多指标降维判别分析方法在中药配方颗粒汤剂与传统汤剂等效性对比中的应用

苗 妍，路 露，谢梦迪，岳佑凇，桂新景，宋明坤，王艳丽，姚 静，施钧瀚，张 璐，李学林，刘瑞新*

（1.河南中医药大学 药学院，河南 郑州 450046；2.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000；3.河南省中药临床应用、评价与转化工程研究中心，河南 郑州 450000；4.河南中医药大学 呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心，河南 郑州 450046；5.河南省中药临床药学中医药重点实验室，河南 郑州450000；6.河南中医药大学第一附属医院中一集团公司，河南 郑州 450000）

中药传统汤剂是我国临床应用最早、最广泛的剂型，兼具起效快、易吸收等优点，同时还体现了中医药随证加减、辨证论治的优势特色［1］。然而，在当今生活节奏日益加快和中医药现代化的背景下，其煎煮过程繁琐、贮存和携带不便等缺点严重制约了在临床上的应用和发展。此时，中药传统汤剂剂型改革的创新性成果—中药配方颗粒（Dispensing granule of Chinese medicine，DGCM）应运而生，它是由单味中药饮片经水提、分离、浓缩、干燥、制粒而成的颗粒，在中医药理论指导下，按照中医临床处方调配后，供患者冲服使用。DGCM 不仅保留了中药传统汤剂辨证论治、随证加减的中医药特色，还具有免煎煮、服用方便、便于携带等优势［2］。然而，中药配方颗粒自诞生之日起始终存在一个备受质疑的核心问题，即配方颗粒汤剂（Dispensing granule decoction，DGD）与传统汤剂（Traditional decoction，TD）之间的差异性问题或等效性问题［3］。

近年来，研究人员进行了大量DGD 和TD 间的等效性研究，取得了显著成绩。但总体来说，两者之间的差异对比研究大多仅针对某一单味药或处方进行单一或多种成分的对比［4-5］，或针对某一单味药或处方进行单个或多种药效的对比［6-7］，仅有少数研究结合多批次样品、多维度指标（化学成分指标、基础药效学指标、临床药效学指标等）的对比结果进行系统分析和综合比较。且已有研究大多采用指纹图谱相似度评价方法、单因素方差分析、t检验等统计学分析方法比较二者之间的差异。上述分析方法虽然可以根据相似度数值、差异是否显著来分析二者之间的等效性，但在二者相似度达到多少可以等效替代、等效替代程度是多少等方面，即没有判别标准，也不能给出置信度，更未以图形化的形式进行直观区分和判别。因此，构建一个图形化、直观化、可从多维度指标（化学成分指标、基础药效学指标、临床药效学指标等）综合评价TD和DGD等效性的方法很有必要。

主成分分析法（PCA） 是多元统计分析中经典的降维方法之一。其基本思想是将数据中具备相关性的多个指标重新进行线性组合得到数量较少且互不相关的综合性指标，即降维处理。这些综合性指标被称为主成分，可最大限度地反映原始数据中的有用信息［8-10］。PCA作为当前数据处理领域最具代表性的一种数据降维方法，在图像分析［11］、故障诊断［12］、中药质量评价［13-15］等方面均得到了很好的运用。置信椭圆是对置信区域的描述方式，可以提供一种图形化的方法来量化两组数据集之间的差异［16-17］，使二者之间的差异更加直观化。因此，为解决现有评价TD 和DGD 等效性的分析方法不直观、未对其进行多维度指标综合评价、无法以图形化形式展示二者之间的关系、无法确定等效替代程度等问题，本研究依托于PCA 算法，构建了一种基于多指标降维判别分析的TD 与DGD 的等效性评价方法，该评价方法以TD 和DGD 的化学成分指标或药效学指标为数据，通过构建的两个置信椭圆的位置关系快速直观地综合呈现TD和DGD之间的关系，可为TD和DGD等效性评价提供新的思路与方法。

1 多指标降维判别分析方法的原理与流程

多指标降维判别分析（MiDRDA）是依托于PCA 算法，对包含TD 和DGD 多指标（Multi-index）信息（化学成分指标、基础药效学指标、临床药效学指标等）的两组数据进行适宜降维，并基于降维后的两组数据构建一定置信度下的置信椭圆，直观评价两者之间关系的一种方法。该分析方法采用Matlab 软件将判别分析结果通过二维PCA 得分图进行可视化，通过分析二维PCA 得分图中自动生成的代表TD和DGD的两个置信椭圆的位置关系，快速、直观地判别TD和DGD的可替代程度。

1.1 构造初始判别式D

首先构造初始判别式D（公式（1）），以此判别式判断TD和DGD两组数据是否可以进行下一步分析。样本量要求为：TD样本数≥3、3≤DGD样本数≤TD样本数，样本数据均需具有代表性。初始判别式D中的CT为TD 组各变量数值的变异系数（RSD），CD为DGD 组各变量数值的变异系数（RSD），p为变量数，D则为TD 组变量数值RSD 平均值与DGD 组变量数值RSD 平均值的差值。若D≥0，说明该DGD 样品组内变异小于TD 组，样品质量相对稳定，可进行下一步分析；若D＜0，但CD＜5%，说明DGD 样品组内变异虽然大于TD 组，但差异较小，仍可进行后续判别分析；若D＜0 且CD≥5%，说明该DGD 样品组内变异大于TD组，配方颗粒样品质量极不稳定，为不合格药品，不需进行后续直观判别分析。

式中，i为指标变量的编号。

1.2 构建置信椭圆E

取符合初始判别式D的表征TD 样品质量的数据信息与表征DGD 样品质量的数据信息，根据二维随机变量概率论相关知识，两类样品数据信息可在给出的一定置信度条件下，得到一个二维随机样本集构成的椭圆形区域（置信椭圆），当置信度α分别为99%、 95%、90%时，可计算出二维连续性随机变量联合概率密度函数，据此构建置信椭圆E。其之所以为椭圆形，是因为二维正态分布（不一定是标准正态分布）的概率密度函数为一个类似“帽子形”的三维图形，用平行于xoy的平面截取该三维图形，会得到一组同心椭圆，在同一椭圆上其分布密度相同，称为等密度椭圆，该椭圆所围成的区域为检测结果在某一概率下可能出现的置信区间，称为置信椭圆［18-19］。

置信椭圆E的构造方式如下：①基于PCA 算法得到数据协方差矩阵对应的特征值λ和特征向量v；②获取最大特征值λmax、特征向量vmax和最小特征值λmin、特征向量vmin，利用反正切函数求出最大特征向量vmax与x轴的夹角θ，即为置信椭圆的旋转角度，可利用旋转矩阵R=［cosθsinθ，-sinθcosθ］对置信椭圆进行旋转；③根据椭圆公式（2）构造卡方检验，其中自由度为2，s是一个与置信度有关的量，当置信度分别为99%、95%和90%时，s的取值分别为9.210、5.991 和4.605，并可求得椭圆长半轴a和短半轴b；④以两组数据的均值为置信椭圆中心，2a、2b为椭圆的长轴和短轴，即可确定置信椭圆E的面积和边界。整个构造过程可通过Matlab程序实现。

1.3 构造判别标准

将上述步骤通过 Matlab 软件实现判别函数的可视化，可直观评价DGD 与TD 的等效关系，判断两者是否可以相互替代。由PCA 得到的主成分二维图上，各个样品点为二维随机变量，在二维平面中，假定其点用（x，y）表示，此时x和y是正交的，其随机分布的区域可以构造为两个二维平面图中任一可能的置信椭圆E1、E2，其中E1为TD 组，E2为DGD 组。在95 %的置信度下，当前两个主成分解释变异达80%及以上时，表明前两个主成分能够涵盖样品大部分的原始数据信息［20-21］，则构建的两个置信椭圆可以很好地表征TD 和DGD 的化学成分、药效数据信息，其位置关系可准确表示两组样品间的等效关系。当公式（3）有解，即两个置信椭圆的位置关系为包含/相交/相切时，表明在此置信度下TD 和DGD 存在共有区域，该区域内，代表两种汤剂成分、药效数据信息的样品点可能会完全一致，进而可认为其成分、药效接近，两者在一定程度上可达到完全等效/部分等效，可以相互替代/部分替代；若公式（3）无解，则两个置信椭圆相离，可判断两者不等效、不可替代。此时可依据TD 的化学或药效数据对DGD 当量比进行校正后，再检验判别，若两椭圆相切/相交/包含，则认为DGD 在经当量比校正后可与TD有不同程度的替代，若仍然不能相交，则认为经当量比校正后两者仍不可替代。

1.4 多指标降维判别分析方法步骤

Step1：采用合适的化学分析方法和药理药效学方法获取TD和DGD化学成分、药效学等数据。

Step2：将数据按照公式（1）计算D值，根据D值判断配方颗粒样品的质量稳定性。若结果符合“1.1”项中规定的要求，TD和DGD两组数据可进入下一步分析。

Step3：将符合公式（1）的两组数据输入Matlab 程序中相应的位置，运行该程序，程序依托PCA 算法对TD和DGD两组数据进行降维处理，得到二维PCA得分图，并自动生成两个分别表征TD和DGD数据信息的置信椭圆。

Step4：当前两个主成分解释变异达80%及以上时，可根据二维PCA 得分图中两个置信椭圆的位置关系判断TD和DGD 之间的等效性。若两个置信椭圆包含/相交/相切，表明二者存在共有区域，在该区域内，代表TD 和DGD 成分、药效数据信息的样品点可能会完全一致，判断TD 和DGD 可完美等效替代/部分等效替代/等效替代程度低；若两个置信椭圆相离，表明二者没有共有区域，说明代表TD 和DGD成分、药效数据信息的样品点没有重叠部分，判断TD和DGD不能等效替代。

Step5：采用当量比校正方法对不能和TD 完美等效替代的配方颗粒进行当量比校正，将校正后的数据重复以上4个步骤，判断经当量比校正后DGD与TD的等效性。

2 实验部分

2.1 炙甘草配方颗粒汤剂与传统汤剂等效性评价

2.1.1 数据来源基于课题组前期关于炙甘草DGD与TD的差异对比研究内容，选取其中部分实验数据验证多指标降维判别分析方法的有效性。选取的5 批炙甘草饮片、9 批（3 个厂家各3 批）配方颗粒的样品来源信息见表1、表2。

表1 5批炙甘草中药饮片批号、产地及厂家Table 1 Batch numbers，regions and manufacturers of 5 batches of baked licorice pieces

表2 3个厂家炙甘草配方颗粒生产批号Table 2 Production batch numbers of three manufacturers of baked licoric dispensing granule

选取的5 批炙甘草TD 和9 批炙甘草DGD 的HPLC 指纹图谱、共有峰峰面积等相关数据信息均采用高效液相色谱仪测得。液相色谱条件如下：Shim-pacCGISTC18-AQ 色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流动相A 为乙腈，流动相B 为0.2%磷酸水溶液（含0.02 mol/L 的磷酸二氢钾），梯度洗脱（0～6 min，19% A；6～15 min，19%～25% A；15～45 min，25%～50% A，45～46 min，50%～19% A；46～56 min，19%A），流速0.7 mL/min，检测波长237 nm，柱温35 ℃，进样量10 μL。5 批炙甘草TD 和9 批DGD 的HPLC指纹图谱见图1。

图1 5批炙甘草TD和9批炙甘草DGD的HPLC指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints of 5 batches TD and 9 batches DGD of baked licorice

2.1.2 A 厂炙甘草配方颗粒汤剂与传统汤剂等效性评价验证结果以A 厂的3批炙甘草DGD 和5批炙甘草TD为样本，以指标成分甘草酸、芹糖甘草苷及其他共有峰的峰面积为数据进行方法验证。初始判别式D的计算结果为D＞0，表明A 厂炙甘草DGD 样品组内差异小于TD 组，批次间质量稳定，可对两组样品数据进行降维可视化分析。将TD 和DGD 的数据输入Matlab 程序，得到95%置信度下炙甘草TD样品和A 厂炙甘草DGD 样品的二维PCA 得分图，在二维PCA 得分图中可自动生成两个分别表征TD 和DGD 数据信息的置信椭圆，且其主成分解释变异达到了80%以上，表明前两个主成分能够涵盖样品大部分的原始信息，构建的两个置信椭圆可以很好地表征传统汤剂和配方颗粒汤剂的数据信息，可根据两个置信椭圆的位置关系清晰直观地判断二者的等效程度（见图2）。在该置信度下，代表炙甘草TD 样品与A 厂DGD 样品的两个置信椭圆相离（图2A），表明TD 与DGD 在此置信度下没有共有区域，说明代表TD 和DGD 化学成分数据信息的样品点没有重叠部分，可认为二者不能等效替代，需对配方颗粒当量比进行校正。分别采用峰面积加和法［1，22］、平均倍数法［22］、CRITIC客观赋权法［23］3种方法对A厂炙甘草配方颗粒当量比进行校正，将校正后的数据输入Matlab 程序中进行验证。结果发现，采用峰面积加和法［1，22］对配方颗粒当量比进行校正后（下调），二维PCA 得分图中的两个置信椭圆部分相交（图2B），说明在相交区域内，代表TD 和DGD 化学成分数据信息的样品点可能会完全一致，表明A 厂炙甘草DGD经当量比校正后与TD可部分等效替代。

2.1.3 B厂炙甘草配方颗粒汤剂与传统汤剂等效性评价验证结果以指标成分甘草酸、芹糖甘草苷及其他共有峰的峰面积为数据，按照与A 厂相同的方法，对B 厂家的3 批炙甘草DGD 和5 批炙甘草TD 进行方法验证。按照“1.4”操作步骤，依次得到D＞0 和95%置信度下的二维PCA 得分图以及PCA 得分图中分别表征TD 和DGD 数据信息的置信椭圆（图3）。在95%置信度下，代表炙甘草TD 样品与B 厂DGD 样品的两个置信椭圆虽然包含（图3A），但因其主成分解释变异未达80%，表明前两个主成分无法代表样本的大部分原始数据信息，故构建的两个置信椭圆无法很好地表征TD 和DGD 的数据信息，在二维平面中不能直接判定其等效，需对配方颗粒当量比进行校正。分别采用“2.1.2”中所述的3种方法对B 厂炙甘草配方颗粒当量比进行校正，将校正后的数据输入Matlab 程序进行验证。结果发现，当采用CRITIC客观赋权法［23］对配方颗粒当量比进行校正后（略微下调），二维PCA得分图中的两个置信椭圆不仅包含，且其主成分解释变异大于80%（图3B），表明前两个主成分能够涵盖样品大部分的原始信息，构建的两个置信椭圆可以很好地表征传统汤剂和配方颗粒汤剂的数据信息。而且在包含区域内，代表TD 和DGD 化学成分数据信息的样品点可能会完全一致，表明B 厂炙甘草DGD 经当量比校正后与TD可相互替代，两者等效。

图3 B厂炙甘草DGD与TD当量比校正前（A）和校正后（B）的多指标降维判别分析结果Fig.3 The results of multi-index dimension reduction discriminant analysis before（A） and after（B） equivalence ratio correction for DGD and TD of baked licorice in manufacturer B

2.1.4 C厂炙甘草配方颗粒汤剂与传统汤剂等效性评价验证结果以指标成分甘草酸、芹糖甘草苷及其他共有峰的峰面积为数据，按照与A 厂相同的方法，对C 厂的3 批炙甘草DGD 和5 批炙甘草TD 进行方法验证。按照“1.4”操作步骤，依次得到D＞0 和95%置信度下的二维PCA 得分图以及PCA 得分图中分别表征TD和DGD 数据信息的置信椭圆（图4），其主成分解释变异达到80%以上，表明可根据两个置信椭圆的位置关系清晰直观地判断二者的等效程度。在95%置信度下，炙甘草TD样品与C厂DGD样品的两个置信椭圆相离（图4A），表明TD 与DGD 在此置信度下没有共有区域，说明代表TD 和DGD 化学成分数据信息的样品点没有重叠部分，可认为二者不能等效替代，需对其配方颗粒当量比进行校正。分别采用“2.1.2”中所述的3 种方法对C 厂炙甘草配方颗粒当量比进行校正，将校正后的数据输入Matlab 程序进行验证。结果发现，当采用CRITIC 客观赋权法［23］对配方颗粒当量比进行校正后（下调），二维PCA 得分图中的两个置信椭圆部分相交（图4B），说明在相交区域内，代表TD 和DGD 化学成分数据信息的样品点可能会完全一致，表明C厂炙甘草DGD经当量比校正后与TD可部分等效替代。

图4 C厂炙甘草DGD与TD当量比校正前（A）和校正后（B）的多指标降维判别分析结果Fig.4 The results of multi-index dimension reduction discriminant analysis before（ A） and after（B） equivalence ratio correction for DGD and TD of baked licorice in manufacturer C

2.2 白芍配方颗粒汤剂与传统汤剂等效性评价

2.2.1 数据来源基于课题组前期关于白芍DGD与TD的差异对比研究内容，选取其中部分实验数据验证多指标降维判别分析方法的有效性。选取的6 批白芍饮片、6 批（2 个厂家各3 批）配方颗粒样品来源信息见表3、表4。

表3 6批白芍中药饮片批号、产地及厂家Table 3 Batch number，region and manufacturer of 6 batches of radix paeoniae alba pieces

表4 两个厂家白芍配方颗粒生产批号Table 4 Production batch number of two manufacturers of radix paeoniae alba dispensing granule

选取的6 批白芍TD 和6 批白芍DGD 的HPLC 指纹图谱、共有峰峰面积等相关数据信息均采用高效液相色谱仪测得。液相色谱条件同“2.1.1”，6批白芍TD和6批DGD的指纹图谱见图5。

图5 6批白芍TD和6批白芍DGD的HPLC指纹图谱Fig.5 HPLC fingerprints of 6 batches TD and 6 batches DGD of radix paeoniae alba

2.2.2 D厂白芍配方颗粒汤剂与传统汤剂等效性评价验证结果以D厂的3批白芍DGD和6批白芍TD为样本，以指标成分芍药内酯苷、没食子酸及其他共有峰的峰面积为数据进行方法验证。按照“1.4”操作步骤，依次得到D＞0和95%置信度下的二维PCA 得分图以及PCA 得分图中分别表征TD 和DGD 数据信息的置信椭圆（图6），其主成分解释变异达到80%以上，表明前两个主成分能够涵盖样品大部分的原始信息，构建的两个置信椭圆可以很好地表征传统汤剂和配方颗粒汤剂的数据信息，可根据两个置信椭圆的位置关系清晰直观地判断二者的等效程度。在95%置信度下，白芍TD 样品与D 厂DGD 样品的两个置信椭圆相离（图6A），表明TD 与DGD 在此置信度下没有共有区域，说明代表TD 和DGD 化学成分数据信息的样品点没有重叠部分，可认为二者不能等效替代，需对其配方颗粒当量比进行校正。分别采用“2.1.2”中所述的3种方法对D 厂白芍配方颗粒当量比进行校正，将校正后的数据输入Matlab 程序进行验证。结果发现，3 种当量比校正方法均不能使TD 和DGD 的两个置信椭圆相交，无法使二者等效替代。其中CRITIC 客观赋权法［23］校正后的验证结果如图6B 所示。说明简单的当量比校正无法使D厂白芍DGD与TD等效替代。

图6 D厂白芍DGD与TD当量比校正前（A）和校正后（B）的多指标降维判别分析结果Fig.6 The results of multi-index dimension reduction discriminant analysis before（A） and after（B） equivalence ratio correction for DGD and TD of radix paeoniae alba in manufacturer D

2.2.3 E厂白芍配方颗粒汤剂与传统汤剂等效性评价验证结果以指标成分芍药内酯苷、没食子酸及其他共有峰的峰面积为数据，按照与D 厂相同的方法，对E 厂的3 批白芍DGD 和6 批白芍TD 进行方法验证。按照“1.4”操作步骤，依次得到D＞0 和95%置信度下的二维PCA 得分图以及PCA 得分图中分别表征TD和DGD 数据信息的置信椭圆（图7），其主成分解释变异达到80%以上，表明前两个主成分能够涵盖样品大部分的原始信息，构建的两个置信椭圆可以很好地表征传统汤剂和配方颗粒汤剂的数据信息，根据两个置信椭圆的位置关系可清晰直观地判断二者的等效程度。在95%置信度下，白芍TD样品与E 厂DGD 样品的两个置信椭圆相离（图7A），表明TD 与DGD 在此置信度下没有共有区域，说明代表TD 和DGD 化学成分数据信息的样品点没有重叠部分，可认为二者不能等效替代，需对其配方颗粒当量比进行校正。分别采用“2.1.2”中所述的3种方法对E 厂白芍配方颗粒当量比进行校正，将校正后的数据输入Matlab程序中进行验证。结果发现，3种当量比校正方法均不能使TD和DGD的两个置信椭圆相交，无法使二者等效替代。其中CRITIC 客观赋权法［23］校正后的验证结果如图7B 所示。说明简单的当量比校正无法使E厂白芍DGD与TD等效替代。

图7 E厂白芍DGD与TD当量比校正前（A）和校正后（B）的多指标降维判别分析结果Fig.7 The results of multi-index dimension reduction discriminant analysis before（A） and after（B） equivalence ratio correction for DGD and TD of radix paeoniae alba in manufacturer E

2.3 砂仁配方颗粒汤剂与传统汤剂等效性评价

2.3.1 数据来源基于课题组前期关于砂仁DGD与TD的差异对比研究内容，选取其中部分实验数据验证多指标降维判别分析方法的有效性。选取的3 批砂仁饮片、3 批配方颗粒（3 个厂家各1 批）样品来源信息见表5、表6。

表5 3批砂仁中药饮片批号、产地及厂家Table 5 Batch numbers，regions and manufacturers of 7 batches of amomi fructus pieces

表6 3个厂家砂仁配方颗粒生产批号Table 6 Production batch numbers of three manufacturers amomi fructus dispensing granule

选取的3 批砂仁TD 和3 批砂仁DGD 的GC 指纹图谱、共有峰峰面积等相关数据信息均采用气相色谱仪测得。气相色谱条件如下：HP-5 毛细管柱（0.25 μm × 250 μm，30 m），载气为氮气，体积流量1.0 mL/min；采用程序升温，初始温度60 ℃，以4 ℃/min 升至124 ℃，以8 ℃/min 上升至196 ℃保持5 min，10 ℃/min 上升至260 ℃保持5 min；分流进样，分流比1∶60；进样量1 μL；进样口温度250 ℃。3批砂仁TD和3批砂仁DGD的气相指纹图谱见图8。

图8 3批砂仁TD和3批砂仁DGD的GC指纹图谱Fig.8 GC fingerprints of 3 batches TD and 3 batches DGD of amomi fructus

通过小鼠胃肠蠕动实验，以葡聚糖蓝2000为胃肠推进示踪染料，计算小鼠胃排空率、小肠推进比和相对胃染料残留率，评价砂仁传统汤剂与配方颗粒汤剂在胃肠保护药理作用方面［24］的差异。实验动物为昆明种SPF 级雄性小鼠，体重20～24 g。将其随机分为空白组和6 个实验组（砂仁TD3 组，砂仁DGD 3组），每组8只。适应性喂养一周后，小鼠禁食（不禁水）24 h，开始灌胃给药，给药前称量体重，实验组分别灌服相应的中药煎液，对照组灌服同体积的蒸馏水。灌药30 min后再灌入0.2 mL 10 mg/mL葡聚糖蓝2000，20 min 后脱颈处死，打开腹腔，结扎胃贲门和幽门，在结扎线外剪断食道和小肠，取出胃体，用滤纸沾干后称重，得胃体和内容物重量。然后取胃，沿大弯侧剪开，将胃内色素残留物充分洗于1.5 mL 生理盐水中，再将空胃体沾干后称重，得胃体重量，计算胃排空率。胃排空率（%）=（灌胃量-（胃体和内容物重量-胃体重量））/灌胃量×100%。

将整段小肠放置在被生理盐水湿润的玻璃板上，自然拉直小肠，测量从幽门到回盲结口的小肠总长度，再测量从幽门到染料显色末端的小肠长度。小肠推进比（%）=染料显色肠长度/小肠总长度×100%。

将上述用生理盐水洗涤过的胃内色素残留物以5 000 r/min 离心3 min，吸取150 μL 上清液至于96孔板，用酶标仪在最大吸收波长处测定上清液中染料的吸光度，确定胃染料浓度，得相对胃染料残留率（%）。相对胃染料残留率（%）=实验组胃内色素残留量/对照组胃内色素残留量×100%。

最终取得的胃排空率、小肠推进比、相对胃染料残留率数据见表7。

表7 胃排空率、小肠推进比、相对胃染料残留率结果（±s，n=8）Table 7 Gastric emptying rate，small intestinal propulsion ratio，and relative gastric dye residue rate results

表7 胃排空率、小肠推进比、相对胃染料残留率结果（±s，n=8）Table 7 Gastric emptying rate，small intestinal propulsion ratio，and relative gastric dye residue rate results

Sample TD-1 TD-2 TD-3 F1 G1 H1 Gastric emptying rate /%91.87±3.78 91.20±5.54 90.09±5.30 89.56±3.67 89.42±3.60 87.42±4.38 Small intestinal propulsion ratio/%71.48±0.09 73.26±0.09 75.12±0.07 68.32±0.11 62.17±0.10 58.87±0.08 Relative gastric dye residue rate/%57.85±0.07 79.46±0.12 81.87±0.06 73.44±0.05 78.44±0.12 60.39±0.03

2.3.2 砂仁配方颗粒汤剂与传统汤剂等效性评价验证结果以3 批砂仁DGD 和3 批砂仁TD 为样本，以指标成分乙酸龙脑酯及其他共有峰的峰面积和小鼠胃排空率、小肠推进比、相对胃染料残留率为数据进行方法验证。按照“1.4”操作步骤，依次得到D＞0 和95%置信度下的二维PCA 得分图以及PCA得分图中分别表征TD 和DGD 数据信息的置信椭圆（图9）。在95%置信度下，砂仁TD 样品与DGD 样品的两个置信椭圆相离且其主成分解释变异未达80%，表明前两个主成分无法代表样本的大部分变异信息，构建的两个置信椭圆无法很好地表征TD和DGD的数据信息，且TD与DGD在此置信度下没有共有区域（图9A），说明代表TD 和DGD 化学成分、药效数据信息的样品点没有重叠部分，可认为二者不能等效替代，需对其配方颗粒当量比进行校正。分别采用“2.1.2”中所述的3种方法对砂仁配方颗粒当量比进行校正，将校正后的数据输入Matlab程序进行验证。结果发现，采用CRITIC 客观赋权法［23］对配方颗粒当量比进行校正后（略微下调），二维PCA 得分图中的两个置信椭圆虽然相切，但其主成分解释变异仍小于80%（图9B），表明前两个主成分仍无法代表样本的大部分原始数据信息，构建的两个置信椭圆无法很好地表征TD 和DGD 数据信息，故在二维平面中不能根据两个置信椭圆的位置关系判定二者的等效性。推测可能因砂仁含挥发性成分较多，DGD 与TD 两者间的影响因素众多，仅经简单校正无法使其等效。

图9 砂仁DGD与TD当量比校正前（A）和校正后（B）的多指标降维判别分析结果Fig.9 The results of multi-index dimension reduction discriminant analysis before（A） and after（B） equivalence ratio correction for DGD and TD of amomi fructus

2.4 讨 论

在方法效果实例验证分析结果中，本研究所构建的方法可以直观地以两个置信椭圆的位置关系展示TD 和DGD 的等效性关系。其中，A、B、C 3厂炙甘草DGD 均不能与其TD 判定为等效，根据峰面积数据采用峰面积加和法［1，22］、CRITIC 客观赋权法［23］对配方颗粒当量比进行校正后（均下调），3 个厂家的炙甘草DGD 均可判定与其TD 可以相互替代或替代程度增高，说明各厂家对其配方颗粒当量比制定偏大，当服用与传统汤剂相同剂量的配方颗粒汤剂时，相比传统汤剂，配方颗粒中的化学成分含量偏低，导致配方颗粒与其传统汤剂无法达到等效或等效程度较低［25-26］。

D、E 两厂的白芍DGD 和F、G、H 厂的砂仁DGD 在其当量比校正前和校正后均不能判定与其相应TD 具有等效性，分析其原因可能为以下几点：（1）配方颗粒在制备过程中经历了水提、分离、浓缩、干燥等多个步骤，而传统汤剂仅是加水煎煮，不同的制备工艺造成两者之间的差异。（2）砂仁中含有较多的挥发性成分［27］，该类成分稳定性差，在制备成配方颗粒过程中可能会挥散、氧化、变质等，从而导致与传统汤剂无法达到完全等效。各厂家在制备不同类别品种的中药配方颗粒时，应结合饮片自身性质和特点，以其传统汤剂制备方法为参照，为每类饮片“量身打造”适合其自身性质的配方颗粒制备工艺。（3）TD 和DGD 中不同化学成分的含量可能并不是按等比例变化，仅经简单的当量比整体上调或下调进行校正无法使二者达到完全等效。

2.5 方法对比及改进措施

本课题组前期使用指纹图谱相似度评价、t检验、客观赋权法等方法对TD 和DGD 的差异进行研究［22-23，28］，这些方法虽然能以相似度数值、差异是否显著来判断TD和DGD的等效性，但二者相似度达到多少可以等效替代、等效可替代程度是多少，既没有统一标准，也不能以图形化的形式直观展现，同时不能基于化学成分、药效学信息综合分析二者之间的差异。而本研究所构建的多指标降维判别分析方法的底层核心算法是PCA，该方法可以从TD 和DGD 的化学成分、药效学信息等多个指标着手，通过降维的方法将原来多个线性相关的指标转化为少数几个线性无关的指标，综合分析各指标的整体效应［29］，从多个指标综合评价二者之间的等效性；同时，本方法可以运用Matlab 软件将二者的等效性判别分析结果通过二维PCA 得分图进行可视化，即以图形化的形式通过两个置信椭圆的位置关系展示，从而可以快速直观地展现TD和DGD之间的等效性关系，是对上述分析方法的有力补充。

但该方法在实际应用中也存在以下几点可改进之处：（1）在实际应用中，基于PCA 算法降维后前两个主成分的解释变异可能达不到80%，推测是因为该方法采用多批次样品、多指标信息（化学成分指标、基础药效学指标、临床药效学指标等）来判别DGD 和TD 之间的等效关系，涉及变量、样品数相对较多，导致降维效率降低；或因为样品之间的共线性本身较差，各样品之间的差异相对较大。后续可以考虑采用经过归属且具有明确药理活性的成分群（变量）进行PCA，以提高降维效率和分析准确性［22］。（2）本判别方法判断TD 和DGD 是否可以等效替代的依据是二维空间中所构建的两个置信椭圆的位置关系，然而，在三维空间中两类样本之间的位置关系基于此方法无法展现，后续研究可以考虑基于降维后的三维或多维空间的n个点（n≥4）建立置信椭球，立体化展现二者之间的关系。本研究所建方法在二维空间已经可以解释80%以上的数据变异，可以较准确地直观展现TD 和DGD 之间的关系，同时为后续三维空间方法的建立奠定了基础。（3）本文在方法效果实例验证中选取的样本量较少，若增加样本量，有望获取更多的药效学数据，得到更具代表性和广泛性的判别结果。（4）中药汤剂和配方颗粒汤剂成分众多、药效多样，成分与药效之间关系复杂［30］。本文所建方法虽是基于多个指标对其进行判别分析，但也仅能从整体上判别二者的等效性，不能分析出其化学成分与药理作用之间强度的大小，该方面的研究还需进一步的深入。

3 结 论

为方便、快速、直观化判别TD 和DGD 之间的等效性，本研究提出了一种在对多指标（化学成分指标、基础药效学指标、临床药效学指标等）信息进行降维的前提下，构建一定置信度下的置信椭圆，依据两个置信椭圆的位置关系来判别TD 和DGD 是否具有等效性的方法。对多厂家多批次炙甘草、白芍、砂仁DGD 和TD 相应数据的验证结果显示，所构建的方法可以通过二维PCA 得分图中两个置信椭圆的位置关系直观清晰地展现TD 和DGD 之间的等效性关系，有效解决了现有分析方法不直观、无法以图形化形式展示二者之间等效性、无法确定二者等效替代程度等问题，为TD 和DGD 的等效性评价提供了新的思路与方法。