基于实时无标记细胞分析技术时间维度特征的体外抗肿瘤活性评价新策略

2024-03-18刘芳彤邢淑雁刘孝云叶冬雪张国英

中国药理学通报 2024年3期

刘芳彤,邢淑雁,刘孝云,叶冬雪,杨佳,张国英,容蓉,4,杨勇

(山东中医药大学 1.中医药创新研究院、2.药学院、3.实验中心,4.中医药经典理论教育部重点实验室,5.中医药基础研究山东省重点实验室,6.山东省中医药抗病毒工程研究中心,山东济南 250355)

肺癌在全世界范围内的发病率和死亡率均居癌症之首,据美国癌症协会统计数据显示,2022年全球范围内肺癌新发病例数和死亡数占全部肿瘤的12.5%和21%,肺癌致死数约占所有肿瘤致死数的1/5[1]。2022年2月国家癌症中心发布了我国最新的癌症统计数据,肺癌占我国每年新发癌症的20.4%,每年癌症死亡的27.2%,肺癌致死数约占比所有肿瘤死亡数的28%,均高于世界平均水平,该肿瘤也是我国发病率和死亡率最高的癌症[2]。根据组织病理学分类可将其分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)及小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC),NSCLC约占85%。NSCLC又分为腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌3大亚型。其中,以肺腺癌最常见,在NSCLC中所占比例最高,且多数患者确诊已为中晚期[3]。

化疗是目前抗肿瘤治疗的常用方式,筛选合适的抗肿瘤化合物是抗肿瘤药物研究的重要领域,不同肿瘤细胞生物学特征不同,对药物敏感性也存在巨大个体化差异,通过药物筛选技术评估肿瘤细胞的敏感性和耐受性,可以确定药物的合适剂量和治疗时间[4]。以MTT、CCK-8为代表的终点法体外筛选仍然是抗肿瘤药物发现的主要手段。化合物与肿瘤细胞的相互作用是动态变化过程,然而目前常用的终点法大都是选择24 h、48 h等固定时间点检测其EC50值[5-6],这种方法存在较大的主观性或刻板性,无法全面准确反映EC50动态变化过程,无法对给药时机提供参考。实时无标记细胞分析(real time cellular analysis,RTCA)技术是基于贴壁生长在微电极表面的细胞状态改变引起贴壁电极界面阻抗改变的一种方法,具有非侵入性连续实时监测的特征,可以记录完整的细胞生长曲线及药物干预过程[7]。由于天然植物化合物库是抗肿瘤药物筛选的重要来源,有研究报道黄芩苷、黄芪甲苷及橙皮苷对于肺癌均具有较强的抗肿瘤作用[8-10]。因此,本实验基于RTCA技术,以黄芩苷、黄芪甲苷、橙皮苷和一线的抗肿瘤药物顺铂为例进行体外抗A549、H1299肺腺癌细胞活性分析,旨在建立一种反映时间维度变化特征的EC50评价新策略。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂黄芩苷(Z28S11X125952,上海源叶生物科技有限公司),黄芪甲苷(J04M8T30363,上海源叶生物科技有限公司),橙皮苷(K09S11L123847,上海源叶生物科技有限公司),顺铂(101436,MCE),胎牛血清(2022057,Vivacell公司),双抗(2321127,美国Gibco公司),DMEM培养液(8120441,美国Gibco公司),1640培养液(8120207,美国Gibco公司),二甲基亚砜(D8371,北京Solarbio公司),1×PBS缓冲液(71012000,美国Biosharp公司),0.25 %胰蛋白酶消化液(2186956,美国Gibco公司)。

1.2 仪器多功能RTCA仪(艾森生物有限公司);二氧化碳培养箱(力康生物医疗科技控股有限公司);生物安全柜(力康生物医疗科技控股有限公司);细胞计数仪(BIO-RAD公司);倒置相差显微镜(日本OLYMPUS);十万分之一分析天平(德国Sartorius公司);涡旋仪(宁波拓普森)。

1.3 方法

1.3.1细胞培养

1.3.1.1 细胞系及细胞培养液 A549细胞株(由山东大学药学院免疫研究所张建教授课题组惠赠);H1299细胞株(武汉普诺赛生命科技有限公司)。A549细胞的生长培养基：含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)+1%青霉素-链霉素混合液(penicillin-streptomycin,P/S)的DMEM完全培养基,H1299细胞的生长培养基：含10%胎牛血清FBS+1% P/S的1640完全培养基。A549细胞的维持培养基：含2%胎牛血清FBS+1% P/S的DMEM完全培养基。H1299细胞的维持培养基：含2%胎牛血清 FBS+1% P/S的1640完全培养基。

1.3.1.2 细胞复苏及培养从液氮罐中取出A549和H1299细胞冻存管,迅速放入恒温水浴锅37℃温水中,用镊子夹住轻轻摇动使其快速解冻融化,将细胞冻存管表面喷洒75%医用酒精,移入生物安全柜中,吸取细胞悬液至2 mL离心管中,以1 200 r·min-1离心3 min,弃上清,用含10% FBS和1% P/S的DMEM完全培养基重悬A549细胞,用含10% FBS和1% P/S的1640完全培养基重悬H1299细胞,将重悬后的细胞悬液移至培养皿中,在37℃、5% CO2恒温培养箱中培养,待细胞融合率达80%以上时进行细胞传代用于后续实验。

1.3.2选择最佳细胞接种密度取对数生长期A549、H1299细胞,将细胞用胰酶消化后,悬浮于细胞培养液中,吹打成单细胞悬液。16孔电极板(E-plate 16)每孔中加入100 μL细胞培养液,放入37℃、5% CO2恒温培养箱中的电极槽(RTCA Station)上检测基线。基线检测完毕,取出E-Plate 16,每孔加入100 μL不同浓度(2.5×103、5×103、1×104和2×104个/孔)细胞悬液,设4个重复孔。于超净台中室温静置30 min后,置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中的RTCA Station继续监测。每15 min记录一次细胞指数(cell index,CI),连续监测48 h,观测并记录细胞生长曲线,选择最佳接种密度。

1.3.3RTCA实时监测天然产物和顺铂的抗肿瘤活性取对数生长期A549细胞,将细胞用胰酶消化后,悬浮于细胞培养液中,吹打成单细胞悬液。将A549细胞悬液(1×104个/孔)接种于E-plate 16,每孔100 μL,置37 ℃、5% CO2恒温培养箱中的RTCA Station上孵育。待细胞长至80%融合度(约24 h),暂停RTCA,取出E-plate 16,吸弃E-plate 16中剩余培养液,以顺铂为阳性对照药,加入用细胞维持培养基稀释得到的一系列浓度的顺铂及中药活性成分药液,每个浓度设2个复孔,每孔加100 μL药液,同时设置细胞对照组,将E-plate 16放入RTCA Station中,RTCA继续监测细胞状态,每隔15 min记录一次阻抗,继续连续监测48 h。H1299细胞同上。

1.3.4数据分析将得到的细胞完整生长曲线用RTCA Software Pro进行分析,并借助GraphPad Prism、Origin Pro软件做图。

2 结果

2.1 细胞最佳接种密度不同接种密度的A549细胞增殖曲线如Fig 1A所示。A549细胞接种密度为2.5×103个/孔时,CI值在观察时间内未发生明显变化,CI值略有上升;接种密度为5×103细胞/孔时,CI值48 h内缓慢增长,CI值相对较低,细胞密度小导致平台期时间较长;接种密度为1×104细胞/孔时,CI值在24 h内呈对数生长趋势持续增长,约24 h细胞达到80%融合度,约44 h后进入平台期;接种密度为2×104细胞/孔时,10 h内细胞呈对数增殖趋势,10 h后CI值增长缓慢且28 h后有下降趋势,推测因为细胞密度大致使培养基消耗快,细胞因缺乏营养而出现死亡。综上分析,1×104细胞/孔为A549细胞最佳接种密度。

H1299细胞接种密度为5×103细胞/孔时,CI值0～29 h增长缓慢,29～48 h细胞呈对数增长趋势;接种密度为1×104细胞/孔时,在第24 h达到短暂平台期,继续生长至35 h达到平台期;接种密度为2×104细胞/孔时,20 h内细胞呈对数增殖趋势,20 h后CI值增长缓慢且35 h后有下降趋势(Fig 1B)。综上分析,1×104细胞/孔为H1299细胞最佳接种密度。

Fig 1 The growth curve of A549 cells and H1299 cells at different seeding densities

2.2 不同天然产物及顺铂抗肿瘤活性检测RTCA实时监测不同天然产物及顺铂干预后的细胞生长曲线见Fig 2。黄芩苷、黄芪甲苷、橙皮苷及顺铂对A549细胞与H1299细胞的抗肿瘤活性均出现浓度依赖性的抑制作用,随着药物浓度的升高,细胞增殖曲线CI值降低,表现出更强的抑制细胞增殖的作用。

2.3 数据分析采用RTCA Software Pro 2.6.0对每个检测时间点的EC50计算,EC50计算公式为 Sigmoidal dose-response (variable slope)：Y=Bottom+(Top-Bottom))/(1+10^[(logEC50-X)×Hill Slope])。在“Y Axis”中选择“%Control”即给药孔相对于正常对照孔CI值的百分率,可消除细胞本身的影响。点击“Normalization Time”选择加样的时间点,可抵消加样前细胞生长的差异。黄芩苷、黄芪甲苷、橙皮苷及顺铂对A549、H1299细胞24 h、48 h单个时间点的EC50值如Tab 1所示。

Tab 1 EC50 of natural products and cisplatin on A549 and H1299 cells by endpoint method

将加样点作为0 h点,用GraphPad Prism 8.4.2做图,见Fig 3。Fig 3显示受试液/药对细胞的EC50在不同时间点存在波动。如顺铂作用于A549细胞,在药物干预后0～24 h,EC50波动较大。另外,当EC50相对稳定时,需对其相关系数R2进行考察。橙皮苷对A549细胞的EC50在21.5～48 h内相对稳定,但其在29.75～48 h时间段内的R2<0.9,因此这个时间段内的EC50值并不准确。将相邻4个点的EC50进行线性拟合,以斜率为纵坐标,时间点为横坐标作图,如Fig 4所示。以相邻4个点的EC50线性拟合后|斜率|≤1、R2>9为标准,选择连续时间段,计算这一时间区间内每个检测时间点EC50的平均值作为其EC50,表示为Mean±SD。黄芩苷、黄芪甲苷、橙皮苷及顺铂作用于A549细胞,分别在16～48 h、32.25～48 h、21.5～29.75 h及27.5～48 h时间区间内EC50相对稳定且R2>0.9,黄芩苷、黄芪甲苷、橙皮苷及顺铂作用于H1299细胞,分别在19.5～48 h、14～48 h、12.75～46.25 h及10.25～48 h时间区间内EC50相对稳定且R2>0.9,选择相应区间EC50平均值作为其EC50。黄芩苷、黄芪甲苷、橙皮苷及顺铂对A549细胞、H1299细胞带有时间维度特征的EC50值如Tab 2所示。

Fig 3 Fitted curve of EC50 values of A549 and H1299 cells treated with different natural products and cisplatin

Fig 4 A549 and H1299 slope of EC50 linear fit for adjacent 4 detection points

Tab 2 EC50 of natural products and cisplatin on A549 and H1299 cells characterized by time dimension

3 讨论

RTCA技术是将微电子生物感应芯片整合在细胞培养板的孔中,通过活细胞与检测板孔中微电极相互作用,电阻抗发生改变,系统将这些信号转化为特定的参数-细胞指数来衡量细胞的状态[11]。该技术通过实时无标记连续监测提供细胞对不同刺激响应的动力学数据,如药物的细胞毒性[12]、病毒感染引起的宿主细胞数量、大小、附着强度和细胞间黏附力(即屏障功能)的变化等[13],具有操作简单,灵敏度高和重复性好等特点。

A549、H1299细胞是人NSCLC研究最常用的上皮类型细胞株,在NSCLC研究中具有一定的代表性。顺铂等铂类抗癌药物通过损伤DNA诱导细胞发生凋亡,是临床上治疗各种恶性肿瘤的主要化疗药物。有研究报道,黄芩苷通过抑制Akt/mTOR通路,体外抑制A549和H1299细胞的活力、侵袭和转移,诱导肺癌细胞凋亡和细胞周期阻滞[14]。黄芪甲苷通过调控PKC-α-ERK1/2-NF-κB通路,抑制A549细胞的增殖、迁移和侵袭[15]。橙皮苷通过调节线粒体通路相关蛋白及细胞周期相关蛋白水平,抑制A549细胞增殖和诱导细胞凋亡[16]。本实验以A549细胞和H1299细胞作为细胞模型,以天然植物化合物黄芩苷、黄芪甲苷、橙皮苷和一线抗肿瘤药物顺铂为例,采用RTCA技术监测其抑制肿瘤细胞增殖的情况,细胞生长曲线(Fig 2)显示黄芩苷、黄芪甲苷、橙皮苷及顺铂对A549细胞与H1299细胞的抗肿瘤活性均出现浓度依赖性的抑制作用。

在进行体外抗肿瘤药效评价时EC50是一个重要指标,目前研究多采用MTT、CCK-8等终点法计算供试品EC50值。胡翔东等[17]在用不同浓度顺铂处理肿瘤细胞24 h后,MTT法测定细胞活力并计算EC50,顺铂对A549和H1299细胞的EC50分别为52.84 mg·L-1和15.53 mg·L-1;郑海峰等[18]研究黄芩苷对A549细胞凋亡的影响,测定黄芩苷对A549细胞24、48、72 h的EC50值分别为7.38、5.04、3.94 mg·L-1。我们应用RTCA Software Pro 2.6.0计算黄芩苷、黄芪甲苷、橙皮苷及顺铂对A549、H1299细胞24 h、48 h固定时间点的EC50值如Tab 1所示,不同时间点的EC50值存在一定差异。将RTCA实时连续监测的48 h中若干个时间点作图分析,发现某些受试液/药对肿瘤细胞的EC50在不同时间点存在较大波动(如Fig 3顺铂干预A549细胞),提示终点法检测24 h、48 h等某个固定时间点的EC50存在一定主观性或刻板性,无法准确全面反映EC50动态变化过程。另外,当EC50相对稳定时,有些受试液/药对肿瘤细胞的EC50的曲线拟合相关系数随时间延长而降低(如橙皮苷干预A549细胞),提示计算的EC50可靠性降低。因此,本实验中选用受试药/液对肿瘤细胞的EC50值相对稳定(相邻4点EC50线性拟合后|斜率|≤1)且曲线拟合相关系数>0.9时,计算此时间段内EC50的平均值作为具有时间维度特征的EC50(Mean±SD)。如Fig 5所示,在对应时间维度内,顺铂对A549细胞及H1299细胞的EC50值最小,其它提取物对A549细胞的EC50从小到大依次为黄芩苷、黄芪甲苷、橙皮苷;对H1299细胞的EC50从小到大依次为橙皮苷、黄芩苷、黄芪甲苷。不同肿瘤细胞对药物的敏感性存在差异,此方法若应用于来源于患者的肿瘤细胞,可更加直观的观察肿瘤细胞对药物的耐受性和敏感性,为肿瘤患者的个性化治疗提供参考。顺铂、黄芩苷和黄芪甲苷抗A549细胞的时间窗口偏后(起效在30 h左右以后),橙皮苷抗A549细胞时间窗口偏前(起效在30 h之前);这些受试液/药对H1299细胞作用时间窗口差别不大。这些数据显示不同的受试品抗肿瘤有效的时间段是不一样的,提示这种不同有效时间的抗肿瘤药物可能为临床两药联合或多药联合的给药时机提供参考。