HPLC 法测定1-氟萘中工艺杂质和遗传毒性杂质含量

2024-03-15唐莲杨仁明

化工与医药工程 2024年1期

唐莲，杨仁明

（1.成都地奥制药集团有限公司，四川成都 610041；2.四川奥邦古得药业有限公司，四川成都 610097）

1-氟萘作为一种重要的医药中间体和起始物料，可用于度洛西汀[1]和达泊西汀[2]等化合物的合成。1-氟萘工业化生产时，主要通过1-萘胺经重氮化、取代、热风分解和纯化处理等步骤合成制得。合成过程中可能引入和降解产生1-萘胺、2-氟萘和萘，其中1-萘胺作为遗传毒性杂质，需要特别关注其含量。目前已有文献对1-氟萘中的1 种或几种杂质含量进行检测，但均采用酸性流动相体系[3-5]，存在杂质峰型不好或方法灵敏度较低的问题，本文新建灵敏度更高的碱性HPLC 方法对上述3 种杂质进行含量测定，以期为1-氟萘中杂质控制提供参考。

1 仪器

LC-2030C 型高效液相色谱（岛津公司）配备四元梯度泵，在线真空脱气机，DAD 检测器，Phenomenex Gemini C18 柱（250×4.6 mM，5 µm，Phenomenex 公司）；KQ-800KDE 型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；AUW120D 十万分之一天平（日本岛津公司）；UPT-II-10T 型纯水仪（四川优普超纯科技有限公司）

2 试剂

1-氟萘，购自成都科隆化学品有限公司；1-氟萘、1-萘胺、2-氟萘和萘对照品购于阿拉丁；乙腈（色谱纯，美国sigma 公司）；碳酸氢铵和三乙胺皆为分析纯，购于成都科隆化学品有限公司，纯水由优普超纯水系统制备。

3 方法

3.1 溶液配制

空白溶剂：流动相。

系统适用性溶液：取1-氟萘、1-萘胺、2-氟萘和萘对照品适量，用流动相溶解并稀释成每1 mL 中各约含杂质10 μg 的溶液作为系统适用性试验溶液。

供试品溶液：取供试品约10 mg，精密称定，置 10 mL 量瓶中，用稀释液溶解并稀释到刻度，摇匀即得。

1-氟萘定位溶液：取2 mg 1-氟萘对照品，精密称定，置 10 mL 量瓶中，用稀释液溶解并稀释到刻度，摇匀即得。

2-氟萘定位溶液：取2 mg 2-氟萘对照品，精密称定，置 10 mL 量瓶中，用稀释液溶解并稀释到刻度，摇匀即得。

1-萘胺定位溶液：取2 mg 1-萘胺对照品，精密称定，置 10 mL 量瓶中，用稀释液溶解并稀释到刻度，摇匀即得。

萘定位溶液：取2 mg 萘对照品，精密称定，置 10 mL 量瓶中，用稀释液溶解并稀释到刻度，摇匀即得。

自身对照溶液：取供试品溶液适量，定量稀释制成含1-氟萘1 μg/mL 的溶液，摇匀即得。

3.2 色谱条件

色谱柱为Phenomenex Gemini C18 250×4.6 mM，5 µm；流动相为10 mM 碳酸氢钠+6 mM 三乙胺∶乙腈=55∶45，等度洗脱，采集时间为主峰的2 倍保留时间；柱温为40 ℃；检测波长为220 nm；流速为1.0 mL/min；进样量为20 μL。

4 结果

4.1 专属性考察

分别进样空白溶液、对照溶液、样品溶液、各定位溶液和系统适用性溶液进行专属性考察，如图1～ 8 所示。由色谱图可知，空白溶液不干扰主峰和各杂质峰检测，各峰间分离度良好，同时通过紫外图谱分析，主峰和各杂质最大吸收波长均为210 nm，考虑到210 nm 为末端吸收，基线波动较大，最终选择220 nm 作为检测波长。

图1 空白溶液典型图谱Fig.1 Specificity of blank solution

图2 系统适用性溶液典型图谱Fig.2 Specificity of system suitability solution

图3 供试品溶液典型图谱Fig.3 Specificity of sample solution

图4 1-氟萘定位溶液典型图谱Fig.4 Specificity of 1-fluoronaphthalene solution

图5 1-萘胺定位溶液典型图谱Fig.5 Specificity of 1-naphthylamine solution

图6 2-氟萘定位溶液典型图谱Fig.6 Specificity of 2-fluoronaphthalene solution

图7 萘定位溶液典型图谱Fig.7 Specificity of naphthalene solution

图8 对照溶液典型图谱Fig.8 Specificity of self-control solution

4.2 系统适用性

分别进样空白溶液、对照溶液和系统适用性溶液进行系统适用性考察，其中对照溶液连续进样6 针。统计系统适用性中各峰分离度和连续进样6 针对照品溶液主峰峰面积和保留时间的RSD 值。由结果可知，系统适用性中2-氟萘和萘的分离度最小，各间峰分离度均大于2.0，各峰理论板数均大于15 000，对称因子均在0.85～ 0.97 之间；连续进样6 针，主峰峰面积RSD 值为0.13%，保留时间的RSD 值为0.02%。

4.3 检测限（LOD）和定量限（LOQ）

取各定位溶液逐级稀释，当S/N ≥3 时即为检测限，当S/N ≥10 时即为定量限。最后测得1-萘胺LOD 为0.002 μg/mL，LOQ 为0.006 μg/mL；萘LOD为0.002 μg/mL，LOQ 为0.005 μg/mL；2-氟萘LOD为0.002 μg/mL，LOQ 为0.007 μg/mL；1-氟萘LOD为0.003 μg/mL，LOQ 为0.008 μg/mL。表明方法具有很高的灵敏度。

4.4 线性与范围

取系统适用性溶液作为线性储备液，分别取0.1、0.2、0.5、1、1.5 和2 mL 线性储备液，置10 mL 量瓶中，用流动相稀释并定容至刻度，摇匀即得系列线性溶液。微孔滤膜过滤后，照上述色谱条件进样，以峰面积平均值（Y）为纵坐标，浓度（X）为横坐标，按最小二乘法进行线性回归，如表1 所示。结果表明各杂质线性相关系数（R）均大于0.995 0，校正因子均在0.2～ 5.0 之间，可采用加校正因子的自身对照法进行杂质含量计算。

表1 各杂质线性与范围及校正因子结果表Tab.1 Results of each impurity linearity,range and correction factor

4.5 重复性

取同一批号1-氟萘样品（批号：20230101），按专属性项下“供试品溶液”制备方法制备6 份供试品溶液和6 份自身对照溶液，同时进样空白溶液和系统溶液，进行重复性试验。根据样品图谱中各杂质峰面积，采用加校正因子的自身对照法计算1-萘胺、2-氟萘和萘最大未知单杂和总杂含量，6 份样品检出1-萘胺、2-氟萘和萘、最大未知单杂和总杂含量均值分别为0.000 7%、0.006%、0.038%、0.035%和0.081%，RSD 值均小于2.32%。

4.6 中间精密度

照重复性样品制备方式制备各样品，对于不同人员，不同日期和不同仪器进行试验。结果表明，6 份样品检出1-萘胺、2-氟萘和萘最大未知单杂和总杂含量与重复性检出结果相当，12 份样品各杂质RSD 值均小于5.56%。结合重复性数据表明方法精密度良好。

4.7 回收率

取1-萘胺、2-氟萘和萘对照品适量，用流动相溶解并稀释成每1 mL 中各约含杂质10 μg 的溶液作为杂质储备溶液。取10 mg 供试品9 份，精密称定，分别置于不同10 mL 量瓶中，精密加入0.5 mL、1 mL 和1.5 mL 杂质储备溶液，各浓度平行制备3份。如表2～ 4 所示，结果表明各杂质的回收率均在92.84%～ 103.72%之间，各杂质回收率RSD 均值均小于3.12%。表明方法准确度良好。

表2 1-萘胺回收率结果Tab.2 Recovery of 1-naphthylamine

表3 萘回收率结果Tab.3 Recovery of naphthalene

表4 2-氟萘回收率结果Tab.4 Recovery of 2-fluoronaphthalene

4.8 耐用性

改变不同流速、不同柱温、不同批次色谱柱、不同缓冲盐浓度和不同流动相比例来评估色谱条件微小变动时，各杂质检测情况。如表5～ 6 所示，结果表明，不同耐用性条件下，各峰之间分离度均大于1.5，样品检出1-萘胺、2-氟萘和萘最大未知单杂和总杂含量均值分别为0.000 7%、0.006%、0.037%、0.036%和0.085%，RSD 值均小于6.82%。表明方法耐用性良好。

表5 耐用性分离度和相对保留时间结果表Tab.5 Resolution and relative retention time results of robustness

表6 耐用性杂质结果表Tab.6 Impurity results of robustness

4.9 样品测定

采用拟定方法对3 批次样品进行检测，每批样品平行制备两份，统计各杂质检出情况。如表7 所示，结果表明各批样品各已知杂质和最大未知单杂均小于0.10%，总杂均小于0.20%。

表7 三批样品杂质检出结果表（n=3）Tab.7 Results of impurities in three batches（n=3）

5 讨论

5.1 杂质控制限度确定

查询CPDB 数据库，1-萘胺为遗传毒性杂质，其TD50 值为67.3 mg/kg/day[6]，计算PDE=67.3 mg/ kg/day*50 kg/5 000=67.3 μg/day，度洛西汀和达泊西汀的最大日剂量均为60 mg，计算限度为0.11%，收严至0.10%风险最小，2-氟萘和萘因不具有基因杂质警示结构，按照ICH M7 指导原则分类为第5 类杂质，按照一般杂质进行研究，参考ICH Q3A 按照0.10%限度进行研究。因本品为起始物料，若后续合成工艺对杂质有清除作用，也可根据加标清除情况适当放宽限度。

5.2 流动相体系的选择

本品各杂质均含有萘的结构，紫外吸收较强，一般常用的流动相的体系为酸性磷酸盐-乙腈体系[7]或质谱体系，参考文献表明，度洛西汀[8]和达泊西汀[9]有关物质方法大多采用碱性流动相体系对杂质进行控制和研究，为保证起始物料1-氟萘能在度洛西汀和达泊西汀成品有关物质方法中能被有效检出，故选择碱性体系进行方法开发。通过对有机碱的选择，最终选择可以耐受高pH 的Phenomenex Gemini C18对1-氟萘杂质方法进行开发，最终选择10 mM 碳酸氢钠+6 mM 三乙胺∶乙腈=55∶45 作为流动相，主峰和杂质峰峰型较为对称，理论板数较高，各峰分离度良好。

5.3 杂质计算方式的确定

本文建立的碱性RP-HPLC 加校正因子的主成分自身对照法可同时测定2-氟萘、萘和1-萘胺含量，通过统计不同耐用性条件下的各杂质的相对保留时间，表明不同耐用性条件下测得的相对保留时间具有较好的重现性，可以实现各已知杂质的准确定位，无需长期购买杂质对照品；通过标准曲线法计算各杂质斜率后再计算出各杂质的校正因子，在各已知杂质校正因子均在0.2～ 5.0 范围内，通过加校正因子的自身对照法校正进行杂质计算，可在不采用外标法的情况下实现杂质含量的准确测定。其他未知杂质均按照不再乘以校正因子的计算方式进行计算。