LC-MS/MS结合分子网络技术快速鉴定生三七和砂烫三七的三萜皂苷类成分

陈兴龙，周 堂，白同尘，张海莹，侯 博，张荣平

（云南中医药大学 中药学院暨云南省南药可持续利用研究重点实验室，云南 昆明 650500）

三七为五加科人参属植物三七（Panax notoginseng（Burkill） F. H. Chen ex C. H.）的干燥根及根茎，为云南省特有的中药大品种资源。云南省在三七种植、加工和使用方面独具特色［1］。三七在临床上有着生熟异用之分，生三七及其制剂主要用于治疗心血管疾病，血塞通、血栓通等以三七为主的中成药已广泛应用于血栓性疾病治疗［2-3］。中医临床认为熟三七具有补益功效，可用于改善身体虚弱和气血亏虚［4-5］。三七的传统炮制方法为蒸制［6］。本课题组长期致力于三七药效物质基础研究，尤其关注生熟三七药用的差异性。前期研究发现砂烫三七可促使生三七的化学成分发生变化［7］。研究认为，三七经炮制后的化学成分尤其是三萜皂苷类成分变化显著，由多糖苷降解为单糖苷，可能是造成三七生熟异用、产生不同临床效果的原因［8-13］。但关于砂烫三七中三七皂苷的转化情况未见报道，难以为砂烫三七提供合理的质量标准。

质谱分析具有高效灵敏的优势［14-16］，目前在中药复杂体系［17-18］、药物代谢物［19］、环境污染物［20］等分析中应用广泛。其中，质谱分子网络（Molecular networking）已成为质谱分析的主要工具［21-22］。其基于相似结构的化合物在同一分析条件下产生相似质谱碎片的原理，借助全球天然产物社会分子网络（GNPS）平台，通过计算机算法将质谱碎片按照相似度整合成一张可视化的网络图谱进行分析［23］。利用LC-MS/MS 结合分子网络技术有助于提高复杂质谱数据的解析效率，为中药成分的深度分析提供科学依据［24］。

本文利用LC-MS/MS结合分子网络技术对生三七和砂烫三七的三萜皂苷类成分进行快速识别鉴定，根据对照品、保留时间、特征碎片离子、MS/MS裂解规律和文献报道等信息，从生三七中鉴定出50个三萜皂苷，从砂烫三七中鉴定出60个三萜皂苷，有11个皂苷类成分通过对照品进行验证。本研究有助于阐明生三七和砂烫三七的三萜皂苷类成分差异，可为三七生熟异用的药效物质基础差异研究提供支持，为砂烫三七的质量标准研究提供依据。

1 实验部分

1.1 材料、试剂与仪器

三七于2022 年10 月购自昆明螺蛳湾药材市场，由云南中医药大学赵荣华教授鉴定为五加科（Araliceae）植物三七（Panax notoginseng（Burkill））的根茎。对照品人参皂苷CK、F1、F2、F11、Rb1、Rc、Re、Rg1、Rg2、Rg3、Ro、Rh1、Rh2、Rh4、Rk3和三七皂苷R1购自成都植标化纯生物科技有限公司，纯度大于98%。色谱纯乙腈、甲酸和甲醇购于德国默克公司。Agilent 1260 液相色谱仪；Agilent 1290超高效液相色谱-Agilent 6530四极杆飞行时间串联质谱仪：配有电喷雾双喷离子源（Dual AJS ESI）及Agilent MassHunter Qualitative Analysis B. 10.0数据处理系统（美国安捷伦科技有限公司）。

1.2 三七的炮制与样品提取处理

1.2.1 砂烫三七的炮制经分拣且过20目筛的河砂置于锅内升温至170～220 ℃；生三七切成厚片，放入河砂中翻炒，河砂、药材的质量比为30∶1，待药材呈棕褐色，筛掉砂粒，取出三七片，即得砂烫三七。

1.2.2 三七皂苷的提取与富集将生三七片与砂烫三七片各500 g 打成细粉，分别置于2 500 mL 70%乙醇-水中浸泡过夜，回流提取3次，每次2 h，合并浓缩得到生三七和砂烫三七浸膏各约60 g。两者浸膏分别取10 g，以100 mL 超纯水分散，1 000 mL D101 大孔树脂柱层析（3 × 20 cm），以水和70%（体积分数）乙醇-水洗脱，收集洗脱流分，即为三七总皂苷部位。将得到的浸膏冷冻干燥成粉，分别记为生三七（A）和砂烫三七（B）总皂苷。

1.2.3 样品的配制取生三七和砂烫三七总皂苷各10 mg，用甲醇溶解配制为2 mg/mL 的溶液。精密称取1.0 mg对照品，用甲醇溶解配制为0.25 mg/mL的溶液。根据保留时间的差异，将对照品混合为混合对照样品，分别为Gs-1组：人参皂苷CK、F1、F11、F2、Re、Rg2；Gs-2组：人参皂苷Rb1、Rg1、Rh4、Ro；Gs-3 组：人参皂苷Rc、Rg3、Rh1、Rh2、Rk3 和三七皂苷R1。以上样品均离心（10 000 r/min，10 min）后取上清液进行LC-MS/MS分析。

1.3 LC-MS//MS分析及质谱分子网络构建

1.3.1 色谱条件Agilent C18柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm），流动相：A 为0.05%（体积分数）甲酸水，B 为乙腈，进样量为 5 μL，流速为0.2 mL/min，柱温为30 ℃。梯度洗脱条件：0～1 min，5%～15% B；1～40 min，15%～45% B；40～50 min，45%～70% B；50～55 min，70%～90% B；55～60 min，90% B；60～61 min，90%～5% B；61～65 min，5% B。

1.3.2 质谱条件扫描模式为负离子电离模式，干燥气温度：320 ℃，干燥气流速：8 L/min；鞘气温度：350 ℃，鞘气流速：11 L/min；喷嘴电压：1 000 V；毛细管出口电压：70 V；毛细管电压：1 000 V（ESI-）；碰撞能量：10、20、30、40 eV；质谱扫描范围：m/z100～3 000。参比为嘌呤（Purine）和HP-0921，负离子模式下m/z分别为112.985 6和1 033.988 1。

1.3.3 GNPS 分子网络采用ProteoWizard 软件将原始的LC-MS/MS 数据文件转化成.mzXML 格式的数据文件；将数据文件导入GNPS 平台，建立分子网络，母离子之间的最大质量偏差设置为20 mDa，其余参数为默认值；运用Cytoscape 3.9.1软件使其可视化。

1.4 三萜皂苷的定量分析

基于LC-MS/MS 分析结果，选取人参皂苷Rb1、Rg1、Rg3、Rh4、Rk3和三七皂苷R1作为对照品，采用高效液相色谱法测定生三七和砂烫三七总皂苷中三萜皂苷的含量。色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）。流动相：乙腈（A）和水（B）。梯度洗脱条件：0～20 min，20% A；20～45 min，20%～46% A；45～55 min，46%～55% A；55～60 min，55% A；60～90 min，55%～100% A。检测波长：203 nm，流速：1.0 mL/min，进样量10 μL。

混合对照品溶液配制：精密称取人参皂苷Rb1、Rg1、Rg3、Rh4、Rk3 和三七皂苷R1 适量，加甲醇定容，制成含上述人参皂苷质量浓度依次为1.2、1.9、0.1、0.1、1.5、0.6 mg/mL 的混合对照品。供试品溶液配制：精密称取A 和B总皂苷各1.0 mg溶于1 mL甲醇中，摇匀即得供试品溶液。以上样品均经0.45 μm微孔滤膜过滤后，待分析。

分别精密吸取上述混合对照品溶液0.5、1、2、4、8、10 mL，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。按上述色谱条件测定，以进样量（μg）为x轴，峰面积为y轴进行线性回归计算。

2 结果与讨论

2.1 三萜皂苷的MS/MS裂解行为

为揭示三萜皂苷类成分的质谱裂解方式，对16 种皂苷类成分的MS/MS 裂解行为进行分析。Gs-1、Gs-2和Gs-3三组混合对照品的总离子流图如图1所示。分析显示，三萜皂苷类成分在负离子模式下响应较强，容易检测到［M-H］-、［M+Cl］-和［M+HCOO］-等加合离子，根据加合离子可确认对照品的分子量和分子式信息。因［M+Cl］-和［M+HCOO］-离子的丰度高，本研究中的母离子主要为［M+HCOO］-离子，少数为［M+Cl］-或［M-H］-离子。

如图2 所示，三萜皂苷类成分因含有葡萄糖基、鼠李糖基或阿拉伯糖基，在负离子模式下易断裂得到糖基碎片。如丢失葡萄糖基（Glc）后产生m/z179（C6H11O6） 或m/z161（C6H9O5）碎片，丢失鼠李糖基（Rha）产生m/z143（C6H7O4）碎片，丢失阿拉伯糖基（Ara）则产生m/z149（C5H9O5）碎片。此外，对于单糖取代的皂苷类成分，人参皂苷F1 和人参皂苷CK 丢失C-20 位葡萄糖基后产生m/z179 碎片，伴随产生m/z119碎片；人参皂苷Rh1和人参皂苷Rh2丢失C-3或C-6位葡萄糖基则直接产生m/z161碎片。C-20取代基较易丢失，故该取代基丢失产生的碎片丰度较高。对于单个葡萄糖基取代的皂苷，化合物极性顺序为：6-Glc 取代＞ 20-Glc 取代＞ 3-Glc 取代，故该规律为区别含有C-20、C-3 或C-6 位糖基的皂苷类成分提供了依据。对于含有二糖的皂苷类成分，若为-Glc（2→1）Rha 取代（人参皂苷F11 和人参皂苷Rg2），二糖基丢失产生m/z205（C8H13O6）碎片；若为-Glc（2→1）Glc取代（人参皂苷Rg3），二糖基丢失生成m/z221（C8H13O7）碎片；若为-Glc（6→1）Arab取代（人参皂苷Rc），二糖基丢失生成m/z293（C11H17O9）、m/z191（C7H11O6）碎片。

图2 三萜皂苷对照品的二级质谱图Fig.2 MS/MS spectra of triterpenoid saponins

2.2 生三七和砂烫三七中三萜皂苷的快速鉴定

将生三七总皂苷和砂烫三七总皂苷进行LC-MS 分析，获得总离子流图（图3）。进一步进行MS/MS分析，获得二级质谱图，将二级质谱数据在GNPS 平台进行分析，通过Cytoscape 3.9.1 软件获得分子网络可视化图（图4）。该分子网络中每个节点代表一种化合物，相连的节点说明二者之间有共有的离子碎片，分子网络中箭头的指向代表相互关联的两个化合物节点间可能存在的基团修饰与被修饰关系（如糖基化、酰基化等）。在本研究中对于糖基化等常见的修饰类型，多以低质量化合物为基础对其进行相应的化学修饰或官能团反应，从而实现对高质量化合物的结构解析和推断。网络中数据点间的距离大小（边距）为相应化合物对应的二级质谱的余弦相似性，网络中距离较近的两个节点具有更高的二级质谱相似性，即二者结构的相似性越高。本实验从生三七中鉴定出50个三萜皂苷，从砂烫三七中鉴定出60 个三萜皂苷，经分析后发现二者共有23 个皂苷类成分；生三七单独有27 个成分，包括11 个丙二酰基取代的皂苷；砂烫三七单独含有37 个皂苷，包括19 个乙酰基取代的成分（有1 个未鉴定结构），化合物结构如图5所示。三萜皂苷类化合物的具体信息见表1。

图3 生三七（A）和砂烫三七（B）总皂苷的LC-MS/MS总离子流图Fig.3 TIC of total saponins from Panax notoginseng（A） and processed Panax notoginseng with hot sand（B） by LC-MS/MS the peak numbers denoted were the same as those in Table 1

图4 生三七（A）和砂烫三七（B）总皂苷的分子网络图及代表性色谱峰的二级质谱图Fig.4 The molecular network diagram of total saponins from Panax notoginseng（A） and processed Panax notoginseng with hot sand（B） and the MS/MS spectra of characterized peaks

图5 生三七（A）和砂烫三七（B）中鉴定的三萜皂苷Fig.5 The triterpenoid saponins identified from Panax notoginseng（A） and processed Panax notoginseng with hot sand（B）

三萜皂苷类成分的鉴定一般遵循以下过程：首先，通过研究对照品的质谱裂解行为，归纳总结三萜皂苷的裂解规律，应用于样品中三萜皂苷的鉴定；其次，对于保留时间和质谱裂解行为与对照品一致的，则将其鉴定为对照品；再次，对于对照品中不包括的三萜皂苷，则依赖质谱分子网络，找到其相似结构，再分析其质谱裂解行为，进而解析结构。

2.2.1 共有皂苷类成分的鉴定在生三七和砂烫三七中，检测到共有皂苷类成分23个，其中有11个成分可通过对照品鉴定，分别为人参皂苷F1、F2、Rb1、Re、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh4、Rk3 和三七皂苷R1。以峰B1为例，说明共有皂苷类成分的鉴定过程。在负离子模式下，测得峰B1的［M-H］-为m/z931.523 6，［M+Cl］-为m/z967.501 0，［M+HCOO］-为m/z977.530 5，预测其分子式为C47H80O18，不饱和度为8。三七中三萜皂苷的苷元含有5 个不饱和度，说明该化合物还含有3 个糖，共组成8 个不饱和度。进行MS/MS 分析发现m/z799.482 8（C42H71O14，-2.1（实测值与计算值的误差，单位为mDa，下同），［M-H-Xyl］-）、769.473 1（C41H69O13，-1.3，［M-H-Glc］-）、637.430 1（C36H61O9，-2.0，［M-HXyl-Glc］-）和475.376 6（C30H51O4，-2.7，［M-H-Xyl-2Glc］-）等碎片，上述碎片均为B1脱去1～3分子糖基碎片所产生，且经高分辨质谱分析，发现这些糖基碎片为两分子葡萄糖和一分子木糖（Xyl）。另外检测到m/z179.055 8（C6H11O6，-0.3，［Glc-H］-）、161.044 5（C6H9O5，-1.2，［Glc-H-H2O］-）、149.045 7（C5H9O5，+0.1，［Xyl-H］-）和119.035 1（C4H7O4，+1.1）等碎片，其中m/z179.055 8、161.044 5 和119.035 1的碎片为C-20位丢失Glc后产生，m/z149.045 7碎片与Xyl裂解有关。在分子网络中，B1与对照品人参皂苷Rg1（B3）高度相关，说明它们结构相似；箭头由B3指向B1，二者分子量的精确差值表明B1 为B3 的木糖基修饰产物，即B1 较B3 多一分子木糖基取代。进一步检索数据库，发现三七皂苷R1的C-20位为Glc 取代、C-6位为Glc（2→1）Xyl取代，与质谱裂解行为相符，与对照品的质谱行为和保留时间也吻合。因此，将B1鉴定为三七皂苷R1。

2.2.2 丙二酰基取代的皂苷类成分的鉴定本研究从生三七中检测到10 个丙二酰基取代的皂苷类成分，在砂烫三七中未发现。以峰A33 为例说明丙二酰基取代皂苷的鉴定过程。负离子模式下，测得峰A33 ［M-H］-为m/z1 193.594 6，预测其分子式为C57H94O26，不饱和度为11。MS/MS 检测到的碎片有m/z1 149.603 9（C56H93O24，-2.3，［M-H-CO2］-）、1 107.592 4（C54H91O23，-3.3，［M-H-CO2-C2H2O］-）、1 089.582 1（C54H89O22，-3.0，［M-H-CO2-C2H2O-H2O］-）、945.538 7（C48H81O18，-4.4，［M-H-CO2-C2H2O-Glc］-）、783.486 8（C42H71O13，-4.2，［M-H-CO2-C2H2O-2Glc］-），明显观察到因丙二酰基脱去CO2或C2H2O 所产生的碎片，如m/z1 149.603 9 和m/z1 107.592 4，其他脱糖基碎片与对照品人参皂苷Rb1（B20） 的脱糖基碎片类似。这些丙二酰基取代的皂苷类成分往往聚集成簇，并与其他非丙二酰基取代的皂苷因箭头指向而存在修饰与被修饰的关系，为解析其他丙二酰基皂苷提供了依据。结合数据库检索结果，将峰A33确定为6′′-丙二酰人参皂苷Rb1。

（续表1）

（续表1）

2.2.3 乙酰基取代的皂苷类成分的鉴定乙酰基取代的皂苷类成分主要在砂烫三七中发现，本研究从砂烫三七中共发现19个乙酰基取代的皂苷类成分，鉴定了其中的18个。以峰B22为例说明该类皂苷的鉴定过程。负离子模式下，测得峰B22 的［M-H］-1 149.602 1 和［M+HCOO］-1 195.607 9，预测其分子式为C56H94O24，不饱和度为10。MS/MS 测定其碎片为m/z1 107.592 3（C54H91O23，-3.4，［M-HC2H2O］-）、1 089.578 8（C54H89O22，-6.3，［M-H-AcOH］-）、945.534 9（C48H81O18，-8.2，［M-H-C2H2OGlc］-）、783.489 4（C42H71O13，-1.6，［M-H-C2H2O-2Glc］-），最典型的为丢失乙酰基产生的碎片m/z1 089.578 8，其余碎片为乙酰基或葡萄糖基交替丢失产生，与对照品人参皂苷Rb1 的碎片类似。在质谱分子网络中，峰B22与对照品人参皂苷Rb1相连，说明二者结构有相似性，存在乙酰化的修饰关系。进一步检索数据库，将峰B22确定为6′′′′-乙酰人参皂苷Rb1。

2.2.4 C-20 位脱糖基皂苷类成分的鉴定三七在炮制时，高温会造成皂苷C-20 位糖苷键断裂，生成C-20位脱糖基皂苷类成分，这类成分在熟三七中较常见。在本研究中，生三七仅检测到2个此类成分，而砂烫三七中则检测到19 个此类成分，说明砂烫也会造成皂苷C-20 位糖苷键的断裂，形成转化皂苷。这些皂苷类成分通过对照品鉴定出2个，即人参皂苷Rh4、Rk3，其他需根据质谱裂解行为和分子网络进行推断。以峰B54 为例说明解析过程，负离子模式下，测得峰B54 的［M+Cl］-801.453 8 和［M+HCOO］-811.483 3，预测其分子式为C42H70O12，具有8 个不饱和度。碎片离子可检测到m/z603.424 4（C36H59O7，-2.2，［M-H-Glc］-）和457.362 6（C30H49O3，-6.1，［M-H-2Glc］-），为连续脱去两分子葡萄糖基所产生；进一步检测到m/z221.065 2（C8H13O7，-1.5）、179.056 0（C6H11O6，-0.1，［Glc-H］-） 和161.044 9（C6H9O5，-0.8，［Glc-H-H2O］-）等碎片，证明存在-Glc（2→1）Glc 取代基。在分子网络中，峰B54 与峰B28 相关，说明二者糖基碎片相同，经检索数据库，发现人参皂苷Rk1 与推测裂解途径符合，该化合物在C-3位含-Glc（2→1）Glc取代，C-20脱去糖基形成双键。最终将峰B54鉴定为人参皂苷Rk1。

此外，在推测结构时，发现三七皂苷类成分存在较多的同分异构体，如A41、A42和A43，B54和B55，这些化合物在质谱分析中产生相同的离子碎片，通过质谱解析其结构存在较大困难。B54和B55的结构差异在于双键的位置不同。由对照品得知，人参皂苷Rk3 的保留时间小于人参皂苷Rh4，说明人参皂苷Rk3 型的化合物极性较大，推测在质谱碎片相同的情况下，B54 应为人参皂苷Rk3 型的化合物，B55应为人参皂苷Rh4型的化合物。

2.3 生三七和砂烫三七中三萜皂苷的定量分析

选取6种代表性的皂苷作为对照品，按照“1.4”通过高效液相色谱法测定了生三七和砂烫三七中三萜皂苷的含量（表2）。结果显示，人参皂苷Rb1、Rg1 和三七皂苷R1 作为原生皂苷，在生三七中含量较高，在砂烫三七中含量降低，尤其是人参皂苷Rg1和三七皂苷R1的含量降低较明显，说明炮制会促进三萜皂苷的降解；人参皂苷Rg3、Rh4 和Rk3 作为转化皂苷，虽在生三七的LC-MS 总离子流图中被检测到（图3和表1），但由于其含量较低，且高效液相色谱不如质谱灵敏，因此在生三七中未检测到上述3 个成分；相反，上述3 个成分在砂烫三七中的含量较高，分别为1.03%、5.49%和4.85%，说明三七经砂烫等方法炮制后，原生皂苷会脱水或降解生成转化皂苷。

表2 生三七（A）和砂烫三七（B）总皂苷中三萜皂苷的定量分析结果Table 2 The quantitative analysis results of triterpenoid saponins in the total saponins of Panax notoginseng（A） and processed Panax notoginseng with hot sand（B）

2.4 讨 论

炮制是使用中药的常用方法，通过炮制可促进中药化学成分发生变化，降低毒副作用或产生不同的生物学作用。三七作为云南省道地药材，其生熟异用具有广泛的研究基础，而三萜皂苷的变化被认为是生熟三七产生不同功能的物质基础［4-6］。常见的三七炮制方法为高温蒸制，高温蒸制后三七中的三萜皂苷发生脱水反应，脱去糖基，在C-20位形成双键。本研究基于课题组前期工作基础，采取操作简便、温度可控、耗时较短的砂烫方法炮制三七，获得的砂烫三七可直接保存，便于后期制剂。LC-MS/MS分析发现，砂烫三七与生三七相比，能检测到较多的三萜皂苷类成分，这些成分多为糖基降解形成的转化皂苷，这与其他方法炮制获得的熟三七化学成分相符。本研究还发现，生三七中含有大量的丙二酰基取代的皂苷类成分，经砂烫后这些成分在砂烫三七中均未检测到，反而检测到乙酰基取代的皂苷，说明三七经砂烫后，可促进丙二酰基取代的皂苷转化为乙酰基取代的皂苷。但其他方法炮制的熟三七是否含有乙酰基取代的皂苷，以及乙酰基三萜皂苷是否是生熟三七药效差异的原因，尚需实验进行证明。后期将进一步研究验证其他炮制方法的熟三七中乙酰基取代皂苷的生成情况，并对砂烫三七中更多的转化皂苷进行含量测定，优化砂烫炮制三七的工艺技术；基于砂烫三七化学成分的变化，研究其生物学作用，最终阐明砂烫三七和生三七药效差异的本质。

3 结 论

本文利用LC-MS/MS 结合分子网络技术对生三七和砂烫三七的三萜皂苷类成分进行快速鉴定。分析了16种三萜皂苷类成分标准品的MS/MS裂解规律，发现在负离子模式下三萜皂苷类成分易丢失葡萄糖基、鼠李糖基或阿拉伯糖基等碎片，上述碎片的快速检测和识别为鉴定三萜皂苷类成分奠定了基础。通过结合对照品、保留时间、MS/MS裂解规律和分子网络信息等从生三七中鉴定出50个三萜皂苷，砂烫三七中鉴定出60 个三萜皂苷，二者共有23 个皂苷类成分；生三七单独含有27 个成分，包括11 个丙二酰基取代的皂苷；砂烫三七单独含有37 个皂苷，包括19 个乙酰基取代的成分；有11 个皂苷类成分通过对照品进行验证。定量分析发现，生三七中原生皂苷的含量较高，砂烫三七中转化皂苷的含量较高。该研究丰富了生三七和砂烫三七的化学成分研究内容，为进一步揭示生三七和砂烫三七的生物活性差异奠定了基础。