应用促性腺激素释放激素类似物更新母猪定时输精程序

程玲华 ，肖银霞 ，杨 婷 ，2，廉传江 ，2，杜长龙 ，2，滕中辉 ，2（编译）

（1.北京大北农科技集团股份有限公司，北京 100194 ；2.北京华牧兴农种猪科技有限公司，北京 100080 ；3.中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193）

0 引言

在过去60年的养猪实践中已经证实应用生殖激素调控母猪卵泡发育和排卵是可行的。然而，除了用于母猪乏情治疗外，激素在商业农场生产上的应用非常有限，其原因主要是激素成本高、实际应用效果差。

当前，生产上迫切需要使用促性腺激素释放激素（gonadotropinreleasing hormone，GnRH）类似物精准控制母猪排卵时间，一些研究也已证明应用GnRH类似物可以对批次母猪进行定时输精（f ixed-time artif icial insemination，FTAI）。同时，该技术还有利于加快母猪遗传进展，提高生产效率。

对GnRH类似物的认识始于20世纪初，当时人们发现垂体损伤，尤其是腺垂体损伤，可以导致生殖道萎缩，因此确定了下丘脑-垂体-性腺轴的调控系统。1928年Louria和Rosenzweig证实孕妇尿液具有刺激性腺发育的作用，进一步证实了尿液中存在人绒毛膜促性腺激素（Human chorionic gonadotropin ，HCG）。后来，Fevold等人第一次证实存在两种促性腺激素，促卵泡素（follicle-stimulating hormone，FSH）和促黄体素（luteinizing hormone，LH）得以分离纯化。接下来的30年里，研究人员开始使用孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin ，PMSG）、马绒毛膜促性腺激素（equine chorionic gonadotropins ，eCG）和人垂体提取物刺激卵泡发育，这些外源性促性腺激素被用于诱导排卵，尽管抗体的形成和较差的生物安全性限制了它们作为商品化兽药大量使用。

1949年，Tanabe等人首次使用eCG和羊的垂体提取物刺激猪卵泡发育和排卵。随后，其他研究也为生产上使用外源激素诱导猪发情和排卵方案奠定了基础，包括1969年Polge和Day使用美他硫脲抑制卵泡发育，接着使用eCG治疗来刺激卵泡发育，HCG来诱导排卵。

在20世纪60年代，已经可以从各种动物的脑垂体中获得FSH和LH提取物，但由于激素的生物安全性和纯度较差，几乎没有获得药代动力学结果。这些制剂也开始用于诱导母猪排卵。近些年，在生猪生产上使用PMSG来诱导发情，使用具有高LH活性的HCG诱导排卵。PMSG是一种糖蛋白，具有FSH和LH双重活性。常用的方案是母猪断奶后或者烯丙孕素性周期同步处理后注射400 IU 的PMSG和200 IU的HCG，该方案可以诱导母猪发情同步化，但排卵同步效果并不理想。此外，为了诱导母猪更早发情，发情-排卵的时间间隔被延长，这使得预测母猪的排卵时间更加困难。使用eCG和HCG混合制剂，尤其是高剂量eCG制剂（分别为700 IU和350 IU），有产生卵泡囊肿、卵泡黄体化和卵巢囊肿变性的风险。

发情持续时间在不同母猪之间变化很大，因此，很有必要应用外源性促性腺激素同步排卵。1971年，GnRH十肽被分离，这使得研究人员能够识别腺垂体特定区域，以确定其是否与GnRH受体结合及其稳定性。20世纪70年代末，东德首次合成了GnRH类似物戈舍瑞林。此后，GnRH激动剂被用于刺激卵泡发育和诱导后备及经产母猪排卵。GnRH激动剂被认为是一种可能替代促性腺激素的药物，因为它们在垂体水平刺激LH和FSH释放，使得在接近排卵的时间进行定时输精。

多年来，研究人员开发出了不同的GnRH激动剂用于更好地控制卵泡发育、排卵时间和卵母细胞质量，以改善商业农场繁殖方案。为了使不同的GnRH激动剂能用于商业母猪定时输精程序，了解母猪生殖生理知识，尤其是卵泡发育和排卵知识是非常重要的。

1 母猪卵泡发育和排卵生理学

母猪的发情周期包括16～18 d黄体期和3～6 d卵泡期。在黄体期，黄体产生孕酮抑制FSH和LH分泌，进而抑制卵泡发育。黄体期的12～14 d，子宫内膜产生PGF2α导致黄体退化，抑制孕酮分泌。激活下丘脑-垂体-卵巢轴， GnRH恢复并释放促进卵泡生长的LH和FSH，当雌激素（E2）增加时，这些激素联合启动下一个发情周期。

1.1 促性腺释放激素和促性腺激素的分泌调控

虽然并不是所有物种反应都相同，对大多数物种来说，雌二醇（E2）正反馈作用于下丘脑-垂体-性腺轴是启动下一个发情周期的关键。E2作用于下丘脑，释放GnRH并进一步刺激垂体产生促性腺激素（图1）。此外，研究显示E2也可以使 LH 短暂性下降，让垂体储备足够的LH， 随后24～48 h形成排卵前LH峰以启动排卵。在下丘脑-垂体-性腺轴的调节下，以不同频率和幅度脉冲释放GnRH。卵巢通过垂体GnRH受体调节FSH和LH分泌。GnRH脉冲经垂体门静脉到达垂体，诱导FSH和LH释放。

图1 母猪分娩和泌乳后下丘脑-垂体-卵巢轴。（-）表示负反馈

GnRH在血液中半衰期较短，主要通过肾小球滤过作用，在4 min左右被清除。GnRH脉冲频率和振幅影响母猪LH和FSH的释放模式。卵泡期，雌激素水平增加，GnRH脉冲频率增加，幅度降低，FSH和LH释放频率增加。黄体晚期，GnRH以高振幅低频率的模式释放，孕酮水平增加。黄体期结束时，孕酮水平降低，GnRH的频率再次增加，随后母猪发情。GnRH脉冲式释放以调节FSH和LH的合成，这对于下丘脑-垂体-性腺轴正常运行、卵泡正常发育是非常有意义的。

1.2 卵巢促性腺激素受体

母猪从原始卵泡启动发育成有腔卵泡后依赖于FSH水平以维持生长发育。只有15%的卵泡能够继续发育到下一阶段，其他卵泡因为颗粒细胞的凋亡而闭锁。

卵泡约1 mm大小时，它们在卵巢表面肉眼可见。小到中等卵泡主要表达FSH受体，这些受体随着卵泡生长成熟而降低。FSH和LH受体表达水平取决于每个卵泡发育状态。1 mm以下的小卵泡，FSH受体表达较高，LH表达更低。1～6 mm的中等卵泡，促性腺激素可以和FSH和LH受体结合。6～12 mm的大卵泡，LH受体表达水平更高，结合能力更强，此时FSH受体不表达。

1.3 发情期的卵泡发育

后备母猪在60日龄开始对促性腺激素的刺激产生反应，这与卵巢FSH受体表达时间相吻合。然而母猪下丘脑-垂体-性腺轴要到100日龄后才开始发挥作用，并在7月龄左右进入初情期。性成熟后，优势卵泡在FSH的刺激下排卵，之后高浓度孕酮抑制母猪发情。黄体溶解后，孕酮浓度急剧下降，促性腺激素合成的负反馈消失，卵巢上中等大小卵泡在4～6 d内生长到排卵前大小。因此，下丘脑-垂体-卵巢轴的刺激因子（LH和FSH）和抑制因子（P4和抑制素）之间必须保持平衡，以维持生殖功能正常。发情周期长短受内部和外部一系列因素调节。

一旦卵泡达到排卵前大小，FSH浓度下降，LH由高峰低频变为低峰高频。在这个阶段，LH受体表达增加，E2浓度激增触发GnRH介导的排卵前LH峰，卵泡壁血管破裂和结缔组织破坏，并发生排卵。从发情到LH峰的时间为8f11 h，LH峰持续约24 h，发情到排卵时间为30f3 h。

有研究表明，并不是所有卵泡在排卵前都达到相同大小。参与卵泡发育的FSH受体表达受能量平衡状态、应激、繁殖季节等各种外部因素对母猪下丘脑-垂体-卵巢轴的影响，不同卵泡存在个体差异。这些外界因素可能会导致妊娠失败、胚胎存活率下降、卵巢囊肿、小黄体或黄体功能不全。

尽管排卵前卵泡均可以响应LH峰，但排卵并不是同时发生，从第一个卵母细胞到最后一个卵母细胞排卵持续时间为1～3 h。1990年Kemp 和 Soede 以及2011年Tummaruk等人研究表明，发情期后70%～72%发生排卵，与发情持续时间无关。而Almeida等人研究表明，后备母猪排卵甚至发生在发情期后85%。

1.4 母猪泌乳期卵泡发育

母猪分娩后的泌乳期不会发情。尽管此时卵巢上会有20～30个2 mm左右卵泡生长发育，但是这些卵泡在生长到4 mm前就会闭锁。因为在哺乳期，催乳素、催产素和内源性阿片肽等负反馈作用于下丘脑-垂体-卵巢轴，抑制GnRH分泌。

1.5 断奶后卵泡发育

断奶时母猪卵巢上2～5 mm的卵泡可以发育到排卵前卵泡。仔猪断奶后，卵泡生长达到6～7 mm后母猪发情，排卵前可达到8～12 mm（图2）。

图2 泌乳对下丘脑-垂体-性腺轴的影响

在某些情况下，卵泡发育调节因子会被释放，进而影响断奶ü发情间隔和发情ü排卵间隔。这些因子包括应激条件下释放的糖皮质激素、葡萄糖、胰岛素、脂肪酸等营养介质，还有内源性阿片肽类药物和瘦素等。断奶后FSH先上升后下降，而LH会增加脉冲的幅度和频率，启动断奶后的发情。

2 诱导母猪同步排卵

在回顾了母猪卵泡发育动力学后，接下来介绍用于母猪诱导排卵的3个激素产品：HCG、猪源LH和GnRH 激动剂。

烯丙孕素是孕酮类似物，生产上常和促性腺激素和GnRH 激动剂联合使用，以应用于不同状态的后备母猪进行同期发情和定时输精。但是，这种处理也会导致部分母猪卵泡囊肿，尤其是初情期前母猪最为明显。2020年，Ziecik等人研究表明使用烯丙孕素处理初情期前母猪降低了原始卵泡和小卵泡比例，增加了有腔卵泡的数量。但对于性成熟的母猪初级卵泡比例降低，排卵前有腔卵泡和总卵泡的数量增加。研究发现，烯丙孕素负反馈作用于卵泡液中孕激素的浓度，降低初情期前母猪PGE2的浓度和性成熟母猪PGF2α的代谢。烯丙孕素改变了后备母猪壁层颗粒细胞cAMP的代谢。与此同时，烯丙孕素还可以在基因水平上降低初情期前后备母猪卵泡膜细胞CYP17A1表达和性成熟后备母猪颗粒细胞和卵泡膜层中PGF2α合成酶的表达。最近有研究表明，烯丙孕素处理后联合使用促性腺激素对经产母猪妊娠率和胚胎存活率存在不利影响。

2.1 HCG

20世纪70年代，母猪断奶或者停用烯丙孕素后间隔24 h注射PMSG，78～80 h后注射HCG。排卵一般发生在HCG注射后40～42 h。因此，在注射HCG后固定时间（后备母猪14～16 h，经产母猪24～26 h）对母猪定时输精。由于后备母猪和经产母猪的卵泡发育和卵母细胞存活时间存在差异，所以授精时机不同。后备母猪卵母细胞只能存活4 h，而经产母猪的卵母细胞可存活8 h。经产母猪适宜的HCG剂量为600 IU，后备母猪使用900 IU更有利于卵母细胞发育。断奶后80 h注射750 IU HCG， 与以往数据（75.7%）相比，母猪妊娠率提高到92.3%。

2.2 猪源LH

猪源LH是一种用于控制断奶母猪排卵时间的促性腺激素。注射5 mg LH后约38 h排卵。与使用HCG相比（包括eCG预处理在内的方案），母猪分娩率增加15%。这些结果表明，在控制商品母猪排卵的潜力方面，LH要优于HCG。

2.3 GnRH激动剂

GnRH类似物结构的发现和工艺化合成，使其成为促卵泡生长和促排卵药物HCG和eCG的潜在替代品。众多研究表明，促性腺激素释放激素激动剂可用于刺激母猪LH分泌并诱导排卵。

与HCG处理相比，应用GnRH诱导LH释放具有独特的优势。HCG直接作用于卵巢受体，而GnRH刺激垂体释放LH，LH到达卵巢诱导排卵。另外，外源促性腺激素和烯丙孕素联合治疗会导致部分母猪卵泡囊肿。

GnRH激动剂对腺垂体受体的亲和力高于天然GnRH，其结合时间更长，以刺激FSH和LH分泌。延长半衰期后，使得它们比内源性GnRH更有效。激动剂的设计旨在稳定分子结构免于遭受酶促反应攻击，以增加其与血浆蛋白和细胞膜的结合效率，并进一步增加其与GnRH受体的亲和力。生产上，后备母猪经过烯丙孕素处理后（15～20 mg/d，14～18 d）经产母猪同期断奶后联合使用GnRH激动剂，可实现同步排卵，以利于进行定时输精。

考虑到药物分子结构、性质和作用时间的差异，药物应用时间、方式应根据这些分子性质而有所差异。诱导卵泡发育的方案、GnRH类似物的性质、使用时间、剂量和人工输精时间不同，母猪妊娠率和产仔数等也不尽相同。近年来用于猪繁殖的GnRH激动剂包括：戈那瑞林 、来舍瑞林、培弗瑞林。

2.3.1 戈那瑞林（Gonadorelin）

戈那瑞林分子式为C55H75N17O13，是东德最早发现的GnRH激动剂分子。注射eCG后，约36 h后注射50 μg戈那瑞林诱导排卵。与注射HCG相比，可以提高母猪妊娠率。有研究表明戈那瑞林可以诱导后备母猪、泌乳母猪和产后乏情母猪发情和排卵，且可以获得令人满意的妊娠率和产仔数。然而，有研究表明与只添加蛋氨酸相比，断奶前4 d添加蛋氨酸和50 μg戈那瑞林，母猪妊娠率无显著差异。

注射50 μg戈那瑞林后35.5f2.7 h母猪开始排卵，59f1.7 h结束排卵。然而，母猪的反应随GnRH注射时间和LH峰频率变化而变化。1 285头后备母猪注射1 000 IU eCG 后间隔78～80 h注射 50 μg戈那瑞林，并在注射戈那瑞林后24 h和40 h进行两次定时输精，母猪表现出较高的妊娠率。表1汇总了一些研究中使用戈那瑞林后母猪的繁殖性能。

表1 注射eCG后使用戈那瑞林定时输精母猪繁殖性能

2.3.2 来舍瑞林（Licerelin）

来舍瑞林的分子式为C59H84N16O12，是一种通过修饰促性腺激素结构获得的长效合成GnRH激动剂。断奶母猪注射25 μg 来舍瑞林，缩短了断奶ü发情间隔和发情ü排卵间隔时间。研究显示，处理后48 h有93%的母猪排卵，并获得了满意的繁殖表现。

2.3.3 培弗瑞林（Peforelin）

培弗瑞林的分子式为C59H74N18O14，是一种可以刺激内源性FSH分泌的GnRH类似物。注射后培弗瑞林被迅速吸收，半衰期较长。由于具有额外的刺激FSH分泌效果，它多用于促进母猪发情，而不是诱导排卵。

Engl 研究表明多胎母猪注射37.5 μg 培弗瑞林可以获得良好的妊娠结果。然而，后续研究以及培弗瑞林说明书推荐后备和经产母猪的最佳剂量均是150 μg。后备母猪在烯丙孕素治疗48 h 后注射；经产母猪在断奶后24 h 注射。由于用药后增加了卵泡期FSH水平，卵泡直也增加，同时影响了黄体大小和孕酮水平。尽管活产仔数低于对照组（12.8f3.3 vs 13.2f3.6），但培弗瑞林处理组仔猪出生体重高于对照组（1.42f0.38 vs 1.35f0.35），且均匀度增加。

2.3.4 布舍瑞林（Buserelin）

布舍瑞林的分子式为C62H90N16O15，主要成分是布舍瑞林醋酸盐。1982年，Von Kaufmann and Holtz 研究显示eCG后注射10 μg布舍瑞林可以诱导后备母猪排卵。后续研究了对比了在断奶后不同时间（24 h，77 h， 94 h和 104 h）注射以及不同注射剂量（6 μg，10 μg，16 μg， 50 μg）布舍瑞林对母猪繁殖性能的影响。目前，经产母猪推荐在断奶后83～89 h肌内注射10 μg布舍瑞林，30 ～33 h后进行单次授精。母猪多在注射布舍瑞林后42f2 h排卵。

Driancourt等研究表明一胎母猪断奶86f3 h注射布舍瑞林后间隔 35～41 h 排卵。Martinat-Botté等在后备母猪最后一次饲喂烯丙孕素后115～120 h注射 10 μg布舍瑞林，间隔30～33 h后进行两次授精。Suárez-Usbeck等人在后备母猪最后一次饲喂烯丙孕素后间隔120 h注射布舍瑞林，并在处理后30～33 h进行单次子宫颈深部输精获得了不错的繁殖效果。表2是应用布舍瑞林诱导排卵相关研究结果。

表2 使用布舍瑞林诱导排卵母猪繁殖性能

2.3.5 曲普瑞林（Triptorelin）

曲普瑞林分子式为C64H82N18O13，是一种人工合成的GnRH类似物，多经过阴道内给药以刺激垂体分泌LH并诱导排卵。曲普瑞林多用于美国和加拿大的定时输精程序，断奶母猪无论是否有发情迹象均在固定时间单次注射，81%的多胎断奶母猪和92.6%的一胎断奶母猪注射曲普瑞林后48 h后排卵。然而排卵时间并不是稳定不变的，这和猪场管理水平有很大关系。造成这些差异的原因与执行定时输精程序时是否诱情、查情、曲普瑞林注射时间、注射剂量、输精时间都有关系。Wang等人基于2004ü 2018年间进行的15项研究中的37项试验进行了荟萃分析，这些试验研究了后备母猪或经产母猪所有数据（除总出生数和活仔数）使用均值f标准差或者均值f标准误的形式描述。未作为完整报告发表的研究被排除在外，并对会议论文与期刊论文进行了交叉核对。结果显示，断奶后96 h注射曲普瑞林可显著提高分娩率 （P<0 .001）。使用100 μg 曲普瑞林母猪妊娠率和分娩率要优于200 μg，最佳的人工授精时间是给药后间隔24 h进行第一次人工输精，给药后间隔48 h进行第二次人工授精。目前研究显示在当前定时输精程序中使用曲普瑞林可以获得满意的结果，但是其在后备母猪上应进行更多的应用研究。

使用曲普瑞林后母猪繁殖性能和自然发情相似，这是因为在检测到发情时来准确预测母猪排卵时间，以进行定时输精。Knox等试验研究和Wang等荟萃分析结果都表明，和饲喂烯丙孕素的后备母猪相比，经产母猪断奶后96 h注射100 μg 曲普瑞林繁殖性能更加令人满意。

使用曲普瑞林对母猪定时输精的主要目的是无需进行发情检测，然而在这些研究中，人工授精均是在观察到发情后进行的。所有实验研究结论中都提到需要进行更多研究以重复结果并获得更准确的结论。

Wang等人使用荟萃分析对比了后备母猪使用25 μg、100 μg、200 μg曲普瑞林后繁殖性能，发现处理组后备母猪繁殖性能（妊娠率、分娩率、总产仔数）低于未处理组。可能的原因有2个，一是后备母猪经过处理后使用单次定时输精而经产母猪使用了多次；二是在停用烯丙孕素后72 h、84 h、96 h、120 h使用曲普瑞林相对来说偏早，导致停用烯丙孕素后第6天母猪排卵率仅仅是70.9%，而对照组高达92.5%。表3是不同研究中使用曲普瑞林后母猪繁殖指标的情况。

表3 使用曲普瑞林诱导排卵母猪繁殖成绩比较

3 使用GnRH激动剂排卵诱导失败原因分析

母猪排卵前24 h输精可以获得最优的繁殖效果，然而不同母猪断奶－发情间隔、发情持续时间以及发情至排卵间隔时间存在很大差异，这对于确定最佳时间进行人工输精，减少输精次数提出了很大的挑战。母猪发情-排卵时间的变异可能和卵泡发育异质性以及LH峰启动时间有关。卵母细胞维持授精能力的时间是8～12 h，精子维持授精能力的时间是24 h，这些特征是人工授精成功的关键。生产中应使用GnRH类似物诱导母猪发情和排卵同步化，并根据排卵规律及时修改母猪输精程序；同时选择合适时间注射GnRH激动剂亦是保证成功诱导排卵的关键，因为注射外源GnRH后诱导的LH峰必须和内源LH峰的频率和水平高度类似。

研究显示使用GnRH激动剂诱导母猪排卵是十分有效的，尽管有一些作者报道注射GnRH激动剂48 h后仍有16%母猪未排卵。从实用性的角度看，合理的定时输精程序可以提高后备母猪繁殖性能，Suárez-Usbeck等人对226头发情后备母猪注射布舍瑞林后进行单次子宫颈深部输精仅有11%的母猪未分娩。

注射GnRH激动剂后排卵失败的主要原因可能有2个，首先，排卵前LH峰浓度可能没有达到激活排卵所需要的阈值；其次，排卵前LH峰可能未在预期时间出现，在发情后期人工授精导致胚胎丢失。然而，大多数情况下使用GnRH激动剂后排卵失败的原因在于没有在发情前期注射激素。这意味着母猪注射激素时可能处于初情期前，或者是断奶后乏情的母猪，也可能是泌乳期发情未被发现，处理时母猪正处于黄体期卵巢对促排卵相关激素无响应。

4 当前使用GnRH激动剂诱导母猪定时输精的操作程序

为了更加精确进行诱导排卵，必须研究确定GnRH激动剂使用时间、母猪发情时间以及人工授精的时间。在使用定时输精程序之前，必须要彻底的了解群体母猪发情周期。在了解GnRH激动剂诱导母猪排卵规律后，我们就可以建立一个定时输精程序，在最佳时间进行人工授精，获得最好的繁殖效果。

在确定母猪定时输精程序时，以下两种方式可以选择。一是要重视发情检测，以发情时间辅助优化输精程序，不发情的母猪不输精。二是不考虑母猪是否发情，对所有母猪进行定时输精。第二种方案适合于技术人员缺乏的大型农场或者能够承担安静发情、隐性发情或乏情母猪授精后带来的妊娠率降低的农场。

GnRH激动剂处理后要想获得最佳的繁殖表现，还有赖于良好的精液质量、母猪体况管理（体况评分在3左右），以及母猪断奶时无跛足、子宫和乳腺炎症。优势化后的卵泡才能被诱导产生LH峰，并在合适的时间进行人工授精以获得最佳的繁殖表现。诱导排卵和单次人工授精不能解决养殖场存在的健康和管理问题。因此，建议激素处理前先解决猪群现有的健康管理问题，这样才能获得最佳的生产成绩。

后备母猪在性周期同步化处理之前一定要有一次发情周期，并确保按照规定剂量及时准确的把激素饲喂给每一头猪。已有学者成功对后备母猪进行了子宫颈内单次定时输精。但当前还需要针对不同GnRH激动剂分子特征，进一步验证其繁殖表现。

定时输精的主要目的是提高猪场繁殖性能，以下是单次定时输精的优势：（1）要在正确的时间进行人工输精。（2）不同母猪同步输精，出生仔猪均匀度更加一致，可减少死胎数量。（3）增加仔猪初乳摄入量，提高每头母猪断奶仔猪数。（4）用相同公猪的精液对母猪进行人工授精，减少仔猪出生重的变异。（5）单次人工授精节省精液使用剂量和成本，最大化利用优良种公猪，可加快遗传改良。

5 总结

提高猪场繁殖效率是养猪业的重要方向。基于对调控卵泡发育和排卵规律的深入研究，已经成功研发了几种GnRH激动剂。实践表明，应用GnRH激动剂对母猪进行定时输精有效提高了母猪繁殖效率。此外，定时输精还可以在不影响母猪繁殖成绩的基础上，减少输精次数和精液使用剂量，单次定时输精降低了精液用量，使得优秀公猪最大化应用。同时，该技术减少了发情检测时间，简化了农场生殖管理流程。这些技术还可以缩短种公猪完成后裔测定所需要的时间。未来，该技术还可以和冷冻精液等繁殖新技术结合使用。