褪黑素对肉牛同期发情和情期受胎率的影响

2024-03-12杨超群贾鸿儒谭建兵尹思琦吴斯林昝林森杨武才

家畜生态学报 2024年3期

杨超群,贾鸿儒,谭建兵,尹思琦,吴斯林,昝林森,2,杨武才,2*

(1.西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌 712100;2.国家肉牛改良中心,陕西杨凌 712100)

随着肉牛产业集约化和规模化程度的提高,母牛存栏量较少,基础母牛繁殖率低仍是亟待解决的问题[1]。同期发情(Estrus Synchronization)是利用外源激素调整母牛的发情阶段,使群体牛在较为集中的时间段出现发情症状和排卵的技术[2]。在同期发情处理中,常用前列腺素(PG)及其类似物进行黄体溶解,通过解除孕激素对卵泡的抑制,从而恢复卵泡发育成熟。生产中常用两次PG间隔10～12 d处理,防止处理群中有处于新生黄体期的母牛[3]。两次PG法处理成本较低,操作简单,但受母牛个体体况影响较大、发情重复性较差,易出现安静发情症状等[4]。有研究表明,两次PG处理后虽能显著提升发情率,但并不能显著提高情期受胎率[5]。对此,有研究通过维生素ADE和GnRH联合使用来探究提高PGF2α同期发情的效果[6]。在奶牛养殖方面,定时输精的应用较为成熟,通过GnRH和PG对卵泡发育的控制,能保证卵泡发育质量,从而提高母牛情期受胎率[7],基础的定时输精法被称为0-7-9,即第0天注射GnRH,第7天注射PG,第9天注射GnRH,16～18 h后进行人工输精[8]。目前应用定时输精也是解决肉牛繁殖率较低问题的重要手段[9]。在母牛发情调控中,卵泡发育和排卵过程中会生成大量活性氧(ROS),ROS及自由基的存在使卵母细胞质膜受到损伤,进而损害DNA和蛋白质,降低卵泡发育质量,引起卵泡闭锁,造成母牛发情率和情期受胎率下降[10]。

褪黑素(MT)是一种天然的抗氧化剂,主要合成于动物的松果腺,其受体表达在多种组织和细胞中。MT还可清除细胞内有害自由基,提升细胞对氧化应激的抵抗能力[11]。在牛卵母细胞体外培养中,MT可增加抗氧化基因的表达,降低ROS对卵母细胞的损伤,同时调节细胞凋亡途径相关基因的表达,进而增加卵母细胞在体外培养中的生存率[12];通过增加网格蛋白内吞作用促进人类卵母细胞和早期胚胎成熟[13];MT还可促进LH受体表达于人颗粒细胞表面,从而增加卵泡排卵的可能性,通过MAPK途径的激活促进黄体细胞调节孕酮的生成,提升体外培养胚胎的存活率[14]。在动物繁殖生产中,在湖羊冷冻精液稀释液中加入0.25 mg/mL褪黑素后可显著提升解冻后精子的活力,提升人工输精妊娠率[15];卵母细胞体外培养过程中添加10-6mol/L褪黑素能提升卵母细胞抗氧化能力,促进胚胎的发育[16];埋植MT可提高萨达母羊繁殖效率,使其提前进入繁殖期[17];注射MT可降低水牛夏季热应激,提高排卵和受胎比例[18];皮下注射MT可提高自然发情率和定时输精奶牛的受胎率[19]。尽管MT在多种动物上的研究表现了其对繁殖作用的积极性,但是目前其在肉牛繁殖上的研究及生产中的应用报道仍较少。

鉴于此,本研究探究外源MT在肉牛体内代谢情况及其对两次氯前列醇钠处理母牛同期发情率、情期受胎率、血液抗氧化水平和生殖激素的影响,为MT在肉牛的繁殖应用提供理论与技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂及仪器褪黑素购自BIOFOUNT,MT溶解于无水乙醇后用生理盐水稀释至相应浓度;氯前列醇钠注射液(0.2 mg; 2 mL)购自宁波三生;无水乙醇、生理盐水来自国家肉牛改良中心实验室;MDA、SOD、GSH-Px、CAT、LH、E2和FSH ELISA试剂盒购自上海酶联公司,P4和MT ELISA试剂盒购自上海凡科维公司;采血管为EDTA抗凝采血管;细管冻精、输精枪等来自试验牛场。

1.1.2 试验动物选择及饲养 2021年5月-2022年8月,在宁夏海原县富陵村肉牛养殖合作社、西北农林科技大学国家肉牛改良中心良繁场以及西安博赫牧业进行试验。试验肉牛给予TMR日粮,每日饲养两次,给予充足饮水和自由活动。

1.2 方法

1.2.1 皮下注射褪黑素在肉牛体内代谢的情况将12头青年秦川肉牛随机分为4组,每组3头,分对照组(0 mg MT)、0.464 mg褪黑素组、4.64 mg褪黑素组、46.4 mg褪黑素组。对每头牛在第0天早上8:00皮下注射相应剂量褪黑素,对照组注射生理盐水,在8:00、8:30、9:00、10:00、12:00、16:00、22:00,第1、2、3天8:00,共10个时间点对每头牛进行血液采集,新鲜血液3000 r/min,15 min离心吸上清,保存至-20 ℃冰箱。

1.2.2 褪黑素对肉牛同期发情效果的影响将80头青年西门塔尔牛和青年秦川肉牛随机分为四组,每组20头牛,分对照组(0 mg MT)、0.464 mg褪黑素处理组、4.64 mg褪黑素处理组、46.4 mg褪黑素处理组。采用肌注两次氯前列醇钠进行同期发情诱导,第0天进行第1次氯前列醇钠注射,第11天进行第2次注射,每次使用2支;在第2次氯前列醇钠注射与配种的同时对试验组肉牛皮下注射0.464 mg、4.64 mg、46.4 mg剂量的褪黑素,对照组注射生理盐水,药物处理后观察96 h内母牛发情情况,对发情牛进行人工输精,配种后60 d进行妊娠检查。每组选择6头牛在第2次注射氯前列醇钠(即第1次皮下注射褪黑素前)、人工输精(即第2次皮下注射褪黑素前)和输精后第7天使用EDTA抗凝管采集血液,新鲜血液放置冰盒内转移至实验室3000 r/min,15 min离心吸血浆,保存至-20 ℃冰箱备用。

1.3 数据统计与分析

使用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析,组间分析使用t检验和卡方检验,数据由“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 褪黑素在肉牛体内代谢规律

由图1可知,对照组肉牛血液中MT在早上8:00-12:00,浓度从32.63 pg/mL～25.52 pg/mL呈下降趋势;在12:00-22:00,浓度从25.52 pg/mL-36.30 pg/mL呈现上升趋势;皮下注射0.464 mg、4.64 mg和46.4 mg MT后,血液中MT浓度在8:30采血时均已处于较高值,浓度分别为92.58 pg/mL、120.42 pg/mL、155.48 pg/mL。

图1 不同剂量褪黑素在血液中的代谢Fig.1 The line chart of different doses of melation in blood

皮下注射0.464 mg MT后,在8:30、9:00、10:00三个时间点,血液中MT浓度极显著高于注射前(P<0.01),12:00时,血液中MT浓度显著高于注射前(P<0.05);皮下注射4.64 mg MT后,在8:30、9:00、10:00、12:00四个时间点,血液中MT浓度极显著高于注射前(P<0.01),16:00时,血液中MT浓度显著高于注射前(P<0.05);皮下注射46.4 mg MT后,在8:30、9:00、10:00、12:00、16:00、22:00六个时间点,血液中MT浓度极显著高于注射前(P<0.01)。以上结果表明,皮下注射0.464 mg MT后8 h代谢至正常水平,皮下注射4.64 mg和46.4 mg MT后14 h代谢至正常水平。

2.2 褪黑素对肉牛血浆抗氧化水平的影响

由图2可知,皮下注射4.64 mg和46.4 mg MT后,配种时采血(第2次采血)与第2次氯前列醇钠注射时采血(第1次采血)相比,显著提高了血浆GSH-Px的含量(P<0.05),极显著提高了血浆SOD的含量(P<0.01),且显著降低了血浆MDA的含量(P<0.05);皮下注射4.64 mg MT后,极显著提高第2次采血时血浆CAT的含量(P<0.01),表明皮下注射4.64 mg MT和46.4 mg MT均能提升肉牛抗氧化水平。

图2 注射褪黑素后两次采血期间血浆抗氧化水平的变化

2.3 褪黑素对肉牛血浆生殖激素的影响

由图3可知,与对照组相比,皮下注射4.64 mg MT或46.4 mg MT均可显著提高配种时血浆FSH的浓度(P<0.05);注射46.4 mg MT可显著提高血浆LH浓度(P<0.05);注射4.64 mg MT可使肉牛配种时血浆E2和配种后第7天血浆P4值显著高于对照组(P<0.05),表明皮下注射4.64 mg MT和46.4 mg MT有利于肉牛生殖激素的合成和分泌。

图3 注射褪黑素后血浆生殖激素浓度的变化Fig. 3 Changes of plasma reproductive hormone concentration after melatonin injectionA. 促卵泡素;B. 促黄体生成素;C. 孕酮;D. 雌二醇A. FSH; B. LH; C. P4; D. E2

2.4 褪黑素对肉牛同期发情率的影响

由表1可知,对照组、0.464 mg处理组、4.64 mg处理组和46.4 mg处理组分别有14、15、17、19头牛在第2次氯前列醇钠注射后96 h内发情,不同组发情时间段均集中在24～96 h,其中48～72 h发情牛数占比最高,分别为对照组25.00%,0.464 mg处理组40.00%,4.64 mg处理组50.00%和46.4 mg处理组55.00%,说明皮下注射不同剂量MT不会影响肉牛同期发情处理后的发情时间。

表1 不同剂量褪黑素对肉牛同期发情率的影响Table 1 Effect of estrus rate of beef cattle with different doses of melatonin

0.464 mg处理组、4.64 mg处理组发情率分别为75.00%和85.00%,均高于对照组发情率,虽未出现差异变化(P>0.05),而46.4 mg处理组发情率为95.00%,显著高于对照组发情率(P<0.05),说明在第2次氯前列醇钠注射的同时,皮下注射MT有利于肉牛发情率的提升,其中46.4 mg效果最为明显。

2.5 褪黑素对肉牛情期受胎率的影响

不同剂量褪黑素对肉牛情期受胎率的影响见表2。由表2可知,对照组、0.464 mg处理组、4.64 mg处理组和46.4 mg处理组情期受胎率分别为42.85%、53.33%、58.82%和73.68%,46.4 mg处理组情期受胎率比对照组情期受胎率高30.83%,虽未达到显著差异(P>0.05),但也说明褪黑素对肉牛情期受胎率的提升呈积极作用。

表2 不同剂量褪黑素对肉牛情期受胎率的影响Table 2 Effect of conception rate of beef cattle with different doses of melatonin

3 讨论

3.1 外源褪黑素对肉牛体内褪黑素代谢的影响

在哺乳动物体内,视交叉上核在受到视网膜传导的节律信号后调控松果体合成褪黑素,褪黑素可直接进入中枢系统发挥作用或被分泌进入血液循环[20]。血液中褪黑素的含量随着昼夜变化而改变[21]。陈玉林等[22]对不同品种绵羊的研究表明,在日落后或日出前1 h 20 min,绵羊体内褪黑素浓度均已达到夜间最高水平或日间最低水平;Mizuna等[23]研究表明,在不同季节,日本短角牛机体褪黑素浓度变化均符合日落快速升高、日出快速下降的规律。本研究显示,褪黑素在8:00-12:00呈下降趋势,在12:00-22:00呈上升趋势,表明外源褪黑素在肉牛血浆中的变化符合生理代谢规律,与先前研究结论符合。本试验采用皮下注射的手段给予肉牛不同剂量的褪黑素,结果表明在注射后半个小时血浆褪黑素浓度均处于较高值,随后呈下降趋势,其中注射46.4 mg褪黑素可在血液中持续14 h的高浓度,这与杨明辉等[24]在奶牛上的研究结果一致。在生理水平,人体口服褪黑素后受首过效应影响血浆中褪黑素在7～8 h代谢至正常水平[25];对荷斯坦奶牛连续4 d皮下注射4.64 mg褪黑素后可以使其在8 d内血浆褪黑素浓度高于正常水平[26]。本试验中,褪黑素分别在注射后8或14 h代谢至正常水平,血液中褪黑素在这期间可进入外周组织发挥功能或被肝脏等器官分解,从而达到褪黑素在生理循环中的稳定值[27]。因此,在生产中可通过皮下注射的方式补充褪黑素,从而提高动物循环血液中褪黑素的含量。

3.2 褪黑素对肉牛同期发情效果的影响

外源褪黑素通过血液循环作用于卵巢,以直接结合的方式清除细胞内自由基,同时上调抗氧化基因表达,刺激抗氧化酶,如谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶的合成与分泌[28],进而降低ROS对卵泡发育的损伤,同时通过增强线粒体功能、促进性激素分泌、调节抗凋亡基因表达等方式促进卵泡发育和胚胎的生长[29],最终影响肉牛的发情率和情期受胎率。Ramadan等[30]使用CIDR联合褪黑素对非繁殖季节水牛进行处理,发情率为100%,显著高于单独使用CIDR得到的发情率(38%);Cemil等[31]对奶山羊使用同期发情联合褪黑素,处理组同期率也显著高于未使用褪黑素的组别;吴昊等[32]研究表明,褪黑素可以显著提高自然发情奶牛的受胎率,还可显著提高奶牛同期发情-定时输精的妊娠率和产犊率。本试验在氯前列醇钠同期发情处理中联合使用0.464 mg、4.64 mg和46.4 mg的褪黑素,结果表明不同剂量褪黑素处理发情率百分比均高于对照组,皮下注射46.4 mg的褪黑素对发情影响最大,能显著提高发情率,可能与处理后能长时间维持机体褪黑素高浓度有关。而46.4 mg褪黑素处理后,肉牛情期受胎率(73.68%)高于对照组(30.83%),但未出现显著变化,可能是因为处理牛数量太少造成的。

3.3 褪黑素对肉牛抗氧化水平和生殖激素的影响

本试验对血浆丙二醛和抗氧化酶的测定表明,4.64 mg褪黑素和46.4 mg褪黑素可以显著降低血浆中MDA的含量,同时提高CAT、GSH-Px和SOD的含量,提升肉牛机体抗氧化水平,从而利于发情率和情期受胎率的提高,这与高翔[33]在肉牛Ovsynch处理的同时进行褪黑素注射的结果一致,其研究同时表明抗氧化水平显著改变的组其受胎率也显著增加。Megahed等[34]研究表明,抗氧化水平的改善使机体减少氧化应激的损伤,从而提升炎热时期水牛的发情率、发情强度和受胎率。Maria等[35]研究表明,补充抗氧化剂后可提升细胞抗氧化能力,从而确保体外培养卵母细胞及胚胎的发育质量和环境耐受性。褪黑素除促进抗氧化水平提升,还能影响生殖激素的分泌,提高卵泡和胚胎质量[36]。在本试验中,褪黑素对配种时血液中的雌二醇(E2)、促卵泡素(FSH)、促黄体生成素(LH)以及配种后第7天血浆孕酮(P4)浓度有提升作用,皮下注射褪黑素有利于以上4种生殖激素合成分泌,其中4.64 mg褪黑素能显著提高FSH、E2和P4的含量,而46.4 mg褪黑素仅能显著提高血浆中FSH和LH的含量,E2和P4的变化并未出现差异,可能是由于同期发情处理后不同母牛体内生殖激素水平不一致造成的。奶牛定时输精研究中,皮下注射30 mg褪黑素显著提升了血浆FSH、E2和P4的含量,生殖激素分泌的增多显著提高了奶牛的发情率和受胎率[32]。Zhang等[37]研究表明,褪黑素在黄体细胞中增加了GnRH和LH的分泌以及LH对孕酮分泌的诱导,从而提高了母猪妊娠率。Yang等[38]研究表明,褪黑素能促进小鼠垂体中FSH的合成,进而增加雌激素的水平,加速小鼠进入青春期,对提高小鼠生殖能力有潜在作用。雌二醇的补充可以增加以孕酮栓为基础的奶牛定时输精过程中大卵泡的比例和排卵比例,从而提高无热应激期奶牛发情率和受胎率[39]。