改良方法与传统方法对富血小板血浆血小板回收率的对比研究

邓述欢，黄少媛，张栋武

（1·佛山市顺德区乐从医院，广东 佛山 528315；2·佛山市高明区人民医院，广东 佛山 528500）

富血小板血浆（Platelet-Rich Plasma，PRP）是一种通过离心自体外周血获得的血小板浓缩物[1]。研究已证实 PRP 激活后，血小板中的 α 颗粒可释放PDGF、VEGF、TGF-β、IGF 和 EGF 等多种生长因子[2-3]。PRP具有促进组织修复的作用，且来源于自体，具有无排斥反应和来源便捷等优势，临床上已广泛用于骨不连、慢性肌腱损伤、慢性创面、关节内软骨损伤和骨关节炎等多种疾病的治疗[4-7]。目前，临床上使用的 PRP 制备套装主要采用二次离心法和一次离心法。血小板回收率是用于比较制备方法优劣的指标，有学者[8]用血小板回收率对4 种不同参数的PRP 制备方法进行了比较，分析方法的优劣，并提出了改良方法。传统的血小板回收率计算公式为：血小板回收率=（PRP 体积×PRP 中血小板浓度）/（全血体积×全血中血小板浓度）×100%；用此方法计算的血小板回收率均较低，在 46·9%左右[9-12]。此方法计算血小板回收率受较多因素的影响，特别是受人为因素的影响较大,进而影响PRP在临床中的治疗效果，使得PRP 在临床治疗中的推广受限[13-15]。在制备PRP 时因血小板在中高速离心后多聚集在管底部，且有聚集成团的现象，操作者通常用吸管吹打数次后取100 μL 移于PVC 管用于计数，吹打次数不够，血小板未充分悬浮，可导致计数偏低。其次因为PRP 的血小板浓度是基数血小板的数倍，而仪器计数有线性范围，有学者通过对某款仪器进行性能分析发现，其线性范围为( 0 ～977)×109/L, 而PRP的血小板浓度常有超过这一范围的情况，所以易导致误差。本研究通过对贫血小板血浆（Platelet-Poor Plasma,PPP）的血小板计数，用差值计数法得到PRP的真实浓度，再用血小板回收率的计算公式计算回收率。该方法不受上述因素影响，准确度可提高。研究表明，PPP 计数法的回收率明显高于PRP 计数法的回收率，且其方法简单不需要额外的仪器，只要有血球分析仪的实验室都可开展，是值得推广的方法。

1 材料与方法

1·1 实验对象选择标准

取 68 例成年健康志愿者的外周血（6 支 9mL/例）。其中男39 例，女29 例；年龄18 ～68 岁，平均42·6 岁。研究纳入标准：（1）符合《中华人民共和国献血法》和中华人民共和国卫生部颁布的《献血体格检查标准》相关要求的健康人群，血红蛋白：男性≥120 g/L，女性≥ 110 g/L；血小板计数≥100×109/L［正常值（100 ～300）×109/L］。（2）采血前7 d 内未服用影响血小板功能和凝血系统的药物。（3）无临床可见的肝肾功能性疾病、传染性疾病、相关血液疾病、恶性肿瘤、严重心脑血管疾病及感染等，依从性好且愿意配合进行相关检测及随访，资料齐全。 研究排除标准：在纳入标准的基础上将依从性差，或有其他不适宜做此项研究之基础疾病如血小板减少等的患者、资料不全或失联者均排除在本次研究项目之外。本研究之目的、预期结果及潜在风险经过本单位道德伦理委员会讨论认定符合道德伦理标准要求（乐从医伦字20220124）。

1·2 主要试剂与仪器

枸橼酸钠抗凝管（广州阳普医疗器械有限公司，10 mL/支）；一次性使用采血针（广州阳普医疗器械有限公司）；生物安全柜（山东济南鑫贝西生物技术有限公司）、离心机（山东百欧医疗科技有限公司，TDL-500C 型）、全自动血液分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，BC5390CRP）。

1·3 PRP 制备方法

方法：（1）用9 mL 的枸橼酸钠一次性采血管抽血6 支（用于制备PRP），用2 mL 的枸橼酸钠一次性采血管抽血1 支（用于PLT 计数）。（2）将6 支血样放入离心机第一次离心（参数160g、20 min，升9 降9），离心后取血浆放入洁净离心管，对收取的离心管内血浆（PPP 血浆）进行充分混匀，并记录体积，取100 μL 混匀的血浆放入PVC 管进行血小板计数。（3）对混匀的血浆进行第二次离心（离心参数：460g、15 min，升9 降9）。（4）第二次离心后，留下管底的2 mL富血小板血浆（PRP管），用吸管把上层的泛血小板血浆吸到另一支一次性离心管（PPP 管）中。充分混匀PRP 管并取100 μL 置于PVC 管中进行PLT 计数，得到数据组（PRP 血浆直接PLT 计数组）；充分混匀PPP管并取100 μL置于PVC管中进行PLT计数，得到数据组（PPP 血浆PLT 计数组）。

1·4 数据收集及计算血小板回收率

用两组数据及相应的方法计算其相应的血小板回收率。分别为传统方法计算的血小板回收率（公式1）：血小板回收率=（PRP 体积×PRP 中血小板浓度）/（全血体积×全血中血小板浓度）×100%；改良法计算的血小板回收率（公式2）∶血小板回收率=(第一次离心后的血浆血小板计数×第一次离心后血浆的体积-PPP 的血小板计数×PPP 的体积)/（全血体积×全血中血小板浓度）×100%。

1·5 统计学方法

对所有结果采用GraphPad Prism统计软件进行分析。

2 结果

用PRP 直接计数的血小板回收率，平均回收率为66·8%，最高回收率为95·7%，最低回收率为21·5%；PPP 直接计数的血小板回收率，平均回收率为75·9%，最高回收率为98·8%，最低回收率为35·7%。PPP 直接计数的血小板回收率显著高于PRP 直接计数的血小板回收率，P＜0·05。见图1。

图1 血小板回收率比较

3 讨论

PRP是一种自身血液经过离心去除红细胞而得来的浓缩血小板血浆，尽管被医疗领域广泛应用，但不少文献认为PRP 在某些领域并不适用。目前，PRP 在慢性腱鞘炎、骨关节炎治疗、医美领域应用广泛，在整形外科领域的应用逐渐被重视，但是应用效果却不尽相同，争议众多，其根本原因在于PRP 制作最终质量不同[2,6,10]。看似是简单的制作流程，但由于缺乏普遍认可的PRP 制作质量控制标准，多种因素（尤其是制作人操作水平、离心次数、离心机参数等因素）均可造成血小板回收率的较大差异，导致成品PRP 质量参差不齐，进而导致应用效果及临床作用不尽相同。PRP 作为一种高浓度血小板浓缩物被应用于临床由来已久，尤其是在慢性损伤修复、运动损伤修复、烧烫伤创面修复方面功效明显；因血小板中富含生长因子、细胞因子和抗菌肽等多种生物活性物质，具有促进细胞增殖、分化、基质合成、组织再生与修复等作用，而被临床所重视，因此近来在临床多个领域被广为推崇，但由于PRP 制备方法受到人员素质、设备性能、计算方式等诸多因素制约，导致PRP 质量参差不齐，随着行内专家共识指导性文件[1]的出现，这一现象得到改观。由于PRP 制备方法大多以一次离心法、二次离心法及三次离心法等手工法为主，导致血小板回收率参差不齐（从21·5%～98·8%不等），但二次离心法或三次离心法血小板回收率显著高于一次离心法，Harriso 等[5]通过对6 种离心所得的PRP 分析发现，血小板回收率差异较大，其总体回收率介于（53±18）%至（72±13）%之间，血小板计数值介于（568～1062）×109/L之间，白细胞计数、红细胞比容等有形成分也各不相同，提示不同离心力参数制备的PRP 质量差异较大；有学者[7-10]采用不同离心参数及全血规格制备了PRP，比较了血小板回收率和纯度，结果表明：三次离心法制备的PRP 纯度较高，但血小板回收率偏低，不适合用于医美或其他慢性修复，只适合制备冰冻血小板等。还有研究发现[11-13]：采用不同离心力参数离心法（先1000 g 离心10 min，再1500 g 离心15 min）制备所得的 PRP 血小板回收率最高，值得推广；但有学者提出了不同看法[14-16]，认为这种方法跟分步离心法并无不同，且血小板回收率未见提升。

为提高PRP 制作水平，获得稳定的、纯度较高的、血小板回收率符合要求的PRP，在总结各类普遍使用的PRP 制作方法之基础上，本文作者采用二次离心法制备PRP，通过先制备PPP，而后再将PPP 第二次离心取得PRP，结果显示：血小板回收率显著高于一次离心获得的PRP，血小板回收率符合要求，取得满意效果；PRP 含有数倍于血小板生理浓度的血小板浓缩物，研究认为，PRP 中的血小板计数达到全血3 ～6 倍以上才能起到治疗作用[16-17]。有学者在研究后认为，衡量PRP 成品质量的指标主要是血小板富集系数和回收率[18-20]。所以在实际工作中如何把回收率计算准确是亟待解决的问题。直接行PLT 计数的影响因素较多，具体包括：操作人员在工作中的操作会影响PLT 的计数准确度，如操作人员吹打的时间和力度不同；因PRP 中PLT 的浓度不同，PLT离心会聚成块状，同样的力度吹打，血小板散开的程度不同，吹打后涂片用显微镜观察通常会有肉眼无法观察到的小凝块；血细胞分析仪的分析原理主要是电容型、电阻抗型、激光型、光电型、联合检测型、干式离心分层型和无创型，不管是哪一种类型都无法区分聚集的血小板小块，再者血细胞分析仪的检测能力都有一个线性范围，超过线性范围的PLT 浓度的标品就会失真。本研究采用分步离心法先取得PPP，再将PPP 离心取得PRP，较好地解决了血小板回收率不足等问题，值得临床推广。

现在一般的血细胞分析仪的PLT 计数线性范围在（0 ～1000）×109/L，采用PRP 制品直接行PLT 计数结果的准确性值得怀疑。用传统的血小板回收率的计算公式算出的回收率其准确性必然大打折扣。血小板数值直接与临床治疗效果相关联[4,8-9,16]，因此，制备出高质量的PRP 意义重大。但是，制备PRP 受诸多因素制约，如环境温度、操作者技术水平、离心次数等等，所以，PRP 制备好后的PLT 计数就显得非常重要；本研究用改良方法计算的血小板回收率，其公式用到的两个PLT 计数都不会超出线性范围，计数的准确性是有保障的，第一次离心的计数，因是低速离心，取血浆的PLT 计数通常是原血血小板计数的一倍左右，涂片镜检也没发现有聚集现象。PPP 的血小板计数通常在100×109/L 左右,在仪器的线性范围内,其计数的准确性也有保障。所以改良法血小板回收率计算公式的各变量都能准确测得，其计算所得的回收率是准确可靠的。从上述统计结果来看，改良法计算的回收率的平均值是84%，而传统法计算的回收率平均值是72%，高出12%，两者差异有统计学意义（P＜0·05）。改良法回收率的计算不需要测PRP 的血小板计数，所以在制作PRP 时就不用取部分PRP 血浆用来计数，从而减少了污染的风险，提高了PRP 血浆质量，尤其在侵入性方式使用PRP 的医美领域或慢性损伤性修复领域，防止污染PRP 进入人体是影响修复是否达到预期的关键因素[17-20]，值得临床重视。

综上所述，本研究采用的改良法制备的PRP 成品，血小板回收率比传统法明显更优，血液其他有形成分计数与传统方法比较未见明显差异，且减少了PRP 被污染的风险，血小板计数值符合医美、慢性炎症修复之临床应用要求，值得推广。本研究存在的不足之处在于：试验样本量不足，导致PRP 质量评价缺乏大数据支撑。关于PRP 制备方法、离心参数、质量评价标准体系文件的建立，依然需要临床同行继续努力，这也是本研究组成员今后努力之方向。