基于氧化应激和炎症探讨健脾解毒汤治疗银屑病脾虚湿盛证大鼠的作用机制

许孟月 姚文汇 左永杰 刘红霞

1.新疆医科大学第四临床医学院，新疆乌鲁木齐 830000；2.新疆医科大学附属中医医院皮肤科，新疆乌鲁木齐 830000

银屑病是一种免疫介导的慢性炎症性疾病[1]。近年来，研究发现银屑病患者血清中氧化应激相关指标水平异常，可见超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）等抗氧化物的缺乏，丙二醛（malondialdehyde，MDA）等氧化物增多[2]。核转录因子红系2 相关因子2/血红素加氧酶-1（hemeoxygenase-1，HO-1）通路是一条重要抗氧化通路，SOD、GSH 是衡量抗氧化能力的重要指标，MDA 可间接反映自由基引起的氧化损伤程度。同时，氧化应激产生的活性氧也会激活多个炎症通路[3]。新疆地区年降水量少，燥易伤脾胃，饮食以肉食为主，易生湿化热。基于此，新疆医科大学附属中医医院刘红霞教授提出新疆地区银屑病“脾虚湿盛证”证型，经验方健脾解毒汤取得良好的临床疗效，但作用机制尚不明确[4]。咪喹莫特诱导的银屑病动物模型特征与人银屑病特征最为相似[5]。因此，本研究采用咪喹莫特诱导的银屑病脾虚证脾虚湿盛证动物模型，探讨其对银屑病氧化应激和炎症的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康6～8 周龄SPF 级雄性SD 大鼠，体重180～200 g，由新疆医科大学动物饲养中心提供，动物合格证号为[SYXK（新）2018-0001]，本研究经过新疆医科大学实验动物伦理委员会审批（20210822-08）。

1.2 主要药物、试剂、仪器

健脾解毒汤（土茯苓30 g、绵萆薢10 g、黄柏10 g、苦参10 g、连翘30 g、生薏仁30 g、茯苓10 g、炒白术10 g、白花蛇舌草30 g、丹参10 g、炙甘草6 g），大黄颗粒剂（江阴天江药业有限公司，批号：2108042301）2g/袋；5%咪喹莫特乳膏（四川明欣药业有限责任公司，批号：211013）；甲氨蝶呤片（湖南正清制药集团股份有限公司，批号：210905）2.5 mg/片；MDA、GSH、SOD 试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号：EBC-K025-M、E-BC-K030-M、E-BC-K020-M）、IL-22试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，货号：CSBE14918r）、兔HO-1/HMOX1 抗体（武汉博士德生物工程有限公司，货号：BM4010）；电泳仪（北京六一生物科技公司，型号：DYCZ-24DN）、化学发光成像仪系统（上海勤翔科学仪器有限公司，型号：Chemiscope 3000）。

1.3 动物分组及处理

48 只大鼠按照随机数字表法分为空白组、模型组、阳性药物对照组及健脾解毒汤低、中、高剂量组，每组8 只。六组均背部除去被毛（3 cm×3 cm），空白组以凡士林涂抹背部；其余各组予5%咪喹莫特（62.5 mg，2 次/d）涂抹背部，同时予大黄颗粒剂（10 ml/kg，2 次/d）灌胃，连续10 d。造模成功后，阳性药物组予甲氨蝶呤片（0.97 mg/kg，1 次/d），健脾解毒汤各组按照低、中、高剂量（2.32、4.64、9.26 g/kg）灌胃，根据前期研究，高剂量（g/kg）=5.67（9.8/6）=9.2 g/kg，分别计算中、低剂量[6]。空白组、模型组予同体积生理盐水，连续14 d。给药结束后，六组腹主动脉取血，剪取背部皮肤，将血清及皮肤组织置于-80℃冰箱保存备用。

1.4 银屑病面积和严重程度指数（psoriasis area and severity index，PASI）

根据红斑、鳞屑、浸润进行评分，PASI 标准：0 分为无症状，1 分为轻微症状，2 分为中度症状，3 分为重度症状、4 分为极重度症状[7]。

1.5 皮肤组织病理学观察

剪取大鼠背部皮损处皮肤，取4%多聚甲醛固定48 h，脱水包埋，进行常规苏木精-伊红染色，并于光学显微镜下观察。

1.6 血清氧化应激及炎症相关指标

采用酶联免疫吸附试验检测六组血清白细胞介素-22（interleukin-22，IL-22）、MDA、GSH 含量及SOD活力，具体操作步骤均严格遵照试剂盒说明书。

1.7 蛋白印迹法检测皮肤组织中HO-1 蛋白表达

向装有皮肤组织的EP 管中加入裂解液，按BCA蛋白测定试剂盒步骤检测蛋白浓度，跑胶后将目标蛋白转移至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，HO-1（1∶800）一抗4℃摇床过夜，山羊抗鼠二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，曝光显影，Image J 软件分析各目的蛋白相对表达量。

1.8 统计学方法

采用SPSS 26.0 统计学软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，比较采用t 检验；多组计量资料比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 六组形态学特征及PASI 比较

空白组背部皮肤未见明显变化，健脾解毒汤各剂量组红斑、鳞屑、浸润、进食及排便情况优于模型组。健脾解毒汤低、中、高剂量组PASI 低于模型组，健脾解毒汤高剂量组低于健脾解毒汤低、中剂量组（P＜0.05）。见图1。

图1 六组形态学特征及PASI 比较（n=8）

2.2 六组皮肤病理表现

空白组未见明显病变，模型组皮肤结构异常，与模型组比较，健脾解毒汤各剂量组表皮增生、角化不全减轻，表皮突变短，中性粒细胞数量减少，真皮血管扩张减弱，高剂量组表现出更显著的效果。见图2。

2.3 六组血清SOD 活力、MDA、GSH、IL-22 水平比较

模型组SOD 活力、GSH 水平低于空白组，MDA、IL-22 水平高于空白组（P＜0.05）。健脾解毒汤低、中、高剂量组GSH 高于模型组，健脾解毒汤中、高剂量组SOD 活力高于模型组，MDA、IL-22 水平低于模型组（P＜0.05）。健脾解毒汤中、高剂量组SOD 活力、GSH水平高于健脾解毒汤低剂量组，MDA、IL-22 水平低于健脾解毒汤低剂量组（P＜0.05）。健脾解毒汤高剂量组SOD 活力、GSH 水平高于健脾解毒汤中剂量组，MDA 低于健脾解毒汤中剂量组（P＜0.05）。见图3。

图3 六组血清SOD 活力、MDA、GSH、IL-22 水平比较（n=8）

2.4 六组皮肤组织中HO-1 蛋白表达比较

模型组HO-1 蛋白低于空白组，健脾解毒汤高剂量组HO-1 蛋白表达高于模型组及健脾解毒汤低、中剂量组（P＜0.05）。见图4。

图4 六组皮肤组织中HO-1 蛋白表达比较（n=8）

3 讨论

银屑病发生机制尚不明确，可能与遗传、免疫紊乱、环境等因素有关[1]。近年来研究表明，氧化应激在银屑病中发挥着重要作用[7]。HO-1 参与皮肤的损伤修复[8-9]。银屑病患者皮损处HO-1 表达升高，血清MDA、GSH 升高、SOD 降低，处于氧化还原稳态失衡[10-11]。当核转录因子红系2 相关因子2/HO-1 通路表达上调时，活性氧类、促炎性细胞因子等显著减少[12]。IL-22是由辅助性T 细胞17 分泌和产生的细胞因子，可调节炎症反应，引起角质细胞过度增殖，而IL-22、IL-17等炎症因子又可致氧化损伤，形成恶性循环，最终造成角质形成细胞过度增殖、中性粒细胞募集、持续的皮肤炎症[3，13]。

中医历史上各代医家对银屑病病因的认识是不断发展，以血论治银屑病是主要的治疗思路[14-17]。刘红霞教授对新疆地区银屑病的病因病机有独到见解，提出脾虚湿盛证[18]。健脾解毒汤是刘教授治疗新疆银屑病脾虚湿盛证的经验有效方，土茯苓、绵萆薢健脾祛湿解毒，黄柏、苦参清热燥湿，白花蛇舌草、连翘解毒，丹参凉血消痈[19]。现代药理表明，土茯苓的生物活性化合物落新妇苷可诱导核转录因子红系2 相关因子2核易位，减轻银屑病小鼠病理损伤[20]。绵萆薢具有抗感染、免疫调节作用[21-22]。小檗碱是黄柏的主要成分，可提高GSH 水平，降低肿瘤坏死因子-α、MDA 水平[22-23]。丹参具有抗氧化、抗感染作用，可改善咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样炎症[24-27]。

综上，健脾解毒汤可改善银屑病病理形态，降低MDA、IL-22 水平，提高SOD 活力、GSH 含量，增加HO-1 蛋白表达，可能是通过调控HO-1 相关通路发挥抗氧化应激、抗感染的作用，但具体作用机制仍需进一步研究。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。