基于代谢组学分析生草樱桃果园土壤特异代谢物

赵柏霞，闫建芳，肖 敏，郑 玮，李俞涛，夏国芳，张立恒，潘凤荣

（1.大连市农业科学研究院, 辽宁 大连 116036；2.大连民族大学, 辽宁 大连 116600）

我国传统的果园地面管理是以清耕为主，但是长期清耕会导致果园土壤肥力下降、破坏土壤团粒结构以及降低土壤微生物多样性等一系列问题[1-2]。土壤质量是果树生长的基础，对果树养分的吸收、果树产量以及果实品质都起着至关重要的作用[3]。果园生草是一项现代化果园土壤管理技术，早在19 世纪西方发达国家就开始了果园生草栽培。近些年，果园生草覆盖管理模式已经在全世界范围内得到了广泛的应用[4]。我国果园生草栽培起步较晚，20 世纪60 年代开始有零星报道，80、90 年代才开始推行[5-6]，目前的普及率很低[7-8]。

目前，已经报道的果园生草的研究主要集中在对土壤结构、土壤理化性质、养分改善、果实品质以及土壤微生物等方面的影响。果园生草对土壤的影响主要表现为改良土壤pH，提高土壤养分、含水量，增加土壤酶的活性，调节土壤温度，改变土壤微生物群落等[9-17]。除此之外，果园生草还会对果实产量、外观品质、口感以及风味等产生影响，可以提高果实的商品率[18-20]。李会科等[12]对苹果(Malus pumila)园生草区0－60 cm 土层土壤养分进行了测定，表明生草会提高土壤的有机质含量。潘介春等[7]研究发现套种不同草种可以提高土壤中微生物数量，以及β-葡萄糖苷酶、氨肽酶和磷酸二脂酶活性。张朋朋等[19]以库尔勒香梨(Pyrus sinkiangensis)为试材，研究发现不同生草种植年限对果形、单果质量、果实带皮硬度以及可溶性固形物都有一定程度的提高，相关性分析发现种植生草3 年以上对果实品质改善最佳。

鼠茅草(Vulpia myuros)是一种耐严寒，不耐高温的禾本科越年生草本植物，播种后当年10 月萌发，翌年6 月死亡，被广泛用于北方果园覆盖和果园杂草抑制。有研究表明，鼠茅草可以改善土壤理化性质、抑制杂草、提高果实品质[21-22]。甜樱桃品种选育及栽培技术研究课题组前期研究发现，在甜樱桃(Prunus avium)果园行间种植鼠茅草可以提高土壤有机质、氮磷钾含量，并提高了土壤微生物的多样性和丰富度[23]。

当前，有关生草果园土壤代谢物差异研究报道较少，尚未见深入分析研究。因此，在前期研究基础上，本研究以樱桃果园行间种植鼠茅草和清耕处理为研究对象，测定土壤代谢物方面的差异，并从中筛选出差异代谢物，进而研究其对土壤微生态的影响机理。本研究结果不仅可以揭示鼠茅草覆盖管理对樱桃园的影响，而且可以为樱桃园的科学管理提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地设在大连市农科院樱桃园(121.42° E，38.99° N)，果园土壤为砂壤土。

1.2 试验设计

2018 年9 月开始播种试验，采取果树行间种草，条播种植。樱桃树树龄7 年，株行距为3.0 m ×4.0 m，试验设置行间种植鼠茅草(S)和行间清耕(Q)两个处理，每个处理小区面积为100 m2，每个处理设5 次重复，随机区组设计。清耕处理小区每年锄草4～5 次，除此之外，生草处理和清耕对照的地块管理措施一致，常规田间管理。

1.3 根际土壤样品采集

2021 年9 月，按五点取样法采集样品。采样时首先清除树盘周围的凋落物和表层土后，选择根系分布较密集的5－15 cm 土层，采用抖落法将附着在根系上的土壤轻轻转入50 mL 灭菌离心管内，带回实验室，将每个处理的土样充分混匀、去除根系等杂质后-80 ℃保存备用。

1.4 土壤代谢物的提取

土壤样品中代谢物的提取方法参考文献[24]。

1.5 UHPLC-QTOF-MS 检测

采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UHPLC-QTOF-MS)对样品进行检测。分析仪器和质谱条件均参考文献[24]。

1.6 数据处理

数据经过处理后进行后续分析。采用主成分分析(principal component analysis, PCA)和Spearman相关分析判断组内样品和质量控制样品的重复性。在KEGG、HMDB 和Lipidmaps 数据库中检索鉴定出的化合物的分类和通路信息。根据分组信息，计算并比较差异倍数，采用T检验计算各化合物的差异显著性P值。采用R 语言包ropls 进行OPLS-DA分析，并进行200 次置换检验来验证模型的可靠性。采用多重交叉验证法计算模型的重要度值(VIP)。采用OPLS-DA 模型的差异倍数(FC)与P值、变量投影重要度值(VIP)相结合的方法筛选差异代产物。筛选FC＞ 1、P＜ 0.05 和VIP＞ 1 的代谢物。采用超几何分布检验计算KEGG 途径富集显著性差异代谢物。

2 结果

2.1 土壤样品主成分分析

采用PCA 法对供试的10 个样品进行降维统计分析，生草组(S)和对照组(Q)样本代谢物在第1 主成分发生明显分离，存在明显差异(图1A)；组内样本聚集，各个散点区分成两组，组间差异明显，说明对两组样本的数据处理是可信的，但S 组内S1样品与其他样品有一定的偏离。因此，PCA 结果能够从总体上反映出两组样品之间的代谢物差异。

图1 PCA 得分图(A)、OPLS-DA 得分图(B)和 OPLS-DA 模型的置换检验(C)Figure 1 Principal component analysis (PCA) score plots (A), orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA) score plots (B), and permutation test of OPLS-DA model (C)

相对于PCA，OPLS-DA 分析可以更大限度展示组间差异(图1B)。图中横坐标表示预测主成分，因此横坐标方向可以看出组间的差距，S 组和Q 组样本沿横坐标明显被区分开，组间样本比PCA 图更分散；纵坐标表示正交主成分，通过纵坐标方向可以看出组内的差距，表明了组内样品具有一定的差异。OPLS-DA 模型参数中R2X = 0.736，R2Y = 1.000，Q2Y = 0.947，说明这个模型为一个出色的模型，样本数据真实可靠。

为了进一步检查OPLS-DA 模型的可靠性，进行了置换验证(图1C)，图中横轴表示置换保留度，纵轴表示R2Y 或者Q2 的取值，两条虚线分别表示R2Y 和Q2 的回归线。R2Y 和Q2 均小于原始模型的R2Y 和Q2，即图左边(置换检验)所有点都比横坐标为1 处的点(原模型)的位置低，而且回归线与纵轴的截距小于0，说明该模型有意义，可以用来进行后续分析使用。

2.2 组间土壤差异代谢物的筛选

供试样品中共检测出441 种代谢物，其中405 种为两组共有，S 组样品检测出427 种，Q 组样品检测出419 种。根据京都基因和基因组百科全书(KEGG)，共鉴定出命名的代谢物69 种，其中脂类和类脂分子23 种、有机酸及其衍生物16 种、有机杂环化合物7 种、苯环型化合物7 种、含氮杂环化合物6 种、苯丙烷和多酮4 种、有机氧化合物4 种、含氮杂环化合物1 种、烃类1 种。在这些化合物中，脂类和类脂分子数量最多，占代谢物总数的33.33%，其次是有机酸及其衍生物占代谢物总数的23.19%。

对筛选到的441 个代谢物绘制火山图(图2)。图中每个点代表一个代谢物，散点越大代表VIP 值越大，筛选得到的差异表达代谢物越可靠。为了进一步确定生草处理和对照土壤中代谢物的差异，采用OPLS-DA 方法，以FC ＞ 2 或FC ＜ 0.5，P＜ 0.01，VIP ＞ 1 相结合为筛选标准，对两组样品进行分析。两组土壤样品筛选得到差异代谢物203 种(P＜0.01)，占共有代谢物的50.12%，其中上调2 个，下调201 个。这些差异代谢物主要包括脂肪酸及其衍生物、胺类、萜类、吲哚及衍生物、氨基酸及其衍生物、固醇类及其他物质。

2.3 代谢物通路及分类注释

为了进一步了解生草对樱桃果园土壤中代谢物的效应，探究代谢物变化机制，将筛选出的差异代谢物进行KEGG 通路富集分析，结果显示，共涉及7 个通路，分别为细胞进程、环境信息处理、药物发展、人类疾病、遗传信息处理、新陈代谢、有机体。其中新陈代谢通路所包含的通路最多，主要包含植物次生代谢产物的生物合成、不饱和脂肪酸的生物合成、色氨酸代谢、脂肪酸生物合成、氨基酸的生物合成、芳香族化合物的降解、植物激素的生物合成等。

其中有34 种差异代谢物富集到了20 条代谢通路当中，包括色氨酸代谢、脂肪酸生物合成、芳香族化合物的降解、不饱和脂肪酸的生物合成及精氨酸和脯氨酸代谢等。其中显著富集(P＜ 0.05)到色氨酸代谢、脂肪酸生物合成、芳香族化合物的降解通路之中(图3)。通过表1 可以看出，这3 个代谢通路中共有13 个差异代谢物显著下调(P＜ 0.05)。其中5 种代谢物富集到色氨酸代谢通路中，分别为色氨醇、6-羟基褪黑素、5-甲氧基色胺、吲哚、L-色氨酸，均为吲哚及其衍生物类。4 种代谢物富集到脂肪酸生物合成通路中，分别为辛酸、癸酸、二乙醇胺、棕榈酸。苯乙烯、邻苯二甲酸、1-萘甲醇、2-甲基萘4 种代谢物富集到芳香族化合物的降解通路(表1)。其中，在脂肪酸代谢通路中的棕榈酸是一种饱和高级脂肪酸，比对照下调了87.1%。邻苯二甲酸是一种芳香族化合物，富集到脂肪酸生物合成通路和多环芳烃降解通路中，比对照相比下调了69.3%。

表1 KEGG 通路富集详情表Table 1 KEGG pathway enrichment, indicating the number and types of metabolites

3 讨论与结论

果园生草可以改变土壤的理化性质、微生物种群以及果实品质。Ma 等[25]研究发现，在榛子(Corylus heterophylla)园中，覆盖鼠茅草后显著提高了土壤氮磷钾含量，提高了酶活性，并显著改变了土壤真菌、细菌结构，提高了共生细菌的种类，降低了病原菌种类。Li 等[26]研究发现，在苹果园中间作甘草(Glycyrrhiza uralensis)后提高了土壤微生物种类，并筛选到了54 种代谢物，这些代谢物涉及到多种代谢通路。本研究结果与前期的研究结果基本相一致，即果园行间种植鼠茅草后，对土壤中的生物组成和代谢特征都产生了影响。

究其原因，一方面鼠茅草通过本身根系系统来改变土壤结构，另一方面主要是通过根系分泌物质以及根系本身新陈代谢等方式为土壤微生物和生物的活动提供充分的营养来源，而微生物的变化，加快了底物的高效利用和分解，增加了土壤养分，最终可以促进植物生长和提高果实品质。也就是说行间生草可以通过调节微生物的多样性和稳定性来改善土壤营养循环，达到了促进植物生长的效果。

本研究发现，与清耕对照相比，差异代谢物显著富集到色氨酸代谢、脂肪酸生物合成、芳香族化合物的降解通路之中。富集到这些通路中的代谢物大多数和植物生长没有直接的关系。富集到芳香族化合物降解通路中的差异代谢产物邻苯二甲酸在生草处理中有较大幅度的下调。邻苯二甲酸是玉米(Zea mays)秸秆腐解后产生的一种典型的酚酸类化感物质[27-28]，是多种作物的自毒物质，对各种作物的种子萌发和幼苗生长具有普遍的抑制作用，是作物生长的障碍因子之一。宋慧等[29]研究发现，一定浓度的邻苯二甲酸处理小豆(Vigna angularis)，会抑制小豆根系的生长从而导致小豆产量降低。杨延杰和林多[30]研究发现，邻苯二甲酸不利于黄瓜(Cucumis sativus)种子萌发及幼苗根系生长发育；而对萝卜(Raphanus sativus)种子萌发及幼苗根系生长的化感效应表现为“低促高抑”[31]。苏文桢等[31]研究发现邻苯二甲酸对辣椒(Capsicum annuum)种子活力和胚根生长的影响也是“低促高抑”。此外，邻苯二甲酸同样可以影响燕麦(Avena nuda)根系和幼芽的生长[32]。目前尚未见关于樱桃自毒物质的相关研究报道，根据以上文献，推测一定量的邻苯二甲酸会抑制樱桃砧木根系的生长，进而影响樱桃树体、果实的生长。而关于邻苯二甲酸对樱桃砧木种子萌发和生长的效应需要后续试验进行验证。樱桃果园生草对土壤中代谢物的影响机制是比较复杂的，而这些代谢物影响樱桃根系的效应也是复杂的，差异代谢物的协同、抑制作用也不能被忽视，因此检测一种或者几种差异代谢物对樱桃不同种类砧木生长的影响，对更深入解释果园生草对樱桃根际土壤微环境的影响有着重要的意义。

而樱桃果园内生草处理后降低了土壤中邻苯二甲酸的含量，究其原因可能是，生草植物的根系与土壤接触后，既影响了土壤物理结构，又通过根系分泌物影响了土壤化学性质和生物活动，进而改变了土壤的微环境，降低了邻苯二甲酸的积累。目前，在樱桃种植中也存在着严重的连作障碍，而樱桃的自毒物质研究较少，本研究的结果为樱桃自毒物质的研究亦提供了一个研究方向，生草降低了土壤中邻苯二甲酸的含量，在一定程度也会减轻连作障碍，对樱桃产业的发展也起到了重要的指导作用。

综上，本研究分析了辽宁省大连市樱桃果园行间种植鼠茅草和清耕种植两种地面管理方式土壤中代谢物的差异，并进一步筛选了生草种植后土壤中的特异代谢物。结果发现，与清耕对照相比，樱桃果园生草种植3 年后，土壤中的代谢物发生了明显的变化，生草后土壤代谢物种类有所增加。筛选的差异代谢物主要包括脂类、氨基酸、有机酸、脂肪酸、糖类等。其中13 个差异代谢物显著下调，分别富集到色氨酸代谢、脂肪酸生物合成、芳香族化合物的降解通路中。其中色氨酸代谢中的邻苯二甲酸下调显著，推测与甜樱桃根系自毒物质有关，需要进一步试验验证。本研究的结果为樱桃果园生草种植模式影响果园土壤微生态提供理论依据，并为甜樱桃生产中连作障碍的研究提供一定的参考。