陇西腊肉加工过程中亚硝胺与理化指标的相关性分析

范小宁,师希雄,包晓明,赵瑞娜,陈敬敬,郭雨轩

(甘肃农业大学 食品科学与工程学院,甘肃 兰州,730070)

陇西腊肉作为西北著名的腌腊肉制品,是以猪肉为主要原料,添加食盐、雪花盐、香辛料等,采用干腌法在0～7 ℃条件下腌制30～45 d,之后在8～13 ℃条件下晾晒35 d左右,待腊肉表面出油、皮面红亮则晾晒阶段结束,最终制成的陇西腊肉色泽鲜红、瘦而不柴、肥而不腻、腊味浓郁、咸香可口,深受广大消费者喜爱[1]。但传统陇西腊肉腌制时使用亚硝酸盐,在加工过程中易导致生物胺、亚硝胺等有害物质的生成,可能会为食品安全带来隐患[2]。其中国际癌症研究机构认定亚硝胺是强致癌物质,过量摄入会导致器官癌变,严重危害人体健康[3]。

亚硝胺是N-亚硝基类化合物的总称,其主要是通过亚硝酸盐与胺类物质反应生成,胺类物质可由蛋白质分解产生,亚硝酸盐可由硝酸盐转化生成,除此之外,加工过程中的pH值、食盐含量、丙二醛(thiobarbituric acid reactive substances, TBARS)、挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen, TVB-N)、水分含量等理化因素在一定程度上也调节着亚硝胺的生成[4-5]。ROSEIRO等[6]报道葡萄牙香肠中的pH值在5.5左右有利于具有产胺酶活性的微生物繁殖,增加亚硝胺前体物的形成。朱清清[7]通过对比腊肉中空白组和实验组(添加亚硝酸钠)亚硝胺的含量发现,空白组中并未检测出亚硝胺,表明亚硝酸钠的添加是导致亚硝胺生成的必要条件。姜皓[8]研究表明西式培根在加工过程中,脂肪氧化越严重,TBARS值越大,越有利于亚硝胺的形成;除此之外加工温度和辅料的添加也对亚硝胺的形成有重要影响[9]。由此可见,腊肉中亚硝胺的生成与理化指标具有重要联系。近年来,有学者研究表明金华火腿、如皋火腿、哈尔滨红肠等腌腊肉制品在制作过程中,均伴随着亚硝胺的生成,且亚硝胺的生成与理化指标之间具有一定的相关性[10-12]。然而,关于陇西腊肉中亚硝胺的生成与理化指标的相关性未见报道。

因此,本试验通过研究陇西腊肉加工过程中亚硝胺与理化指标的变化量,分析亚硝胺的生成与理化指标的相关性,以期为陇西腊肉生产过程中亚硝胺的控制及品质改进提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

10种亚硝胺标品,分别为N-二甲基亚硝胺(N-nitrosodimethylamin, NDMA)、N-二乙基亚硝胺(N-nitrosodiethylamine, NDEA)、N-甲基乙基亚硝胺(N-nitrosomethylethylamine, NMEA)、N-二丁基亚硝胺(N-nitrosodinbutylamine, NDBA)、N-二丙基亚硝胺(N-nitrosodinpropylamine, NDPA)、N-亚硝基哌啶(N-nitrosopiperidine, NPIP)、亚硝基吡咯烷(N-nitrosopyrrolidine, NPYR)、N-亚硝基吗啉(N-nitrosomorpholine, NMOR)、N-亚硝基二苯胺(N-nitrosodiphenylamine, NDPHA)、N-亚硝基二异丙胺(N-nitrosodiisopropylamine, NDIPA),纯度均≥99.9%,常州市坛墨质检科技股份有限公司。

固相萃取柱(C18),天津博纳艾杰尔科技有限公司;甲醇、盐酸、乙腈、甲酸、二氯甲烷(均为色谱纯),天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

1290-6460高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪,美国安捷伦公司;RE-52 C旋转蒸发仪,郑州亚荣仪器有限公司;FSH-2A高速匀浆机,江苏友联仪器研究所;TGL-16MC冷冻离心机,湖南湘仪集团;KH3200B超声波清洗器,昆山禾创超声仪器有限公司;Milli-Q超纯水系统,Millipore公司。T6新世纪紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;HX202-电子天平,慈溪市天东衡器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 陇西腊肉的制作方法及样品采集

1.3.1.1 陇西腊肉制作方法

工艺流程:

原料—修整—腌制—晾晒—干燥—成品

配料:肉块100 kg,食盐10%,5 g亚硝酸盐,花椒、小香、桂皮等辅料少许,将香料粉碎后混匀[1-2]。

1.3.1.2 样品采集

陇西腊肉购买于甘肃陇源情肉制品有限公司。按照陇西腊肉一个完整的生产周期采集样品,根据其加工过程中的关键阶段,确定原料肉(0 d)、腌制中期(20 d)、腌制末期(45 d)、晾晒中期(65 d)、晾晒末期(80 d)5个加工时间点进行采样,采集的样品当天完成分样,之后放入-80 ℃冰箱保存,以备相关指标的测定。相关样品信息见表1。

表1 样品信息Table 1 Information of samples

1.3.2 pH的测定

参照马俪珍等[10]的方法略作修改,准确称取搅碎后的样品5.00 g于50 mL的离心管中,按样品与水以体积比1∶10的比例添加超纯水,然后以200 r/min摇床5 min,然后用pH计测定,每个样品平行测定3次。

1.3.3 TVB-N的测定

参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》半微量定氮法测定。

1.3.4 水分测定

参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》直接干燥法测定。

1.3.5 食盐含量测定

参照GB 5009.44—2016《食品安全国家标准 食品中氯化物的测定》银量法测定。

1.3.6 亚硝酸钠残留量的测定

参照GB 5009.33—2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》分光光度法测定。

1.3.7 TBARS测定

参照GB 5009.181—2016《食品安全国家标准 食品中丙二醛的测定》分光光度法测定

1.3.8 亚硝胺测定

前处理方法:参照张潇[13]的方法略作修改,称取5 g腊肉样品,加入10 mL乙腈,超声15 min,置于-20 ℃冰箱中冷冻40 min,取出加入4 g无水Na2SO4,1 g NaCl,涡旋1 min,在4 ℃条件下以6 000 r/min离心10 min。取上清液,加入5 mL正己烷,重复上述操作。在固相萃取柱中缓慢加入5 mL的甲醇溶液活化C18柱,活化完成后加入样品,加入2 mL甲醇冲洗,收集萃取液,温度40 ℃旋转蒸发至1 mL,加水定容至2 mL,过0.22 μm的有机滤膜后,上机检测,流动相A为0.1%的甲酸水,流动相B为100%乙腈。洗脱程序为:0～3 min,70%的流动相A+30%流动相B;3～5 min,25%流动相A+75%流动相B;5～6.5 min,5%的流动相A+95%流动相B;6.5～8 min,70%流动相A+30%流动相B。

色谱柱EclipsePlus-C18柱;柱温35 ℃;流速0.3 mL/min;进样量10 μL;检测时间8 min;波长230 nm。

质谱条件:扫描方式电喷雾电离源;气帘气25 psi;电离电压5 000 V;离子源温度550 ℃;雾化气50 psi;加热辅助气50 psi;碰撞气medium;采集模式为多反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)模式,见表2。

表2 十种N-亚硝胺类化合物的MRM参数Table 2 MRM parameters of 10 N-nitrosamine compounds

1.4 统计分析

使用SPSS 20.0统计软件对本试验结果进行显著性分析,采用Origin 2017软件绘制柱状图,每组试验重复3次,用Duncan’s法进行多重比较,P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 陇西腊肉加工过程中pH值的动态变化

由图1可知,在腌制中期,陇西腊肉的pH值显著下降(P<0.05),腌制末期及晾晒阶段pH值变化不显著(P>0.05),pH值在腌制中期达到最低值5.51,这可能是因为在此过程中乳酸菌代谢产生了乳酸,最终导致pH值下降[14];在腌制末期,肉中的蛋白质、游离氨基酸等物质被分解产生了碱性物质,导致pH值上升至5.92;晾晒过程中,乳酸含量减少,碱性物质增多,导致pH值逐渐上升[14]。本研究结果与李泽众等[14]报道的云南三川火腿在腌制与晾晒过程中pH值的变化趋势一致。陇西腊肉最终pH值为6.08,与国内几种腌腊肉制品的同时期对比属于中等水平,其低于三川火腿[14]的pH值6.65和宣威火腿[15]的pH值6.22,高于如皋火腿[11]中的pH值5.75,这可能是由于采用的腌制配料以及晾晒条件的不同导致[15]。

图1 陇西腊肉加工过程中pH值的变化Fig.1 Change of pH in Longxi bacon processing process

2.2 陇西腊肉加工过程中TBARS值的动态变化

TBARS值是指食品中的脂肪在氧化分解后产生的次级产物与硫代巴比妥酸在一定条件下反应的结果[16]。由图2可知,随着陇西腊肉加工过程的进行,TBARS值呈显著上升的趋势(P<0.05),原料肉中的TBARS值为0.06 mg/kg,腌制阶段TBARS值逐渐上升至0.43 mg/kg;在晾晒过程中,温度的升高和O2含量的增加均加速了脂肪的氧化程度[17],导致TBARS值逐渐上升至1.37 mg/kg,魏法山[11]报道的如皋火腿在加工过程中TBARS值呈显著上升趋势(P<0.05),与本研究变化趋势一致,其最终含量为1.68 mg/kg,与本试验结果接近。李暮春等[18]研究发现风干肠中的TBARS值呈显著上升趋势(P<0.05),与本研究变化趋势一致,其最终含量为2.6 mg/kg,高于本试验结果。

2.3 陇西腊肉加工过程中水分的动态变化

水分是保证肉制品化学反应得以进行的重要条件[16]。由图3可知,在陇西腊肉加工过程中,水分呈显著下降的趋势(P<0.05),原料肉中水分含量为72.93%,在腌制过程中水分含量的变化为68.26%～64.59%,腌制期水分下降的主要原因是食盐不断渗透进入肉中,导致肉不断失水[19];晾晒中期水分下降较快,晾晒末期由于食盐已经基本渗透进肉中,腊肉中的水分下降速率减慢,在晾晒后期可以明显看到腊肉表面已经干硬,最终水分含量为58.64%。李泽众等[14]研究发现云南三川火腿原料肉中水分含量为74.45%,在腌制阶段逐渐下降到63%,晾晒结束后水分含量为61%左右,与本试验研究结果相似。耿翠竹等[20]报道宣恩火腿原料肉到腌制阶段水分下降较快,晾晒末期下降速度相对较慢,与本研究结果一致。

图3 陇西腊肉加工过程中水分的变化Fig.3 Change of moisture content in Longxi bacon processing process

2.4 陇西腊肉加工过程中亚硝酸钠残留量动态变化

亚硝酸钠不仅是亚硝化反应的底物,还是肉制品发色和独特风味形成的重要物质[20]。由图4可知,亚硝酸钠残留量呈显著下降趋势(P<0.05),原料肉中亚硝酸钠含量为0 mg/kg,腌制中期为15.47 mg/kg,腌制末期到晾晒末期这一阶段,亚硝酸钠残留量变化为11.52～3.37 mg/kg,这可能是因为随着加工过程的进行,一部分亚硝酸钠通过转化参与了亚硝胺的反应进程,另一部分亚硝酸钠与肌红蛋白中的血红素铁反应形成亚硝基血红素,参与了肉色的形成,晾晒后期可以明显看到肉色变红[21]。魏法山[11]研究的如皋火腿在加工过程中亚硝酸钠残留量在腌制中期到晾晒末期呈显著下降的趋势(P<0.05),与本研究趋势一致,其晾晒末期含量为8.99 mg/kg,高于本研究,这可能是因为加工条件和辅料添加量不同导致。

2.5 陇西腊肉加工过程中食盐含量的动态变化

食盐具有抑菌、防腐作用,能够增加肉的持水性,有助于独特风味的形成[22]。由图5可知,随着加工的进行,陇西腊肉中的食盐含量呈显著上升的趋势(P<0.05),原料肉中的食盐含量为0.58%,食盐在腌制阶段变化量为2.84%～5.01%,这可能是因为随着加工过程的进行,食盐不断渗透进入肉中导致的食盐含量升高[22];晾晒过程,腊肉中食盐的含量逐渐趋于平衡,最终含量为6.05%。李泽众等[14]研究发现三川火腿在腌制阶段食盐含量呈显著上升趋势(P<0.05),晾晒阶段上升不明显,与本研究结果一致,其最终的食盐含量为3.5%左右,低于本研究。张远等[15]研究发现宣威火腿在晾晒结束后食盐含量为5.8%左右,与本研究结果接近。

图5 陇西腊肉加工过程中食盐含量的变化Fig.5 Change of salt content in Longxi bacon processing process

2.6 腊肉加工过程中TVB-N值的动态变化

TVB-N是指微生物和酶将食品中的蛋白质分解所产生的氨类以及胺类含氮物质的量,是表征肉制品新鲜程度的指标,TVB-N值越大,肉品腐败程度越高[17]。由图6可知,随着加工过程的进行,陇西腊肉中的TVB-N值呈显著上升趋势(P<0.05),原料肉中TVB-N值为5.57 mg/100 g,腌制期间变化量为34.43～43.03 mg/100 g,在腌制过程中,食盐不断渗透,肉发生脱水,导致肉中的蛋白质水解速率下降,所以这一阶段TVB-N值增长缓慢[18];晾晒阶段TVB-N值呈显著上升趋势(P<0.05),这可能是因为微生物繁殖速率加快,且蛋白质水解程度升高,TVB-N值上升较快,最终含量为73.47 mg/100 g。本试验趋势与如皋火腿[11]中的TVB-N在腌制与晾晒阶段的变化趋势一致,陈露等[23]研究发现三川火腿中的TVB-N在腌制阶段上升较缓慢,晾晒阶段上升速率加快,与本研究结果一致,其TVB-N最终含量为70.54 mg/100 g,与本研究结果相似。

图6 陇西腊肉加工过程中TVB-N值的变化Fig.6 Change of TVB-N in Longxi bacon processing process

2.7 陇西腊肉加工过程中亚硝胺的动态变化

2.7.1 十种亚硝胺的保留时间及标准曲线

分别以10种亚硝胺的不同浓度为横坐标,该浓度下所对应的峰面积为纵坐标制作标准曲线,其线性关系如表3所示。结果显示,各亚硝胺标准曲线的决定系数R2均大于0.999,各组化合物在2.5×10-9～1.0×10-7线性良好,可以满足定量分析的需要。

表3 十种亚硝胺保留时间、标准曲线Table 3 Retention time and linear equation of 10 nitrosamines

2.7.2 陇西腊肉加工过程中亚硝胺的动态变化

由表4可知,陇西腊肉加工过程中共检出6种亚硝胺,分别是:NDMA、NMEA、NDEA、NPYR、NDPHA。未检测到NMOR、NPIP、NDPA、NDBA、NDIPA,其中NDBA一般是由橡皮袋中迁移过去的,陇西腊肉并未见用橡皮袋包装且未检测到NDBA;NPIP多见于添加胡椒粉的油煎培根中,陇西腊肉并未添加胡椒粉,不满足NPIP生成的条件,并未检测到[24]。陇西腊肉原料肉中未检测出亚硝胺。由表4可知,陇西腊肉腌制阶段亚硝胺总量呈显著上升趋势(P<0.05),晾晒阶段上升不显著(P>0.05)。腌制阶段亚硝胺总量变化为3.64～5.61 μg/kg,晾晒阶段亚硝胺总量变化为6.57～7.06 μg/kg。其中NDMA呈显著上升趋势,其总量变化为0.58～1.05 μg/kg,;NMEA含量从腌制中期0.51 μg/kg增长到晾晒中期1.79 μg/kg,最后下降到晾晒末期1.59 μg/kg;NDEA由腌制中期0.39 μg/kg上升到腌制末期1.38 μg/kg,之后下降到晾晒末期0.39 μg/kg;NPYR、NDPHA在整个加工阶段呈显著的上升趋势(P<0.05),其总量变化分别为1.73～2.72 μg/kg、0.43～1.31 μg/kg。

表4 陇西腊肉加工过程中10种亚硝胺的动态变化 单位:μg/kg

肉制品在加工过程中,亚硝胺的生成受到众多因素影响[如温度、亚硝酸钠的添加量、水分含量、加工时间、亚硝胺的前体物质(胺类物质、游离氨基酸等),微生物、酶类、抑制剂的添加,pH值等]。在腌制阶段,由于肉中的微生物活动所产生的酶类及脂肪氧化所产生的醛类物质的增加,肉制品腐败所产生的胺类物质、pH值的变化,均为亚硝胺前体物质的形成提供了有利条件,导致亚硝化反应得以快速进行。朱清清[7]研究的腊肉中NDMA、NDEA、NPYR在腌制阶段均呈显著上升趋势(P<0.05),李暮春等[18]研究的风干肠中NDPHA在腌制阶段呈现显著的上升趋势,刘璐璐等[25]研究的重组培根在腌制过程中NMEA、NPYR含量呈显著上升趋势(P<0.05),均与本研究结果一致,表明腌制阶段有利于亚硝胺的生成;在晾晒过程中,腊肉的水分含量下降,食盐含量不断升高,进而抑制了部分微生物的活动[22],导致亚硝化反应速率降低,亚硝胺总量增加较少,魏法山[11]报道的如皋火腿在晾晒过程中亚硝胺NDMA含量由0.11 μg/kg上升到0.31 μg/kg,NDEA含量由0.37 μg/kg逐渐下降至0.07 μg/kg,除理化反应因素之外,可能是由于NDEA具有光解作用,在紫外线照射下会发生分解[7],这是导致晾晒过程中NDEA减少的原因之一,与本研究趋势一致。朱清清[7]研究表明,腊肉在晾晒阶段NPYR含量逐渐上升,这可能是由于内源酶作用导致的与NPYR合成有关的胺类物质含量增加,导致晾晒阶段NPYR含量上升[7],与本研究结果一致。李暮春等[18]研究的风干肠中NDPHA在晾晒阶段呈现显著上升趋势,与本研究结果一致。由此可见,在陇西腊肉加工过程中,微生物污染、各种理化指标的作用、以及加工方式都会对陇西腊肉中亚硝胺的形成产生影响。

2.8 陇西腊肉加工过程中理化指标与亚硝胺相关性分析

由表5可知,在陇西腊肉加工过程中,6种亚硝胺与pH值之间均无显著相关性(P>0.05),这可能是因为陇西腊肉加工过程中pH值的变化范围不大,对亚硝胺前体物质的形成影响较小,未对产胺微生物和酶活性产生显著影响[26]。朱清清[7]研究表明腊肉中NDMA、NDEA、NPYR与pH值无显著相关性(P>0.05),魏法山[11]研究的如皋火腿在加工过程中pH值与NDEA、NPYR、NDMA的形成均无显著正相关性,与本研究结论一致。

表5 陇西腊肉加工过程中理化指标与亚硝胺相关性分析Table 5 Correlation analysis of physical and chemical indexes and nitrosamines in Longxi bacon processing process

NDEA、NPYR与TBARS无显著相关性(P>0.05),NDMA与TBARS值呈极显著正相关(P<0.01),NMEA、NDPHA与TBARS值呈显著正相关(P<0.05),这可能是因为脂肪氧化的产物丙二醛等与NDPHA、NMEA、NDMA的形成具有密切联系[19]。魏法山[11]研究发现如皋火腿中NDEA与TBARS值无显著相关性(P>0.05),与本研究结果一致,李暮春等[18]研究的风干肠中NDEA与TBARS值均无显著相关性(P>0.05),NDPHA与TBARS值呈显著正相关(P<0.05),与本研究结果一致。

NDMA、NDEA与水分无显著相关性(P>0.05),NDPHA与水分呈极显著负相关(P<0.01),NPYR、NMEA与水分呈显著负相关(P<0.05),这可能是因为随着水分含量逐渐下降,导致亚硝酸钠、胺类物质和游离氨基酸等物质浓度相对增大,前体物浓度增多从而有利于亚硝胺的生成[17]。李暮春等[18]研究表明风干肠中的NDEA与水分无显著相关性(P>0.05),与本研究结果一致。

在加工过程中,6种亚硝胺与亚硝酸钠残留量之间均无显著相关性(P>0.05),这可能是因为亚硝酸钠参与了亚硝胺的形成,残留的亚硝酸钠并不参与亚硝胺的形成过程。魏法山[11]研究发现如皋火腿中NDMA、NDEA与亚硝胺均无相关性,与本研究结果一致。李暮春等[18]研究的风干肠中也得到了此结论。

NDMA、NDEA与食盐含量无显著相关性(P>0.05),NPYR、NMEA、NDPHA与食盐呈显著正相关(P<0.05),这可能是因为食盐中的氯离子能够加速亚硝胺的反应进程,一定条件下,氯离子含量越多,生成的亚硝胺含量越多[17]。魏法山[11]研究的如皋火腿中也得到了此结论。

NMEA、NDEA与TVB-N无相关性,NDMA、NDPHA与TVB-N呈极显著正相关(P<0.01),NPYR与TVB-N呈显著正相关(P<0.05),这可能是因为肉中的蛋白质在降解过程中产生的胺类物质等是亚硝胺的形成提供前体物质[19],会促进亚硝胺的形成。魏法山[11]研究表明如皋火腿中NDEA与TVB-N值呈极显著正相关(P<0.01),李暮春等[18]研究表明风干肠中NDPHA与TVB-N值呈极显著正相关(P<0.01),与本研究结论一致。

3 结论

随着加工过程的进行,陇西腊肉中的亚硝胺含量逐渐上升,最终NMEA、NPYR含量较高,分别为1.59、2.72 μg/kg;TBARS值、食盐含量、TVB-N值呈显著的上升趋势(P<0.05),水分含量与亚硝酸钠残留量呈显著下降趋势(P<0.05),pH值先下降后上升。NDMA与TBARS值呈极显著正相关(P<0.01),NDPHA与水分呈极显著负相关(P<0.01),NPYR、NMEA、NDPHA与食盐呈显著正相关(P<0.05),NDMA、NDPHA与TVB-N呈极显著正相关(P<0.01),5种亚硝胺与亚硝酸盐残留量、pH值均无显著相关性(P>0.05)。总之,陇西腊肉中亚硝胺的生成与TBARS、食盐、TVB-N具有一定的相关性,可在陇西腊肉加工过程中通过控制这些理化指标的大小来减少亚硝胺的形成。本研究结果揭示了陇西腊肉中亚硝胺的生成与理化指标的相关性,也为控制陇西腊肉中亚硝胺的生成提供理论支持。