20味中药体外抑制奇异变形杆菌的研究

冯玉树,李贵琴,李冰慧,李勤凡,王 妍

(西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌 712100)

奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)为无荚膜、无芽孢、有鞭毛和有菌毛的革兰氏阴性杆菌,广泛分布于自然界、动物肠道、粪便[1]。是一种重要的条件致病菌,可感染人[2]、牛[3]、犬[4]、鸡[5]等,能够引起食物中毒、尿路感染、腹泻、肺炎、败血症等多种疾病。近年来奇异变形杆菌引起的人畜疾病屡见不鲜,对牛养殖业造成的损失也日益突出。由奇异变形杆菌引发的犊牛腹泻病案例逐年增多[6-7],主要症状为腹泻、脱水、败血症等、严重者死亡,同时感染的动物也可成为人类变形杆菌感染的潜在来源。为避免抗生素不合理使用导致的菌株耐药性增强,迫切需要探究合理的用药方案来控制此类疾病的发生。近年来针对变形杆菌的中药抑菌研究颇多[8-9],但均是对单味药进行研究,中药联合抑菌方面的研究较少。为寻找合理的中兽药抗菌方案,本试验选择20味先前报道有抑菌作用的中药,探究对奇异变形杆菌的抑菌作用,筛选抑菌效果较好的中药,分析其不同组合的联合抑菌效果,以期为感染奇异变形杆菌的动物临床合理用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和培养基 菌种由宁夏某牛场犊牛腹泻样本分离到并经鉴定为奇异变形杆菌,由本实验室保藏。M-H肉汤培养基,海博生物技术有限公司产品;琼脂粉、营养肉汤培养基,北京奥博星生物技术有限公司产品。

1.1.2 中药材 薄荷、厚朴、艾叶、香附、黄连、连翘、桂枝、金银花、青蒿、半枝莲、丁香、知母、黄芩、穿心莲、诃子、肉豆蔻、芦荟、石榴皮、五倍子、鱼腥草,购于陕西华仁堂大药房。

1.1.3 主要仪器 高压蒸汽灭菌锅LS35HG,江阴滨江医疗设备有限公司产品;恒温摇床100B,上海世平实验设备有限公司产品;恒温培养箱MJP150,上海精宏实验设备有限公司产品;旋转蒸发仪RE-52AA,上海亚荣生化仪器厂产品;循环水多用真空泵SHB-B,郑州长城科工贸有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 中药提取物的制备 取20 g中药打磨成粉,加入10倍体积去离子水,浸泡过夜,大火煮沸之后文火煮1 h,减压过滤,回收滤液,残渣加入5倍体积去离子水煮沸之后文火煮30 min,减压过滤,合并2次滤液旋转蒸发浓缩至20 mL(中药浓度1 g/mL)。

1.2.2 中药提取物对奇异变形杆菌的MIC和MBC测定 采用微量二倍稀释法进行测定。将MH培养基加入96孔板,对药液进行稀释,加入同体积载菌量为1×106CFU/mL的奇异变形杆菌菌液。平行对照3个,并设阳性对照、空白对照,37℃培养24 h。每孔避光加入10 μL浓度为0.2 mg/mL的碘硝基四唑紫指示剂,继续培养30 min,眼观无菌生长的最低浓度即为MIC值。将上述澄清透明液体各孔吸出0.1 mL,均匀涂抹于营养琼脂平板,37℃培养24 h,未长菌的平板上所涂原液浓度为药物的MBC,试验重复3次。当MIC<7.80 mg/mL为高度敏感;7.80 mg/mL≤MIC≤250 mg/mL为中度敏感;MIC>250 mg/mL为不敏感。

1.2.3 棋盘法联合抑菌试验 选取1.2.2中抑菌效果好的中药提取物,采用棋盘稀释法检测两两联合用药对奇异变形杆菌的抑制效果。菌液浓度为1×106CFU/mL,各药物终浓度梯度为4、2、1、1/2、1/4、1/8 MIC,并设阳性对照、空白对照,37℃培养24 h。每孔避光加入10 μL浓度为0.2 mg/mL的碘硝基四唑紫指示剂,继续培养30 min,观察各孔细菌生长情况。所有试验重复3次。

计算联合抑菌指数(FIC):FIC指数= MICA药联用/MICA药单用+ MICB药联用/MICB药单用,FIC指数<0.5为协同作用,FIC指数0.5～1.0 为相加作用,FIC指数1.0～2.0为无关作用,FIC指数>2.0为拮抗作用。

1.2.4 时间杀菌曲线的测定及绘制 选取1.2.3中的中药组合进行联合效果确证试验,设计不同药物组合测定其对奇异变形杆菌的时间-杀菌曲线。将配制好的浓度为2×105CFU/mL菌悬液分别加于同体积药液中,使菌悬液终浓度为1×105CFU/mL。混匀后放入37℃摇床内培养,并设阳性对照、空白对照。分别于0、2、4、6、8、12、24 h吸取培养液,用无菌0.9%氯化钠溶液进行10倍梯度稀释,选取合适稀释度菌悬液,50 μL涂布于营养琼脂平板上,37℃培养24 h后进行菌落计数,所有试验重复3次。取平均数的对数绘制出时间杀菌曲线,根据菌落计数判断抑菌效应。培养24 h后,联合用药的与单用药效果最好的相比,如果降低≥2 Log10CFU/mL则认为协同作用;降低1～2 Log10CFU/mL,则认为相加作用;降低<1 Log10CFU/mL则认为无关作用;增加≥2 Log10CFU/mL,则认为拮抗作用[10]。

2 结果

2.1 中药提取物对奇异变形杆菌的体外抑菌效果

不同中药提取物的抑菌活性差异较大(表1),根据MIC值可以判定诃子、薄荷、黄连、艾叶、知母、金银花、五倍子7种中药提取物有较好抑菌效果。其中诃子水提物对奇异变形杆菌的抑制效果为高度敏感,其余6种中药为中度敏感。选取这7味药进行联合抑菌试验,进一步筛选表现协同作用的中药组合。

表1 20味中药对奇异变形杆菌的抑菌效果

2.2 中药提取物对奇异变形杆菌的体外联合抑菌活性

选取对奇异变形杆菌高敏的诃子与中度敏感的6种药物两两组合,对奇异变形杆菌的体外抑菌活性如图1。其中诃子和薄荷组合FIC值为0.31,表现为协同作用;诃子和黄连、诃子和金银花、诃子和艾叶、诃子和五倍子的FIC值分别为0.56、0.56、0.75、0.56,表现为相加作用;诃子和知母的FIC值为1.13,表现为无关作用。

2.3 诃子、薄荷单用和联用对奇异变形杆菌杀菌效果

将培养基中加有不同中药提取物的奇异变形杆菌培养24 h,分别于0、2、4、6、8、12、24 h吸出部分菌液计算浓度、绘制曲线(图2),培养24 h时,各单独给药组的细菌载量相对于阳性对照组减少1.9～12.2 Log10CFU/mL,表示7种药物都对奇异变形杆菌的生长有不同程度的抑制作用。其中诃子和知母联用组效果较好单药诃子组菌落数升高约1.8 Log10CFU/mL,表现无关作用(图2A);诃子和薄荷联用组比效果较好单药薄荷组菌落数降低约4 Log10CFU/mL,表现为协同作用(图2B)。其余4组诃子和艾叶联用组、诃子和金银花联用组、诃子和黄连联用组、诃子和五倍子联用组比最强单药组菌落数减少约1～2 Log10CFU/mL,表现为相加作用(图2C～F)。其中五倍子和诃子联用组于接种后8 h时,菌落数降为0,表示两药联用能发挥很好的杀菌作用(图2F)。

图2 不同中药提取物组合的对奇异变形杆菌的时间-杀菌曲线

3 讨论

随着奇异变形杆菌性腹泻发生率的持续增高[6-7],病原菌的耐药性增强和抗生素残留问题日益严重,使得“减抗、替抗”成为主流新药研发方向。而大多数中药有效提取物对细菌、病毒、寄生虫等病原都有广泛的抑制作用,使其逐步应用于临床感染性疾病的治疗。

为寻找抑制奇异变形杆菌生长的高效中药,本试验选取了20味中药,通过体外抑菌试验,从中筛选出诃子、薄荷、黄连、艾叶、知母、金银花、五倍子7味药对奇异变形杆菌的抑制作用较强,体外抑菌能力明显优于其他中药。其中诃子的抑菌效果最好,MIC值达到3.9 mg/mL,与诃子对大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌的抑菌效果8.51～8.61 mg/mL有差异[11],可能为不同产地和批次的中药材所含有效抑菌物质量不同,或者药物对不同菌株的抑菌能力不同有关。

本试验对这7味中药提取物进行联合抑菌试验分析,通过棋盘法和绘制时间-杀菌曲线两种方法,证明了诃子和薄荷提取物的联合抑菌效果表现为协同作用;诃子和黄连、诃子和金银花、诃子和艾叶、诃子和五倍子表现为相加作用;诃子和知母表现为无关作用。其中诃子和五倍子组合在8 h内完全杀菌,在几种联用组合中效果最好。诃子与石榴皮、诃子与抗生素联用都有协同效果[12-13],诃子与薄荷联用具有互相增强的作用,可以适当减少用量节约成本。诃子提取物的主要抑菌成分为多酚类、三萜类、诃子酸等[14];薄荷提取物的主要抑菌成分为黄酮、萜类等[15]。但具体是哪种物质之间的相互作用使药物对奇异变形杆菌生长的抑制作用增强还需进一步研究。

本试验用牛源腹泻样本中分离鉴定的奇异变形杆菌进行中药抑菌试验,从中选出效果较好的中药,进行组合测定体外联合抑菌效果,为诃子、薄荷、五倍子等联合用药的进一步研究提供了资料。