苷中、高剂量组EF、FS 有明显改善，给药28 d 黄芪甲苷各剂量组均可显著改善EF、FS，由此证明黄芪甲苷可以改善左前降至结扎手术所致心肌梗死的心脏收缩能力，且给药28 d 效果优于给药14 d。根据病理染色发现，模型组大鼠心脏左心室腔明显扩张，炎性浸润严重，正常区域也伴随着细胞水肿的现象，且给药28 d 模型组比给药14 d 更严重；给药14 d 仅黄芪甲苷高剂量组改善较明显，炎性浸润显著减少，梗死面积变小；而给药28 d 黄芪甲苷中、高剂量组均可明显改善，梗死面积明显减少，且心肌纤维化明显改善。研究表明，心肌梗死过程中，早期的炎症是诱导坏死心肌修复的必然条件，但坏死细胞诱导的过度且长时间炎症会导致不可逆的持续性损伤和坏死区域扩大，甚至导致心肌纤维化，造成心衰[22]。据报道，黄芪甲苷可通过促进损伤细胞自噬，从而抑制其诱导炎症反应，防止进一步加重病情[16]。CK、CTn-T 和LDH 在临床中通常可作为预测心肌梗死的指标[23-26]。黄芪甲苷可以显著减少给药28 d 大鼠血清中心梗标志物，且中剂量组效果最优。综合结果判断量-时-效关系，认为给药28 d 治疗效果优于给药14 d。

根据非靶向代谢组学结果可知，黄芪甲苷给药后可回调血清内48 种回调代谢物水平，而其中部分代谢物的作用已有文献记载，例如吉马酮代谢物在给予黄芪甲苷后相比模型组显著升高，此类代谢物具有抗炎、抗氧化应激、抗肿瘤等药理作用，可以抑制模型大鼠IL-6、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表达，并且上调TGFβ1 和IL-10 水平发挥抗炎活性[27]。模型组肾上腺素红代谢物含量显著升高，给予黄芪甲苷后降低，研究表明肾上腺素红会显著降低大鼠心率和冠状动脉血流量[28]。将48 个回调代谢物进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，结果表明主要与苯丙氨酸代谢、抗坏血酸和醛酸代谢等相关。其中，苯丙氨酸代谢与心血管疾病有密切联系。血浆中苯丙氨酸水平升高也是预测临床心衰患者死亡率的重要标准之一[29]。通过IPA 数据库分析出的靶点图发现，STAT6、整合素αM（integrin alpha M，ITGAM）、IL-6、IL-1β 等靶点多与炎症相关。且据报道，重要代谢物吉马酮可以通过调控JAK/STAT 通路诱导人肝癌HepG2 细胞凋亡[30]，而且还可以通过抑制IL-6、NF-κB 等通路上游细胞因子发挥抗炎作用[27,31]。此外，JAK/STAT 通路与苯丙氨酸代谢密切相关[32]，可通过STAT 酪氨酸突变为苯丙氨酸来抑制IL-6 的信号传导，密切参与炎症反应[33]。因此，下一阶段实验针对IL-6/JAK/STAT6 这一通路进行验证。Western blotting 结果显示，黄芪甲苷可以显著抑制心脏组织IL-6 表达，进而导致抑制JAK2 和STAT6的磷酸化。在筛选JAK 其他亚型时，发现心脏组织中JAK1 表达有显著的变化趋势。与假手术组比较，模型组JAK1 蛋白表达水平显著升高，黄芪甲苷中剂量组JAK1 蛋白表达水平显著降低。研究表明，JAK1 总蛋白的激活会诱导JAK2 的磷酸化[34-35]。此外，Chen 等[36]研究发现，JAK1 总蛋白表达量与细胞自噬程度呈正相关，而黄芪甲苷具有调控自噬作用，可以通过抑制过度自噬，从而达到减少损伤的效果[37-39]。推测黄芪甲苷不仅通过 IL-6/JAK2/STAT6 信号通路抑制心梗炎症反应，还可通过抑制JAK1 总蛋白表达，抑制对JAK2 蛋白的促磷酸化作用，并且调控细胞自噬，减缓病情加重。

由表1及表2可知,所测CO2浓度误差百分比控制在2%以内,温度的误差百分比在4%以内,可以满足航站楼环境参数采集要求。

肠道菌群与心血管疾病之间有密切联系，心肌梗死的发生会导致肠道菌群组成改变，而菌群多样性的改善也会调节体内代谢物水平，辅助治疗心肌梗死[40]。结果表明，黄芪甲苷可以回调部分菌群丰度，且文献记载部分属水平菌群有明确作用。研究表明，在给予预防肥胖的药物后小鼠肠道微生物菌群中unclassified_f_Oscillospiraceae 丰度显著上调[41]。并且在谷维素缓解高脂肪高胆固醇饮食导致的高胆固醇脂血症实验中，unclassified_f_ Oscillospiraceae 的丰度也会因高脂血症减轻而上调[42]，而高脂肪饮食是导致心肌梗死、动脉粥样硬化等心血管疾病的重要因素[43]，由此预测此属菌群的上调会发挥预防肥胖的作用。g_Adlercreutzia可化学吸收IL-1β、IL-6，证明g_Adlercreutzia菌属水平增加可以减轻机体的炎症，缓解病情[44-46]。表明黄芪甲苷通过上调g_Adlercreutzia丰度发挥抗炎作用，改善心肌梗死。丁酸盐是g_Papillibacter的代谢产物[47]，而丁酸盐可以抑制机体炎症和氧化应激[48]。表明黄芪甲苷通过上调g_Papillibacter丰度增加代谢产物丁酸盐，从而抑制心肌梗死炎症及氧化应激。g_Dubosiella属丰度上升通常伴随着肠道炎症[49]，抑制产生短链脂肪酸的细菌生长，短链脂肪酸可维持肠道稳态和缓解炎症反应，增强肠道屏障完整性[50]，因此抑制这类细菌生长可发挥抗炎反应。g_Dorea的丰度与肥胖程度呈正相关[51]，而肥胖是导致动脉粥样硬化的重要因素之一。此外，将这48 种回调代谢物与肠道菌群属水平结果进行联合分析，发现unclassified_f_Oscillospiraceae 和g_Dubosiella菌群不仅与部分回调代谢物呈相关性，而且在给与黄芪甲苷后属水平丰度有明显改善。因此推测黄芪甲苷可通过改善肠道菌群，调节体内代谢物水平。在种水平菌群结果中发现，黄芪甲苷组体内Lactobacillus_johnsonii水平丰度有上调趋势，而Lactobacillus_johnsonii在体内具有抗炎、抗菌作用[52]。体外验证实验结果表明，黄芪甲苷可以显著促进Lactobacillus_johnsonii生长。综合量-时-效关系、作用机制以及肠道菌群结果推测，黄芪甲苷具有促进部分益生菌生长、改善肠道菌群的作用，回调体内代谢物水平，通过调控心肌IL-6/JAK/STAT6 信号通路，发挥抗炎以及调控自噬作用，从而改善心功能。

本研究探究了黄芪甲苷对心肌梗死大鼠的量-时-效关系，利用非靶向代谢组学和IPA 数据库分析其作用靶点，采用Western blotting 方法进行IL-6/JAK/STAT6 通路验证，并且探究黄芪甲苷对心梗大鼠肠道菌群的改善作用，为黄芪治疗心血管疾病提供理论依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突