HPLC-MS法同时测定大鼠血浆中那格列奈及其主要代谢物M1

卞乐乐 潘静 郑永克

那格列奈（Nateglinide），化学名N-（反-4-异丙基环己基羰基）-D-苯丙氨酸，是一种高效降糖药，2001 年被FDA 批准单独或与二甲双胍合用治疗2 型糖尿病［1］。该药可以阻滞胰岛细胞ATP 敏感钾通道，引起细胞膜去极化，从而促进胰岛素释放。餐前服用可快速起效且作用时间短，可有效控制餐时血糖水平，低血糖发生率低［2］。日本学者已在动物尿液和胆汁中分离并鉴定出那格列奈的12 种代谢产物［2-3］，其主要代谢物为N-［反-4-（1-羟基-1-甲基乙基）-环己基羰基］-D-苯丙氨酸，简称M1，占全部代谢物的62%～66%，其活性为那格列奈的1/5［4］。基于此，单一测定那格列奈的药时曲线无法完全反映该药物在体内的药代与药效过程。因此，寻找合适的方法测定那格列奈及其主要代谢物M1的血药浓度是临床前及临床研究必不可少的重要技术手段。本实验拟建立一种简单、快速、灵敏度高的HPLC-MS 法，同时测定大鼠血浆中那格列奈及其代谢物M1 的浓度。

1 材料与方法

1.1 仪器 高效液相色谱串联质谱HPLC-MS 2020 系统（日本Shimadzu 公司），配备电喷雾离子源（ESI）及Labsolution 工作站（日本Shimadzu 公司）；Milli-Q Gradient A10 超纯水机（美国Millipore 公司）；Thermo Sorvall Stratos 台式高速冷冻离心机（美国Thermo 公司）；SpeedVac 浓缩挥干仪（美国Thermo 公司）；十万分之一天平（美国梅特勒-托利多公司）。

1.2 试剂 那格列奈标准品（纯度99.9%，大连美仑生物技术有限公司）；代谢物M1（纯度99%，美国ChemShuttle 公司），结构如图1 所示；非那西丁（纯度98%，大连美仑生物技术有限公司）；乙腈为质谱级（美国Merck 公司），其他试剂均为分析级。

图1 那格列奈与代谢物M1的化学结构

1.3 动物 健康雄性Sprague-Dawley 大鼠6 只，体质量（200±20）g，由南京集萃药康生物科技有限公司提供，合格证编号：SCXK（苏）2018-0008；No.2021081426。

1.4 方法 （1）溶液配制：精密称取那格列奈10.0 mg与M1 5.0 mg 置于10 mL 容量瓶中，加入甲醇定容，摇匀即得1 mg/mL 那格列奈与0.5 mg/mL M1 混合储备液，再依次稀释成含有那格列奈0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μg/mL 和M1 0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 μg/mL 的混合标准系列溶液；精密称取非那西丁5.0 mg 置于10 mL 容量瓶中，加入甲醇定容，摇匀即得0.5 mg/mL 非那西丁储备液，再稀释成0.5 μg/mL 的内标溶液。（2）血浆样品处理：取血浆样品100 μL 于离心管中，依次加入非那西丁内标溶液10 μL 和1 mL 乙酸乙酯。涡旋5 min，10,000 r/min离心5 min。转移上清液至另一离心管中，浓缩挥干后，残留物加100 μL 流动相复溶，18000 r/min 离心5 min 后，2 μL 进行分析。（3）色谱条件：色谱柱：岛津C18 柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相：0.1%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～8 min，40%B；8～8.5 min，40%→70% B；8.5～14.5 min，70% B；14.5～15 min，70%→40% B；15～18 min，40% B）；流速0.2 mL/min；柱温40 ℃。（4）质谱条件：采用电喷雾离子源（Electron Spray Ionization，ESI）以及选择性离子监测（Selected Ion Monitoring，SIM）阳离子模式；检测对象［M+H］+：那格列奈m/z 318.2，代谢物M1 m/z 334.1，内标非那西丁m/z 180.1；雾化气3 L/min；干燥气15 L/min；DL 管温度250 ℃；Heat Block 温度300 ℃。

2 结果

2.1 专属性 取6 份来源不同的大鼠空白血浆、混合标准溶液、空白血浆加标准品以及大鼠含药血浆，按照“1.4 项”测定，得到空白血浆色谱图并与相应的混合标准溶液、血浆加标准品及大鼠含药血浆色谱图进行比较。结果表明，在实验条件下，那格列奈、M1 和非那西丁的保留时间分别约在15.4 min、7.9 min 和7.0min，峰形良好，无杂峰干扰（图2）。本方法具有优秀的专属性，可在复杂样品中识别目标物质。

图2 专属性考察（分别检测下列样品中的那格列奈及其代谢物M1，以考察该方法的专属性）。A.空白血浆；B.定量下限LLOQ标准溶液；C.空白血浆+标准溶液；D.大鼠口服10 mg/kg那格列奈30 min后的含药血浆

2.2 标准曲线与线性范围 取混合标准系列溶液各10 μL，分别加入100 μL 空白大鼠血浆，按照“1.4 项”测定，记录那格列奈峰面积（As1）、M1 峰面积（As2）及内标峰面积（Ai），以比值f=As/Ai 的平均值对血药浓度（C）作回归计算，得回归方程（图3）；那格列奈与M1 的定量下限分别为62.5、31.25 ng/mL；线性范围为0.0625～8 μg/mL（那格列奈），0.0313～4 μg/mL（M1）。

图3 那格列奈与其代谢物M1的标准曲线

2.3 准确度与精密度 使用混合标准溶液配置不同浓度的那格列奈和M1 质控样品。其中，那格列奈和M1浓度分别为定量下限（0.0625、0.0313 μg/mL）、低浓度（0.125、0.0625 μg/mL）、中浓度（0.5、0.25 μg/mL）、高浓度（6.4、3.2 μg/mL），每份样品平行做5 份。按照“1.4 项”测定，并配备随行标准曲线，连续测定3 d，得到日内和日间准确度与精密度。结果所示，那格列奈的准确度为94.1%～107.2%，精密度变异＜9.9%；M1 准确度为94.7%～107.4%，精密度变异＜7.7%。

2.4 基质效应 取6 份不同来源的大鼠空白血浆100 μL，按照“1.4 项”处理，并在挥干后分别加入10 μL低、中、高三个浓度的混合标准溶液，用100 μL 流动相复溶进样，得各峰面积（那格列奈As1、M1 As2、内标Ai）。样品中那格列奈和M1 浓度分别为低浓度（0.125、0.0625μg/mL）、中浓度（0.5、0.25 μg/mL）、高浓度（6.4、3.2 μg/mL）。另取10 μL 低、中、高三个浓度的混合标准溶液分别加入10 μL 内标溶液，再加入100 μL 流动相复溶进样并计算得各峰面积均值（那格列奈as1、M1 as2、内标ai）。以公式e=（As/as）/（Ai/ai）计算内标归一化基质因子。结果显示，低、中、高三个浓度那格列奈基质效应＜4.7%，M1 基质效应＜5.0%。

2.5 回收率 按照“2.3 项”制备低、中、高三个浓度的质控样品（不加内标溶液），并在复溶时加入10 μL非那西丁内标，测定得各峰面积（那格列奈As1、M1 As2、内标Ai）。另取10 μL 低、中、高三个浓度的混合标准溶液分别加入10 μL 内标溶液挥干，再加入100 μL 流动相复溶测定并计算得各峰面积（那格列奈bs1、M1 bs2、内标bi）。以公式h=（As/Ai）/（bs/bi）计算，得那格列奈回收率为97.6%～99.5%，M1 回收率为96.9%～98.4%。

2.6 稳定性试验 按照“2.3 项”制备低、中、高三个浓度的质控样品，分别考察室温放置12 h、反复冻融3 次、进样瓶4 ℃放置72 h 的样品稳定性。结果表明，样品内的待测物具有良好的稳定性。

2.7 大鼠体内那格列奈药物代谢动力学试验 大鼠（n=6）过夜禁食后，灌胃给予10 mg/kg 那格列奈（混悬于0.25% CMC-Na），分别于2、5、10、15、20、30、45、60、90、120、240 和480 min 自眼底静脉丛取血，肝素抗凝。静置15 min 后，8,000 rpm 离心5 min 得血浆，按照“1.4 项”测定，分别绘制那格列奈和M1 的血药浓度-时间曲线（图4），并利用Phoenix Winnolin8.0软件计算药代动力学参数（表1）。结果显示，那格列奈口服吸收迅速，原形药物与代谢物M1 分别在15 min 与42.5 min 达到峰浓度。血浆药物峰浓度分别为3.25 μg/mL 与1.63 μg/mL。那格列奈与M1的半衰期分别为81.2 min 与98.4 min。

表1 大鼠口服10 mg/kg那格列奈后，那格列奈与M1的药物代谢动力学参数（±s）

表1 大鼠口服10 mg/kg那格列奈后，那格列奈与M1的药物代谢动力学参数（±s）

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图4 大鼠体内那格列奈与代谢物M1的药时曲线

3 讨论

2型糖尿病是常见的内分泌科疾病，在糖尿病中占了90%以上，且是终身性、慢性疾病，至今无根治疗法，需长期坚持治疗，有效控制血糖指标，才不会导致病情加重［5］。近年来随着我国社会老龄化加剧，老年人口不断增多，加上各种不健康生活习惯，导致糖尿病发病率不断升高，严重影响了患者的正常生活、工作，且会严重影响老年人的晚年生存质量［6-7］。故根据老年患者身体特征对其进行胰岛素分泌的调节和血糖水平控制是临床治疗的关键［8-9］。那格列奈是口服降糖药中唯一的苯丙氨酸衍生物，药物口服吸收迅速，其代谢产物几乎无降糖活性，口服给药后6 h 内那格列奈及其代谢产物即完全清除［10］，低血糖发生率低。在老年人中使用无需调整剂量［11］，因此，对于老年2 型糖尿病患者，那格列奈单药或联合治疗是推荐的治疗方案。

那格列奈的测定方法多采用固相萃取后HPLCUV 法［12］，流动相多用磷酸缓冲盐，样品采用固相萃取法处理后进样，这些方法样本处理步骤相对复杂繁琐，成本比较高，柱平衡时间长，每个样本分析时间也较长（均＞10 min），灵敏度低、误差大且无法同时测定其代谢物M1，无法全面揭示那格列奈的体内药代动力学行为。为了获得较高的质谱响应以及较好的峰形和比较短的分析时间，在本实验过程中，利用乙酸乙酯萃取血浆样品，并且以非那西丁作为标准品进行测试。利用岛津C18 色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）分离，流动相为0.1%甲酸溶液与乙腈，梯度洗脱，流速0.2 mL/min，最后获得那格列奈标准曲线线性范围为0.0625～8.0000 μg/mL，M1 为0.0313～4.0000 μg/mL。这种方法既能达到生物样本测定对灵敏度和精确度的要求，而且又简便快速。

本法采用盐酸酸化的液体萃取相比于固相萃取后的HPLC-UV 法，极大地增加了那格列那及M1 的提取回收率，方法稳定、测定快速、灵敏度高、成本低、重现性好且减少仪器损耗。该法适用于血浆、尿液、组织及细胞等各类生物样品测定。