UPLC-MS/MS 法测定苯磺酸氯吡格雷中5 种遗传毒性杂质

乔敏莎，郑秋莹，兰为环，张绿茵，唐海，潘晓男，乔晓娜

（天士力医药集团股份有限公司研究院，天津 300410）

苯磺酸氯吡格雷（Clopidogrel besilate）是第二代二磷酸腺苷受体拮抗药[1]。目前有文献报道了苯磺酸氯吡格雷的有关物质和溶剂残留研究[2-3]，但对于其遗传毒性杂质研究尚未有报道。近年来，法规对于药物遗传毒性杂质控制的要求越来越严格[4-5]。本文根据2020 年版《中国药典》四部通则〈0512〉、〈0431〉以及人用药品注册技术要求国际协调会（ICH）M7 规定[6-7]，并结合苯磺酸氯吡格雷仿制药生产工艺，建立苯磺酸氯吡格雷中5 种苯磺酸酯类遗传毒性杂质（对硝基苯磺酸、对硝基苯磺酰氯、对硝基苯磺酸甲酯、对硝基苯磺酸乙酯和对硝基苯磺酸异丙酯）的UPLC-MS/MS 检测方法，以期为本品基因毒性杂质质量控制提供方法参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器：超高效液相色谱仪，LC 30 AD 型，日本岛津公司；三重四级杆质谱仪，QTrap 5500 型，美国AB Sciex 公司；电子天平，XS105DU 型，瑞士梅特勒-托利多公司。

试剂：乙腈，质谱级，美国默克公司；纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司；标准品：对硝基苯磺酸水合物，纯度83.9%，阿拉丁试剂（上海）有限公司；对硝基苯磺酰氯，纯度98.2%，阿拉丁试剂（上海）有限公司；对硝基苯磺酸甲酯，纯度99.3%，阿拉丁试剂（上海）有限公司；对硝基苯磺酸乙酯，纯度99.5%，自制，批号yz 220813；对硝基苯磺酸异丙酯，纯度99.2%，自制，批号bz 230205；苯磺酸氯吡格雷，自制，批号20210711、20210719、20210720。

1.2 仪器方法

色谱方法：色谱柱为沃特世 ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱（10 cm×2.1 mm，1.8 μm）；柱温箱温度30 ℃；样品室温度4 ℃；进样量2 μL；流动相A 为水，流动相B 为乙腈，程序洗脱为：0～ 0.5 min，20%B；0.5～ 1.5 min，20% B～ 65% B；1.5～ 9 min，65% B；9～ 10 min，65% B～ 20% B；10～ 13 min，20% B；流速0.3 mL/min。

质谱方法：离子源为电喷雾（ESI）源，负离子扫描，多反应监测（MRM）模式，离子化电压（IS）为-4 500 V；雾化温度（TEM）为450 ℃；气帘气（CUR）为35 L/min；雾化器（Gas1）为45 L/ min；辅助加热气为45 L/ min；碰撞气压力（CAD）为medium。监测离子对为m/z 202 →138，去簇电压DP 为-100 V，射入电压EP 为-10 V，碰撞能量CE为-25 V，碰撞室射出电压GXP 为-10 V。

1.3 实验步骤

1.3.1溶液的配制

混合对照品溶液：称取对硝基苯磺酸甲酯、对硝基苯磺酸乙酯、对硝基苯磺酸异丙酯各约15 mg、对硝基苯磺酸水合物约18.9 mg（按对硝基苯磺酸计约为15 mg）置于100 mL 量瓶中，精密称定，并用乙腈定容，得混合对照品溶液一级储备液。精密移取对照品溶液一级储备液1.0 mL 置于200 mL 量瓶中，用乙腈定容，得混合对照品溶液二级储备液。精密移取对照品溶液二级储备液1.0 mL 置100 mL 量瓶中，乙腈定容，即得对照品溶液，浓度约为7.5 ng/mL。

对硝基苯磺酰氯对照品溶液：称取对硝基苯磺酸酰氯约15 mg 置于100 mL 量瓶中，精密称定，并用乙腈定容，得对硝基苯磺酰氯对照品溶液一级储备液。精密移取对硝基苯磺酰氯溶液一级储备液1.0 mL，置于200 mL 量瓶中，用乙腈定容，得对硝基苯磺酰氯溶液二级储备液。精密移取对硝基苯磺酰氯对照品溶液二级储备液1.0 mL 置于100 mL 量瓶中，用乙腈定容，即得对硝基苯磺酰氯对照品溶液，浓度约为7.5 ng/mL。

标准曲线溶液：分别精密移取混合对照品溶液二级储备液0.1、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0 mL 置于100 mL 量瓶中，分别用乙腈定容，即得浓度为0.75、2.25、3.7、7.50、11.25、15.00 ng/mL 的系列标准溶液。

供试品溶液：称取原料药约25 mg，精密称定，置于50 mL 量瓶中，用乙腈定容，即得，浓度为0.5 mg/ mL。

供试品添加混合对照品溶液（加标溶液 ①）：称取原料药约25 mg，精密称定，置于50 mL 量瓶中，用混合对照品溶液定容。

供试品添加对硝基苯磺酰氯对照品溶液（加标溶液②）：称取原料药约25 mg，精密称定，置50 mL 量瓶中，用对硝基苯磺酰氯对照品溶液定容。

空白溶液：乙腈。

1.3.2方法学考察步骤

专属性：取“1.3.1 项”的空白溶液、混合对照品溶液、对硝基苯磺酰氯对照品溶液，分别上机测定，仪器条件如“1.2 项”所示。记录各杂质的保留时间，并考察空白溶剂和供试品溶液是否对各杂质的检测有干扰。

系统适用性：取“1.3.1 项”的混合对照品溶液、对硝基苯磺酰氯对照品溶液，分别上机测定6 次，记录各杂质保留时间和峰面积的RSD 值。

检出限、定量限：取“1.3.1 项”的空白溶液、逐级稀释后的混合对照品溶液、对硝基苯磺酰氯对照品溶液，分别上机测试。信噪比（S/N）大于3 时对应的遗传毒性杂质浓度即为该杂质的检出限，信噪比（S/N）大于10 时对应的遗传毒性杂质浓度即为该杂质的定量限。

线性和范围：取“1.3.2 项”的定量限溶液和“1.3.1项”的标准曲线溶液，分别上机测试。然后分别以各杂质的质量浓度（ng/mL）为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并得到线性方程和线性系数。

重复性：按“1.3.1 项”分别配制6 份加标溶液①和加标溶液 ②，上机测试，采用外标法计算各杂质的浓度，得到测定浓度，然后计算测定浓度RSD 值，即为方法的重复性。

中间精密度：不同实验人员于不同日期配制6份“1.3.1 项”混合对照品溶液、对硝基苯磺酰氯对照品溶液、加标溶液 ①和加标溶液 ②，上机测试，计算各杂质测定浓度的RSD 值及加标回收率的RSD值，即为方法的中间精密度。

准确度：按“1.3.1 项”分别配制3 份加标溶液①和加标溶液 ②，上机测试，按以下公式计算各杂质的加标回收率，即为方法的准确度。

式中C测定值——加标溶液测定浓度；

C原有值——供试品溶液测定浓度；

C加入量——添加的各杂质的浓度。

耐用性：依次改变一项仪器参数（具体见表1），按顺序测定“1.3.1 项”的空白溶液、供试品溶液、混合对照品溶液、对硝基苯磺酰氯对照品溶液、加标溶液 ①、加标溶液 ②，记录峰面积，计算各条件下供试品中杂质含量、和供试品加标溶液的回收率及回收率的RSD 值。

表1 耐用性实验条件改变表Tab.1 Variation of parameters in durability experiments

溶液稳定性：按“1.3.1 项”配制供试品溶液、混合对照品溶液、对硝基苯磺酰氯对照品溶液、加标溶液①、加标溶液②，将上述溶液置于4 ℃样品室中，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h 进样分析，记录各杂质的峰面积，分别计算其RSD 值，RSD 值小于15%则表示溶液稳定。

2 结果与讨论

2.1 方法验证结果

2.1.1专属性

空白溶液、标准溶液及供试品溶液的检测谱图如图1 所示。结果可知，对硝基苯磺酰氯保留时间为0.79 min、对硝基苯磺酸保留时间为0.78 min、对硝基苯磺酸甲酯保留时间为2.99 min、对硝基苯磺酸乙酯保留时间为3.24 min、对硝基苯磺酸异丙酯保留时间为3.52 min，空白溶剂和供试品中不存在干扰目标杂质的成分，说明方法的专属性良好。由于对硝基苯磺酰氯和对硝基苯磺酸保留时间一致，质谱的子离子、母离子和碰撞电压也完全相同，不能对两个杂质进行良好的区分。因此，本实验建立的方法对两个杂质进行合并计算及定量。

图1 专属性溶液总离子流图（TIC 图）Fig.1 Total ion flow chromatogram（TIC）of the proprietary solution

2.1.2系统适应性

系统适应性结果如表2 所示。从表中可以看出，对硝基苯磺酰氯、对硝基苯磺酸、对硝基苯磺酸甲酯、对硝基苯磺酸乙酯、对硝基苯磺酸异丙酯的峰面积RSD 值在0.77%～ 2.00%之间，保留时间的RSD 值在0.73%～ 1.96%之间。5 种杂质的峰面积和保留时间的RSD 值均远小于15%，说明方法的系统适用性良好。

表2 仪器系统适应性实验结果Tab.2 Results of instrumentation system adaptation experiments

2.1.3标准曲线、线性范围及检出限、定量限

各杂质的线性、范围及检出限、定量限如表3所示。结果表明，5 种杂质的标准曲线的线性关系良好，相关系数在0.998 7～ 0.999 8 之间，对硝基苯磺酰氯、对硝基苯磺酸的检出限和定量限分别为0.045 ng/mL 和0.150 ng/mL，对硝基苯磺酸甲酯、对硝基苯磺酸乙酯、对硝基苯磺酸异丙酯的检出限和定量限分别为0.113 ng/mL 和0.375 ng/mL。各杂质的线性系数均大于0.99，且定量限和检出限均低于折算限度（15 ng/mL），因此本方法满足定量分析要 求。

表3 标准曲线、线性范围、检出限及定量限结果Tab.3 The result of standard curves,linear ranges,limit of detection and limit of quantitation

由于对硝基苯磺酰氯和对硝基苯磺酸的色谱保留时间一致，质谱的子离子、母离子和碰撞电压也完全相同，不能对两个杂质进行良好地区分。因此，本方法采用标准曲线法在定量限浓度（两个杂质的定量限浓度相同）到200%限度浓度范围内，以浓度对峰面积进行线性回归，求出各自的曲线斜率，按照曲线斜率之比求出相对响应因子（RRF）。

根据上述公式，按照线性结果中曲线斜率计算杂质对硝基苯磺酰氯对杂质对硝基苯磺酸的相对响应因子是：609 522/649 834=0.94 ＜1。因此，在实际样品测定时，本方法选用对硝基苯磺酰氯做对照品用于计算样品中该保留时间处的杂质含量。

2.1.4重复性

5 种遗传毒性杂质的重复性实验结果如表4 所示。可以看出，所测5 种杂质的RSD 值在0.69%～ 1.85%之间，即在3.0%以内，说明该方法的重复性良好。

表4 方法的重复性实验结果Tab.4 The results of repeatability test of the method

2.1.5准确度

表5 为5 种基因毒性杂质的准确度实验结果。实验表明，各杂质的回收率在82.98%～ 119.92%之间，即在70.0%～ 130.0%范围内，且各杂质加标回收率的RSD 值小于15%，说明方法的准确度良好。

表5 加标回收率实验结果Tab.5 Results of the recovery rate test

2.1.6中间精密度

中间精密度实验结果见表6。结果表明，5 种遗传毒性杂质的加标回收率均在70.0%～ 130.0%之间；5 种遗传毒性杂质测定值的RSD 值及加标回收率的RSD 值均低于3.47%，这说明所建立方法的中间精密度良好，满足分析要求。

表6 中间精密度实验结果Tab.6 Results of intermediate precision test

2.1.7耐用性

5 种遗传毒性杂质各耐用性条件下，测定浓度的RSD 值在0.53%～ 7.35%之间，RSD 值均小于15%，加标回收率在84.11%～ 114.85%之间，即满足药典中要求的70.0%～ 130.0%范围，另外各杂质加标回收率的RSD 值均小于15%。具体实验结果如表7 所示。

表7 耐用性实验结果Tab.7 Results of durability experiments

2.1.8溶液稳定性

实验结果表明，供试品溶液、混合对照品溶液、对硝基苯磺酰氯对照品溶液、加标溶液 ①和加标溶液 ② 5 种溶液在进样室温度4 ℃条件下，24 小时内峰面积RSD%均小于15%。对硝基苯磺酰氯、对硝基苯磺酸、对硝基苯磺酸甲酯、对硝基苯磺酸乙酯、对硝基苯磺酸异丙酯的峰面积RSD 值分别在3.33%～ 6.39%、3.33%～ 7.02%、2.15%～ 4.67%、5.76%～ 6.06%、6.41%～ 6.92%之间，这说明所有实验溶液在4 ℃条件下稳定。

2.2 样品测定

根据ICH M7 中规定的终身服药时，单个杂质可接受摄入量为1.5 μg/天，按照本品每日最大服用计量为50 mg 计算时，各杂质限度值为30 μg/g。按照本实验建立的方法，对三批苯磺酸酯氯吡格雷进行测定，结果如表8 所示。实验结果表明，三批本品的定量结果远远低于法规要求的限度。

表8 样品中各杂质含量Tab.8 Concentrations of the genotoxic impurities in samples

3 结语

本研究利用超高效液相色谱-三重四级杆质谱仪建立了苯磺酸氯吡格雷中5 种遗传毒性杂质的含量测定方法，并进行了全面的方法学验证。实验表明，所建立方法的线性、重复性、加标回收率、中间精密度等均符合分析要求，测定的三批样品中5 种杂质的含量均远小于其限度值。该方法稳定、准确、可靠，可用于苯磺酸氯吡格雷中苯磺酸类遗传毒性杂质的定量分析，也可为药物的质量控制研究提供参考。