微塑料的测定方法以及对水生生物的生态毒理效应

崔铁峰,张杰,卢灿然,王宏伟,叶晔

(1.河北大学 生命科学学院 生命科学与绿色发展研究院,河北 保定 071002;2.华东师范大学 河口海岸科学研究院,河口海岸国家重点实验室,上海 200241;3.中日友好环境保护中心 科技中心,北京 100029)

塑料制品由于其优良的性能和低廉的价格被大量使用,然而, 废弃塑料制品造成的污染问题也越来越严重.微塑料 (microplastics, MPs)被定义为粒径小于5 mm的塑料颗粒或纤维[1].MPs主要有2种来源:初生MPs和次生MPs.初生MPs来自塑料/树脂颗粒的工业原料、含有MPs颗粒或清洁微珠的工业化产品.次生MPs是塑料进入水体后经过物理、化学和生物过程而发生破裂、分解或体积减小而形成的微小的塑料[2].MPs具有持久性,普遍性和潜在毒性,已被公认为新兴的水体污染物.目前,塑料垃圾已经在各类环境中发现,从沿海到大洋[3],从海洋表层到海沟[4],甚至在极地海冰中都发现了微塑料的存在[5].塑料可能主要源于废物倾倒、道路径流和废水等途径[6],有数据估计,全球海洋中约有2.5×105t塑料[7].水生生物是生态系统的重要组成部分,在大量的生物体内都已检测到了微塑料的存在.研究微塑料对水生生物的影响也成为一个重要问题,已引起越来越多的关注,由于MPs的尺寸微小且与浮游生物和其他悬浮颗粒相似,因此其很容易进入生物体内.研究表明,许多动物可以通过摄食将MPs转移到自身体内[8],纤维状MPs可以粘附于生物体肌肉组织甚至在组织的生长过程中融合进生物体的肌肉组织中[9].在中国,太湖水体中MPs的丰度为(0.01～6.8)×106个/km2[10];研究人员发现每个贻贝(Mytilusedulis)体内的MPs约为7.6个[11].MPs的主要类型是纤维状透明的玻璃纸并且胃和肠中MPs的比例在不同物种中显示出很大的差异,按个体计算为0.5～1.9个[4].比利时研究人员发现德国农场和法国超级市场的海鲜中每个贻贝平均含有约90个MPs颗粒,每只牡蛎含有约50个颗粒[12].

1 MPs的分离方法

为了更好地分析MPs样品,需要将其他杂质从样品中除去或将MPs从样品中分离出来.MPs的分离方法可以分为物理方法和化学方法2种.物理方法包括机械过滤、胶体共沉淀和密度梯度离心等,化学方法包括溶解法、氧化法和消解法等.

1.1 机械过滤

机械过滤是最基础和最常用的MPs分离方法.通常使用微孔膜或纤维滤纸对样品进行过滤,来去除粗大的MPs和其他杂质[13].这种方法已被广泛用于各种水样和沉积物样品中MPs的筛选和分离.机械过滤的优点是简单易行,分离效率高,但需要针对样品进行不同的过滤条件设计,且不能清除所有的杂质[14].

1.2 胶体共沉淀

胶体共沉淀是一种分离微小颗粒物质的方法,其原理是利用受控的电化学条件使MPs表面带有一定电荷,与带有相反电荷的金属离子结合并于底部沉降[15].这种方法可以在水样和海洋沉积物中检测到更低浓度的MPs,但其局限性在于不能形成高纯度的MPs样品,且对一些MPs毛细壁为负离子、表面电荷较弱的样品效果不显著[16].

1.3 密度梯度离心

密度梯度离心是一种物理分离方法,按照不同密度和沉降速率将样品分层,以得到不同密度和杂质含量的MPs样品.它的优点在于可以去除大部分背景噪声和有机杂质,得到高纯度的样品,但是对于MPs粒子的密度分布和密度变化范围的要求比较高[17].

1.4 化学处理

化学处理包括化学溶解、氧化、消解等方法.这些方法利用化学试剂和物理特性,将其他杂质分离出来,提高MPs的纯度.常见的试剂包括硝酸(HNO3)、过氧化氢(H2O2)、硫酸(H2SO4)等,不同种类的MPs有其各自的最适试剂处理浓度和处理温度.在最适条件下,微塑料的回收率可达到90%以上[18].化学处理的优点在于分离效率高且节省时间,但也有一些副作用,如可能导致MPs样品的减少或粘合.

2 MPs的分析方法

MPs从样品中分离后,准确、快速地检测和分析MPs也成为当今环境分析领域的一个重要课题.目前,定量鉴定和表征分析MPs的技术方法主要有直接观察法、光谱法和热分析法等.

2.1 直接观察法

直接观察法是比较传统的方式,通过目视观察或显微镜观察等方法,直接观察样本中的MPs颗粒来确定数量、形态和颜色等特征.直接观察法简单易行,但是这种方法耗时,受人为因素影响较大.直接观察法主要适用于稳定的样品,且只能鉴定一部分MPs颗粒,不适用于较小的颗粒,可能存在漏检或误检的情况.因此,这种方法通常需要结合其他分析方法来进行准确的MPs分析.

2.2 傅里叶红外光谱法(FTIR)

傅里叶红外光谱分析是一种可快速、准确地检测MPs的方法.该方法通过采集样品的红外光谱,根据样品中不同化学键振动带的强度和位置,识别样品中的化合物种类和含量[19].傅里叶红外光谱分析的优点在于无需样品前处理,分析速度快,结果准确可靠,且不会对环境造成二次污染,但是这种方法易受水蒸气和杂质干扰[20].

2.3 拉曼光谱法

拉曼光谱法是一种非破坏性分析技术,已被广泛应用于MPs的鉴定和定量.它基于拉曼散射现象,通过测量样品的散射光谱来确定化学物质的结构和组成.在拉曼光谱分析过程中,样品被照射以激发其分子振动,引起光子散射[21].样品的分子结构和组成会导致特定的散射光谱,这些光谱可用于确定样品中存在MPs,利用拉曼光谱法可以高效准确地鉴定和定量不同类型和尺寸的MPs,包括聚烯烃、聚苯乙烯、聚碳酸酯等材料[22].

2.4 荧光光谱法

荧光光谱法是一种利用分子在激发光照射下吸收光,再通过荧光发射来确定分子结构、浓度和环境的分析技术[23].在MPs的检测中,利用MPs在紫外或蓝色激发光下的荧光特性,在特定的激发光波长下,MPs会发出特定的荧光信号,这种信号可以被荧光光谱仪捕捉并分析,从而实现对MPs的快速检测和定量分析[24].这种方法利用MPs特有的化学成分和物理特性,例如分子质量、形状和表面性质,来区分不同类型的MPs,具有灵敏度高和可靠度高的特点.但需要注意的是,不同类型的MPs可能会产生相似的荧光光谱,因此需要结合其他检测方法来进行分析和确认[24].

2.5 热分析法

热分析法是一种常见的检测MPs的方法,包括差热分析法(differential thermal analysis,DTA)、热重分析法(thermo gravimetric analysis, TGA)等[25].这些技术能够准确地检测MPs样品中的热性质、分解行为以及热稳定性等信息[25].具体而言,差热分析法可以测定样品在升温或降温过程中吸热或放热的能力,可用于检测不同类型、形状和来源的MPs,通过测量不同温度下它们与空气或惰性气体之间的传热模式,可以得到它们的热性质和分解行为.热重分析法是通过测定样品在一定温度下失去的质量(通常用氧气下的失重率)来分析样品中MPs的含量.MPs在高温下分解,产生气体、液体或固体等产物,从而造成质量的减少,通过热重曲线分析可以确定MPs的含量和分解温度等信息[26].

2.6 质谱法

质谱法是目前分析MPs的主要方法之一,可以对MPs进行快速、高灵敏度的检测和定量分析.一般采用的质谱技术包括气质联用质谱(GC-MS)、液相色谱质谱(LC-MS)、电喷雾质谱(ESI-MS)、飞行时间质谱(TOF-MS)等[27-28].其中,GC-MS和LC-MS是应用较为广泛的2种方法.GC-MS法与LC-MS法相比,其检测灵敏度更高,并且具有更好的化学特异性,可以区分不同的塑料类型[29].不过由于GC-MS法只能检测挥发性物质,因此首先需要采用化学预处理方法对样品进行裂解或化学处理,从而得到易于挥发的化合物[29].LC-MS法可以对非挥发性和热稳定的MPs进行测定,无需进行裂解和化学处理.质谱法中唯一能确定和分辨出MPs基质特征的是高效液相二级质谱(LC-MS/MS)法.

MPs的污染对环境和人类健康产生了严重影响,因此需要开发和优化高效、准确、可重复的分离和分析方法.由于MPs的复杂性和多样性,目前还没有一种通用的分离和分析方法,因此选择合适的方法需要考虑MPs的来源、种类、形态、颜色、化学成分等因素.未来,有望在新技术、新方法和新装置的支持下,发展出更加完善和适用的MPs分离和分析方法.

3 MPs对水生生物的生态毒理效应

MPs对生物体的负面影响表现在多个方面.本文从MPs对水生生物的行动限制,对消化系统的破坏,对肠道微生物、基因、脂质与能量代谢、氧化应激等方面的影响来进行介绍并探讨了MPs可能对人类产生的健康风险.

3.1 MPs对水生生物消化系统的影响

大部分的MPs能够被水生动物直接摄取;有些可以通过静电作用吸附于初级生产者[30],使生物体在进食时更容易将其摄入.MPs的摄入会堵塞或磨损水生生物的消化道,降低摄食率,锋利的MPs还会对生物体的肠道组织造成损伤[31].急性暴露和长期暴露于MPs后,水生生物中肠区上皮细胞会发生变形[32].聚乙烯MPs暴露,减缓了罗非鱼(Oreochromisniloticus)体质量的增加[33].这可能是由于摄入过多MPs会引起生物体错误的饱食感,减少其对食物的摄取并影响消化过程,导致能量缺失,生长缓慢[34].

3.2 MPs对水生生物肠道微生物的影响

将斑马鱼(Daniorerio)暴露于聚苯乙烯 MPs 14 d后,在门水平上其肠道微生物群落组成会发生显著变化:对照组变形菌门(Proteobacteria)约占全部微生物组成的80%以上,而在MPs 处理组中下降至约40%;梭杆菌门(Fusobacteria)从对照组的 9%增加到 MPs 处理组的 30%以上;对于厚壁菌门(Firmicutes),其组成在 MPs 处理组中均显著增加;并且在属水平上,一些与鱼类的代谢、疾病和炎症密切相关的微生物群落的组成也发生了变化[35].一项研究通过研磨农用薄膜模拟聚乙烯MPs,评估了这些微塑料暴露30 d后对鲫鱼(Carassiusauratus)肠道微生物组成的影响. 研究结果表明: 厚壁菌门在实验组中的相对丰度显著增加而梭杆菌门和拟杆菌属(Bacteroides)的相对丰度显著减少,并且在暴露于 MPs后,一些有害细菌被发现;Alpha 多样性指数显示鲫鱼肠道微生物多样性在低、中、高 MPs 组中均显著增加[36].聚乙烯纤维暴露使石斑(Epinephelussp.)幼鱼肠道微生物群落的α多样性,Ace和Chao 指数均显著下降,并且香农指数表明群落多样性呈下降趋势[37].

3.3 MPs对水生生物基因的影响

大部分的MPs被摄入后仅在肠道中停留,容易随粪便排出,而粒径较小的MPs一旦进入生物体内会长期滞留,并穿过细胞膜进入到周边组织和循环系统,进而产生细胞及分子层面的毒性效应[38].当MPs的尺寸降至纳米级(1～1 000 nm),其对生物体的入侵能力和毒性可能进一步增强.对贻贝的研究发现,较小的塑料微粒可以从肠道转移且在生物组织中具有更快的生物积累效应[7].50 nm的聚苯乙烯微球暴露臂尾轮虫(Brachionussp.)会造成其DNA损伤、抗氧化酶和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路激活[39].1～50 μm的聚氯乙烯MPs暴露贻贝增强了贻贝与基本生理过程有关的基因表达(细胞周期阻滞、凋亡和氧化还原压力等)[40].80 nm的聚丙乙烯暴露蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)对藻细胞蛋白质合成与代谢以及光合作用通路有显著抑制,还对藻细胞的 DNA造成了损伤并引发了DNA修复机制[41].暴露于聚苯乙烯微粒环境下的大麻鱼,一些基因表达发生了显著变化,这些变化包括与免疫系统和代谢有关的基因[42].当饲料中加入质量分数8%的63 μm的聚乙烯MPs时,在转录组水平上罗非鱼肝脏中柠檬酸循环途径发生了显著性变化[33].聚乙烯MPs暴露使日本青鳉(Oryziaslatipes)雄鱼卵黄蛋白原基因表达量显著下调[43].斑马鱼幼鱼经20 mg/L 聚酰胺MPs(10～45 μm, 300～550、605 nm)暴露时,在前48 h体内的基因表达发生了广泛的改变[44].

3.4 MPs对水生生物氧化应激、脂质和能量代谢的影响

Suman等[32]的研究表明,丰年虾(Artemiasalina)急性(24、48 h)和慢性(14 d)暴露于聚苯乙烯微球(急性暴露于100 mg/L,慢性暴露于1 mg/L,5 μm)后,其体内活性氧(ROS)呈浓度依赖性增加.聚苯乙烯MPs会引起斑马鱼肝脏的炎症和脂质积聚并使抗氧化酶活性明显改变进而诱导氧化应激反应;Romano 等[45]指出,暴露于环境中的原始聚氯乙烯 MPs(0.1～0.5 mg/L,0.1～1 000 μm)还可能对鲫幼体的大脑和肝脏造成氧化损伤.聚苯乙烯MPs也会引起鲫幼体的氧化应激. MPs的摄入还会干扰斑马鱼的脂质和能量代谢[46]. 当用老化的聚酰胺(<32.50 μm)喂食斑马鱼幼鱼时,幼鱼对饲料中脂质的消化功能减弱,导致了脂质的吸收不良和生长抑制[47].

3.5 MPs吸附作用以及与其他物质的联合毒理效应

在海洋环境中MPs往往会与其他污染物共同影响生物体,MPs可以吸附和富集化学物质,从而导致其浓度增加并进一步影响水生生物.同时,MPs还可以作为被附着物,为有害物质提供一个固定的环境,使其更容易对生物产生毒性.MPs与其他物质的联合毒理效应通常比单一毒性更为复杂和难以预测.目前研究发现,MPs与其他环境污染物质如有机污染物、重金属等一起作用,会导致潜在的复合毒理效应.Wu[48]等的研究表明:MPs和多氯联苯(PCBs)对斑马鱼(D.rerio)的联合暴露会导致其卵子的孵化率和幼鱼的生长发育受到严重的损害.聚苯乙烯MPs和磷酸三苯脂(TPP)复合暴露相比单独TPP的暴露会对斑马鱼胚胎的发育产生更强的毒性效应,联合暴露会导致胚胎的致死率和致畸率升高,并抑制孵化率,同时,加入聚苯乙烯MPs还会提高斑马鱼胚胎甲状腺激素浓度和卵黄蛋白原水平[49].谢慧风[50]指出多种重金属暴露(Cr、Cu、Pb、Zn、Cd、Mn、Co、Hg、As、Ni)30 d后红树白骨壤根际细菌丰富度显著降低,而MPs与重金属复合处理(MPs-HMs)可加剧细菌丰富度的退化.Sharma[51]等还发现MPs可以与流感病毒发生协同作用,MPs因吸附病毒使其更容易与细胞结合,导致病毒活性增强.

3.6 MPs对人体健康产生的影响

Da等[52]证明MPs微球和碎片可以沿食物链传递至更高的营养级.海产品是人类重要的食物来源,为人类提供了优质的蛋白质来源.这也使水生生物体内的MPs有机会传递到人类体内.目前,在人类的肺部、胎盘、血栓和粪便中都发现了MPs的存在[53-56].对于人类,接触MPs可能会导致颗粒中毒,免疫系统无法清除的合成颗粒还会导致慢性炎症并增加肿瘤形成的风险[57].聚苯乙烯微片段通过释放化学试剂使免疫细胞的急性炎症增加20倍,导致人体中活性氧的产生以及细胞死亡,并具有浓度依赖效应[58].

4 结论与展望

MPs在被水生生物摄入的过程中会对生物体的消化道造成物理损伤,同时MPs的摄入会增加饱腹感,影响水生生物对食物的消化吸收.MPs的摄入还会使水生生物肠道中的微生物群落组成和多样性发生改变.MPs暴露会引起水生生物基因的改变,还会诱发水生生物的氧化应激反应,并干扰其脂质和能量代谢.MPs对消化吸收的影响及对肠道微生物平衡的破坏可能是生物体脂质和能量代谢相关基因改变的原因之一;MPs对生物体消化道的物理损伤及其在生物体内的积累和扩散可能是引起氧化应激反应和免疫反应的主要原因.综上所述,MPs会对生物体产生一定程度的影响.但是,MPs对生物体的健康风险阈值,以及生物体能否通过自身的调节来完全消除MPs对机体产生的不利影响,还需要进一步的研究.

本文综述了MPs对水生生物的生态毒理效应,说明了MPs对生物体存在潜在的毒性效应.在将来的研究中,应关注真实环境中MPs的特征,了解不同环境中生物体内MPs暴露的真实水平.然而,目前MPs的研究方法还没有统一的标准,不同的研究所得到的结果很难进行比较.此外,纳米塑料可能更容易在生物体内积累和扩散,从而可能具有更强的毒性效应,目前MPs的检测技术对于纳米级别的MPs检测仍然存在技术障碍.所以,以后MPs的研究需要建立标准的MPs分析方法,还需要技术的进步来方便高效地检测纳米塑料.最后,除水生生物外,其他生物体乃至人体内MPs的准确暴露水平,以及对生物体产生的毒理效应也是急需解决的问题.