陶瓷超滤膜在5-羟基-L-色氨酸发酵产物提取中的应用

张怡君,田俊波,杨志彬,郝晋博,胡江林,吕志堂

(1.河北大学 生命科学学院,河北省微生物多样性研究与应用重点实验室,河北 保定 071002 2.河北维达康生物科技有限公司 技术研发中心,河北 保定 072152;3.保定保利瑞合生物科技有限公司 技术研发中心,河北 保定 072152)

5-羟基-L-色氨酸(5-hydroxy-L-tryptophan, 5-HTP)是神经递质5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)的直接生物合成前体,并继而作为褪黑素(melatonin)合成的前体物质,5-HTP及其衍生物已被证明对抑郁症、失眠、慢性头痛和肥胖等多种疾病的治疗有效[1-3],并可以减少癫痫发作引起的呼吸骤停[4],具有调节肠道免疫功能[5]、提高免疫力和细胞抗氧化能力以及预防和治疗癌症等保健功能[6-7].长期以来,5-HTP依赖以非洲加纳籽(Griffoniasimplifolia)为原料通过植物提取法生产[8].近年来,由于生物技术特别是合成生物学的飞速发展,微生物发酵合成5-HTP的技术也取得了极大的进步,并率先由保定保利瑞合生物科技有限公司实现产业化[9-11].该方法具有原料成本低、来源广泛、产品纯度高、反应条件温和等优点,易于工业化生产,已经占居超过70%全球市场份额.但是,微生物发酵液中往往存在着大量的菌体、杂蛋白和胶体颗粒等物质,这些物质的存在使产物收率和结晶质量下降,必须在结晶前将其去除.现有技术工艺是先将发酵液进行絮凝和压滤去除菌体,然后通过离子交换后再进行活性炭脱色,进而通过蒸发、结晶获得产品.在此过程中由于离子交换法使用大量的碱液进行洗脱,致使废水中有大量盐的产生,处理不当易造成严重的环境污染.因此,亟需研究开发出一条从发酵液中提取纯化5-HTP的环保工艺,应用于大规模生产中.

膜分离技术因其无相变、高效率、低能耗和无二次污染等特点,已得到广泛应用,在发酵产物分离提取中既可以用于菌液分离,又可以去除蛋白质,兼具分离、浓缩、精制等作用[12-14].由于5-HTP发酵液中主要含有菌体发酵产生的胞外多糖和蛋白质及培养基中未利用的蛋白质等大分子物质,选择合适的超滤膜可以选择性将其去除而保留小分子的5-HTP.近年来,无机陶瓷超滤膜已经广泛应用于有机酸、氨基酸、醇类和抗生素等发酵产品生产[14-18],与传统过滤分离技术相比,无机陶瓷超滤膜具有化学稳定性佳、耐强酸碱、耐有机溶剂、抗污染性好、机械强度高、孔径分布窄、分离精度高和膜易清洗等特点,正在逐渐取代传统的聚醚砜(polyethersulfone, PES)超滤膜[15-17].本文选择陶瓷超滤膜应用于从发酵液中提取5-HTP的工艺,筛选出孔径最适合的陶瓷超滤膜,对此膜的过滤条件进行了实验,优化出最佳工艺条件,为陶瓷超滤膜应用于5-HTP的工业化生产提供了可靠依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究所用发酵液(保定保利瑞合生物科技有限公司),系大肠杆菌(Escherichiacoli)工程菌GHTP以葡萄糖为原料发酵得到.

错流膜过滤系统(CLMB-6-2S型,绍兴海纳膜技术有限公司),采用 4、10、20 nm ZrO219通道内压管式陶瓷超滤膜(合肥世杰膜工程有限责任公司),管膜外径30 mm,通道内径4 mm,管长1 016 mm,膜面积 0.24 m2;高效液相色谱仪(Agilent LC1200,美国安捷伦公司),可变波长紫外检测器(G1314B/C);超纯水系统 (Milli-Q,美国密理博);电子分析天平(Sartorius BL4100,德国 Sartorius).

5-HTP对照品(Sigma 公司);甲醇(色谱纯);其他试剂均为分析纯.

1.2 实验方法

1.2.1 单因素实验条件

为建立适合发酵液中5-HTP分离提取的陶瓷超滤膜工艺,对4个指标进行单因素实验,分别为陶瓷超滤膜孔径(4、10、20 nm),发酵液预调pH 值(3.0、3.5、4.0),过膜料液温度(25、35、45 ℃), 跨膜压差(0.5、0.75、1.0 MPa).综合考虑放大生产后公司实际产能及发酵提取周期需求,以连续3 h膜通量(permeate flux,F)、5-HTP透过率(permeate ratio,P)和对游离蛋白质截留率(rejection ratio,R) 的平均值为考察指标,确定各因素的最优条件.

各考察指标计算公式为

1)膜通量

F=V/(S·t),

其中:V为陶瓷超滤膜透过液体积(L),t为收集陶瓷超滤膜透过液所需时间(min),S为陶瓷超滤膜膜面积(m2).

2)5-HTP透过率

P=(c1×V1)/(c2×V2)×100%,

其中:c1为超滤膜透过液 5-HTP浓度,V1为超滤膜透过液体积,c2为发酵液5-HTP浓度,V2为发酵液体积.

3)对游离蛋白质截留率

R= (V2×c3-V1×c4)/(V2×c3)×100%,

其中:c3为发酵液中游离的蛋白质含量,c4为超滤膜透过液中游离的蛋白质含量.

1.2.2 检测方法

取经灭活处理后的5-HTP发酵液并调节pH值,通过循环泵进入错流膜过滤系统进行过滤,得到超滤清液;HPLC检测5-HTP和色氨酸的含量(图1).检测条件:色谱柱为Hypersil ODS C18 250 mm×4.6 mm ID,5 μm(Thermo Fisher);检测器为UV检测器;流动相为体积比92∶8的质量分数1.0% (pH 3.00±0.04) 磷酸二氢钾与甲醇混合液;流速为1.0 mL/min;检测波长为275 nm;进样量为10 μL;柱温箱温度为35 ℃;运行时间为20 min.

图1 5-HTP和色氨酸对照品HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatogram of reference substarce 5-HTP and tryptophan

采用Bradford 法[19]以标准牛血清白蛋白(百克赛斯生物科技有限公司)绘制标准曲线测定游离蛋白质含量.

2 结果与分析

2.1 超滤膜最优孔径的优选

根据不同孔径超滤膜与截留分子质量(molecular weight cut-off, MWCO)对应关系[20],要想使分子直径5 nm的蛋白质截留率大于90%,超滤膜最大孔径约为10 nm;另根据蛋白质分子半径(stokes-einstein radius)与分子质量关系r=8.8M1/3nm[21],分子质量10 ku的蛋白质的分子直径约4 nm,而本研究底盘细胞大肠杆菌蛋白质分子质量多数大于10 ku[22].考虑到调节发酵液pH值后蛋白质可能出现的变性聚集等效应,本研究选择4、10、20 nm 3种孔径的陶瓷超滤膜,将发酵液调为pH3.5、进膜压力设为0.75 MPa,进料温度设为35 ℃的条件下进行超滤,考察3种膜的膜通量(F)、5-HTP透过率(P)和对游离蛋白质截留率(R),结果见图2.

a、b、c表示不同处理在0.01水平显著差异A.陶瓷膜孔径对F的影响;B.陶瓷膜孔径对P的影响;C.陶瓷膜孔径对R的影响

从图2可看出,4、10、20 nm孔径滤膜的膜通量分别为65.21、86.28、89.62 L/(m2·h),对5-HTP的透过率分别为62.21%、92.25%和95.69%,超滤膜的孔径对过滤时的膜通量、5-HTP的透过率有极显著影响(P<0.01),孔径大的膜通量和5-HTP透过率也更大,但对游离蛋白质截留率随滤膜孔径增大而显著降低(P<0.01),4、10、20 nm孔径滤膜对游离蛋白的截留率分别为96.51%、90.25%和74.62%.20 nm孔径滤膜对游离蛋白截留率达不到后续5-HTP结晶要求,而4 nm孔径滤膜的膜通量太低,超滤处理周期长、能耗高.综合膜通量、5-HTP透过率和对游离蛋白质截留率3个指标进行考察,故选择超滤膜的孔径为10 nm 更为合适.

2.2 发酵液pH值对膜分离效果的影响

pH会影响到发酵液中5-HTP和蛋白质的溶解性.由于5-HTP在酸性条件下稳定,且在生产中酸性条件下不容易污染杂菌[23],而碱性条件下5-HTP易氧化变质,不利于产品质量控制,故只考察酸性条件下对5-HTP膜分离效果的影响.超滤前分别将发酵液调至pH 3.0、3.5、4.0,在陶瓷超滤膜孔径10 nm、跨膜压差0.75 MPa和过膜料液温度35 ℃的条件下进行超滤,考察膜的膜通量、超滤后 5-HTP透过率和对游离蛋白质截留率,结果见图3.

a、b、c表示不同处理在0.01水平显著差异A.发酵液pH值对F的影响;B.发酵液pH值对P的影响;C.发酵液pH值对R的影响

由图3可看出,发酵液调不同pH值时对膜的通量、5-HTP的透过率和对游离蛋白质截留率影响极大(P<0.01).实验条件下(pH 3.0～4.0),随发酵液预调pH值升高陶瓷膜的通量增大,但对游离蛋白质截留率的影响则随pH升高而降低.孔径10 nm的陶瓷膜对5-HTP的透过率在pH3.5时(92.35%)远远高于pH3.0(63.21%)和pH4.0时(84.12%)(P<0.01),虽然pH3.5时膜通量较pH4.0时低(86.58% vs. 88.79%),对蛋白质截留率也较pH3.0时低(90.36% vs. 90.89%),但2项指标也均达到了一般膜分离时技术指标要求,为尽可能保证5-HTP提取收率,综合膜通量、5-HTP透过率和对游离蛋白质截留率3个指标进行考察,故选择调发酵液的 pH3.5更为合适.

2.3 跨膜压差对膜分离效果的影响

综合考虑本次实验所用陶瓷超滤膜设备和管道连续工作承受最高压力1.0 MPa,为提高膜通量,选择0.5、0.75和1.0 MPa 3种跨膜压差(transmembrane pressure, TMP),在陶瓷超滤膜孔径10 nm、pH3.5和过膜料液温度35 ℃的条件下进行超滤,考察膜的膜通量、5-HTP透过率和对游离蛋白质截留率,结果见图4.

a、b、c表示不同处理在0.01水平显著差异A.跨膜压差对F的影响;B.跨膜压差对P的影响;C.跨膜压差对R的影响

由图4可知,实验条件下跨膜压差对膜通量、5-HTP的透过率和对游离蛋白质截留率影响极大(P<0.01).跨膜压差是超滤膜过滤过程的动力,对膜通量具有重要影响.跨膜压差过小会使发酵液的流速慢,在膜表面容易积累,超滤过程中受到传质控制,导致膜通量下降.跨膜压差过大会使5-HTP(或蛋白质)等溶质被迅速地压实在膜面上,在膜表面形成极化层,超滤过程中也受到传质控制,从而导致膜通量下降.无论使用PES超滤膜还是陶瓷超滤膜,大多数文献中都采用了较低(0.5 MPa以下)的跨膜压差进行超滤分离[14-16],而本研究发现在较高的跨膜压差0.75 MPa时不仅可以极大地提高膜通量(0.75 MPa时86.38 L/(m2·h) vs. 0.5 MPa时65.99 L/(m2·h)),而且可以极大地提高5-HTP的通过率(0.75 MPa时92.15% vs. 0.5 MPa时63.21%),但对可溶蛋白质截留率(90.45%)依然满足工艺要求,因此为使错流膜过滤系统在较高的通量下运行,综合膜通量、5-HTP的透过率和对游离蛋白质截留率 3个指标进行考察,选择发酵液过膜压力0.75 MPa更为合适.

2.4 料液过膜温度对膜分离效果的影响

借鉴传统PES超滤膜的经验[22]及保定保利瑞合生物科技有限公司以往生产经验,选择3种温度(25、35、45 ℃)的发酵液,在陶瓷超滤膜孔径10 nm、跨膜压差0.75 MPa和pH3.5 的条件下进行超滤,考察膜的膜通量、5-HTP透过率和对游离蛋白质截留率,结果见图5.

a、b、c表示不同处理在0.01水平显著差异A.料液过膜温度对F的影响;B.料液过膜温度对P的影响;C.料液过膜温度对R的影响

传统PES超滤膜通量随温度的增加而增加,但当温度达到 35 ℃以后,膜通量增幅变弱[24],因此料液过膜温度选用35 ℃.虽然45 ℃时陶瓷超滤膜通量较35 ℃时要高(88.79 L/(m2·h) vs. 85.98 L/(m2·h),P<0.01),但45 ℃时5-HTP透过率(81.14% vs. 92.38%)及对可溶蛋白质截留率(73.27% vs. 89.25%)下降更为显著.综合膜通量、5-HTP的透过率和对游离蛋白质截留率3个指标进行考察,故选择发酵液过膜温度35 ℃更为合适.

3 讨论与结论

综上所述,本研究建立了适于从发酵液中工业化提取5-HTP的陶瓷膜超滤分离工艺条件,将大肠杆菌工程菌GHTP发酵液酸化调 pH 值3.5,采用10 nm孔径的陶瓷超滤膜,跨膜压差0.75 MPa、料液过膜温度35 ℃条件下5-HTP的透过率在92%以上,对游离蛋白质截留率达 90%以上,完全满足工业化生产要求,且较传统工艺更加节能、环保.