MDCK 细胞无血清悬浮培养技术在流感疫苗研究与生产中的应用进展

靳莉武 张震宇 靳冬武 马花 马玉梅 乔自林 王家敏

（1.西北民族大学生物医学研究中心 细胞基质疫苗关键技术与产业化教育部工程研究中心，兰州 730030；2.兰州百灵生物技术有限公司，兰州 730010；3.西北民族大学生命科学与工程学院，兰州 730030；4.西北民族大学 生物医学研究中心 生物工程与技术国家民委重点实验室，兰州 730030；5.西北民族大学 生物医学研究中心 甘肃省动物细胞技术创新中心，兰州 730030）

流感，全称为流行性感冒，是一种由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，它通过空气飞沫传播，具有易变性和强传染性，大多数人易感染。流感的发病率通常较高，历史上已多次爆发全球性流行［1］。流感疫苗的接种被认为是一种重要的公共卫生措施，能够显著降低流感疾病对社会和经济的影响，它是预防流感、减少流感相关重症和死亡的有效手段，可以减少疫情的传播和流行范围，从而降低社会的疾病负担和医疗资源的压力［2］。

自1945 年以来，基于鸡胚培养的传统流感疫苗一直发挥着重要的作用，该技术成熟，生产规模较大，是目前价格最为便宜的流感疫苗［3-4］。但是由于其疫苗工艺难以实现全面自动化（图1），且易受禽流感及其他家禽疾病爆发的风险影响而导致鸡胚供应不足，限制了疫苗的产量，存在极大的问题［5］；另外有研究结果表明，用于疫苗生产的鸡胚适应流感病毒株本身与世界卫生组织推荐的原型株在抗原位点B［H156Q，G186V］和D［S219Y］上有3 个氨基酸突变，这些突变也可能导致疫苗的抗原性、免疫原性和效力发生显著改变。这一发现对流行病学和疫苗设计具有重要意义，提醒人们在疫苗生产过程中需要更加关注病毒株的适应性突变，以提高疫苗的效果［6］。1995 年，WHO 建议使用哺乳动物细胞培养代替鸡胚培养来生产流感疫苗，如MDCK 细胞、Vero 细胞［7-8］、PER.C6 细胞［9］、EB66 细胞［10］等。其中MDCK 细胞的受体与人类细胞表面的受体更相似，与流感病毒的结合更为紧密。因此，人流感病毒在MDCK 细胞中不需要适应细胞受体的变化，从而减少了突变的可能性，这也意味着在MDCK 细胞中培养的病毒更接近于原始病毒株，从而提高了疫苗的有效性［11］；而且相比其他细胞系，MDCK 细胞具有较好的细胞生长特性和易于操作的优势，能够产生更高的病毒滴度，是经证实适用于生产流感病毒的细胞之一［12-13］。MDCK 细胞主要以贴壁形式培养，但这种方式存在细胞损伤、细胞密度低和病毒产量不稳定等问题（图2）。无血清悬浮培养技术的出现解决了这些问题，使得MDCK 细胞能够在悬浮状态下进行大规模培养并提高病毒产量。

图1 鸡胚流感疫苗工艺流程图Fig.1 Process flow chart of chicken embryo influenza vaccine

图2 细胞流感疫苗工艺流程图Fig.2 Process flow diagram of cellular influenza vaccine

因此，建立能够满足流感病毒疫苗的大规模生产的MDCK 全悬浮细胞系，成为制备安全、有效、质量可控的流感疫苗的关键。

1 MDCK 细胞

MDCK 细胞英文全称为Madin-Darby Canine Kidney Cells，为犬肾细胞，呈上皮样，贴壁培养型连续传代细胞。1958 年，由来自美国加州大学伯克利分校海军研究实验室的SH Madin 和NB Darby 建立，取材于健康Cocker Spaniel 犬的肾脏，原代培养时呈成纤维样，经过不断的传代纯化，上皮样细胞逐渐成优势群体［14］。1964 年，在培养至49 代时提交给美国典型培养物保藏中心（ATCC），并被编号为Certified Cell Line 34（CCL-34）［15］。Gaush、Leighton 等对MDCK 细胞进行了生长特性、免疫学及细胞遗传学特性等一系列研究，表明该细胞形态一般较为规则，细胞较大，呈扁平状，梭形或多边形，其中央有扁圆形的细胞核，在平板上培养时会合成紧密连接蛋白形成单细胞层，具有接触抑制的特性［16-18］。

研究表明，MDCK 细胞系在多种病毒的增殖和纯化中得到了广泛的应用，包括呼肠孤病毒（reovirus）、犬细小病毒（adenovirus）、腺病毒（canine parvovirus，CPV）、猫粒细胞缺少症病毒（feline panleukopenia virus，FPLV）及禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）等［19-21］，尤其是对于流感病毒感染表现出高效的感染性和快速的增殖能力［22］，被公认为是最适于甲、乙型流感病毒疫苗生产的3种细胞系之一［23］。20 世纪90 年代中期被世界卫生组织（World Health Organization，WHO）推荐为第一批用于替代鸡胚生产季节性流感疫苗的传代细胞系之一［24］。

MDCK 细胞在传统的培养方法中存在多个问题，包括生长速度缓慢、高度分化、易感染性低和稳定性差等，此外它需要附着在培养基中的载体表面上生长，容易受到基质表面积的限制，难以实现大规模生产［25］。另外，贴壁培养MDCK 细胞需要添加动物血清来提供细胞贴壁、增殖和维持生长所需的生物因子和营养成分。然而，动物血清存在潜在的生物安全风险，可能携带外源微生物和病原体因子，同时也增加了工艺成本［26］。鉴于上述问题，寻找新的培养方法以改善MDCK 细胞的生长和稳定性，并替代动物血清，是解决现有问题的重要方向（图2）。这将为更有效、安全和经济的大规模生产流感疫苗提供可能性。

2 MDCK 细胞悬浮培养驯化技术

在实际生产中，悬浮培养不受生长表面基质和面积的限制，无需贴壁和消化，易于扩大细胞培养规模，降低了成本，可利用生物反应器大规模、高效率生产生物制品，具有生产效率高、操作简单、质量与生物安全易控制等优点［12,27］。

在悬浮驯化过程中，研究人员采用先进的细胞生物学手段，通过逐步降低细胞对基质附着的依赖性，逐渐让MDCK 细胞在悬浮状态下生长和繁殖。这有助于减少细胞的机械损伤和减少细胞间的接触，降低死亡率，并提高细胞的生理活性和生命周期。通过优化培养基的组成，可以提供充足的营养物质、生长因子和适当的环境条件，以促进MDCK细胞的生长和代谢活动。此外，在悬浮驯化和筛选过程中，研究人员还需要仔细评估细胞株的稳定性、遗传特性和表达产物的一致性。只有经过详细的筛选和验证，才能选择最合适的细胞株用于进一步的研究和生产应用。2002 年，Novartis 公司采用 ATCC的MDCK CCL-34 细胞株进行驯化筛选，经过数月得到了第一株悬浮细胞MDCK 33016-PF，可在无血清无蛋白条件下悬浮生长［12］。另外，目前已驯化为全悬浮培养的MDCK 细胞株还有MDCK-SFM2、siat7eexpressing MDCK［28］、MDCKSUS2［29］等。

目前，针对MDCK 悬浮细胞的驯化方法主要包括以下几种途径：（1）在将MDCK 细胞转化为悬浮细胞之前，首先使其适应于某种已知成分的无血清培养基中进行培养。这个过程可以通过直接法和间接法来实现。直接法是完全替换培养基的方法。具体而言，直接法驯化MDCK 细胞的方法是将传统的血清含量较高的培养基逐渐转变为无血清培养基。这一过程可以分步进行，逐渐减少血清的配比，同时增加无血清培养基的配比（图3）。通过这种方法，可以逐渐使MDCK 细胞适应无血清条件下的培养。间接法驯化MDCK 细胞的方法是在驯化过程中，引入特定的生物因子和小分子化合物，以促进细胞适应无血清培养条件。这些生物因子和化合物可以模拟血清中存在的生长因子和细胞信号通路，并帮助MDCK 细胞适应无血清环境。这些驯化方法的目的是降低或消除MDCK 细胞对血清的依赖性，并使其适应无血清培养条件。通过这种方式，可以满足生物安全性要求，减少外源致病因子的潜在风险，并降低生产成本。总之，MDCK 悬浮细胞的驯化方法主要包括直接法和间接法，在无血清培养条件下培养，以逐步减少对血清的依赖性，为进一步的研究和生产提供更适用的细胞株。

图3 MDCK 细胞直接法驯化流程Fig.3 Process of direct domestication of MDCK cells

（2）基因改造。有文献表明，人类的Siat7e 全长基因的表达与细胞的贴壁依赖性相关，Siat7e 基因编码人的唾液酸转移酶ST6GalNAc V，该蛋白质负责从GM1b（单唾液酸神经节苷脂）合成GD1α（二唾液酸甘苷），相对于贴壁依赖性HeLa 细胞，非贴壁依赖性的HeLa 细胞表现出了较高水平的Siat7e 基因表达，而当使用SiRNA 技术抑制Siat7e 基因的表达后，观察到这些细胞的贴壁性能得到了明显的增强［30］。这意味着Siat7e 基因在细胞贴壁过程中可能存在一定的抑制作用。这一发现进一步揭示了Siat7e在细胞黏附和贴壁性能中的重要作用，并为深入研究细胞黏附机制提供了新的线索。Chu 等［28］通过基因工程方法改变MDCK 细胞的贴壁依赖性，构建了稳定表达Siat7e 的MDCK 细胞系，使其能够悬浮培养；他们将人类的Siat7e 全长基因的真核表达质粒转化大肠杆菌DH5α，经QIAprep Spin Miniprep kit（Qiagen）纯化提取转染用质粒ST6GalNac V，使用转染试剂 Lipofectamine2000 Regent 转染MDCK 细胞，表达Siat7e 的MDCK 细胞系改变为非贴壁依赖性。并且在后续用B/ Victoria/ 504/ 2000 型流感病毒感染改良细胞后的生产实验中结果表明，细胞源性病毒与鸡胚源性病毒具有相似的抗原性，其核苷酸序列完全相同。从表达Siat7e 的细胞中产生的血球凝集素（以每106个细胞的血球凝集单位表达）比亲代MDCK 细胞产生的血球凝集素的特异性产量高约20 倍。

3 无血清培养基的研发与应用

培养基是细胞培养的关键因素之一，它是细胞体外生长的环境基础。据培养基成分的差异，可将其分为有血清培养基和无血清培养基［31］。

传统的细胞培养通常使用含有动物血清的培养基，通过血清向细胞提供贴壁因子、生长因子、激素和营养物质等。然而，血清作为添加剂存在以下缺点：首先，其成分复杂且不确定，批次之间存在差异，这增加了疫苗等细胞产品的生产和质量控制难度；其次，血清容易引起细菌、真菌、内外源性病毒以及支原体等微生物的污染风险，增加了疫苗生产的安全问题；第三，血清本身价格较高且供应量有限，同时也增加了生物制品的下游纯化难度。因此，开发无血清培养基势在必行，旨在解决上述问题。

无血清培养基的发展历史可以追溯到20 世纪50 年代。起初，使用传统的培养基来维持细胞生长和增殖是常见的做法，但血清成分的不确定性和批次之间的差异使科学家们开始寻求替代方案。在20世纪60 年代，人们意识到细胞可以在人工合成的培养基中存活，并开始尝试去除血清成分。然而，初期的无血清培养基并非完全成功，因为细胞的生长和分化受到了限制。随着时间的推移，科学家们不断改进培养基的配方和优化条件。他们试验不同的组分和添加物，以提供细胞所需的营养和生长因子。此外，细胞外基质蛋白和细胞因子的添加也起到了重要的作用，帮助细胞附着和生长。在20 世纪80年代和90 年代，随着细胞生物学和生物技术的进步，无血清培养基的开发取得了重大突破。科学家们发现，通过应用特定的生长因子和信号通路激活剂，能够实现细胞的无血清培养和增殖。随着分子生物学和基因工程技术的快速发展，无血清培养基的配方也不断更新和改进。1979 年，Taub 等［32］在基础培养基中添加了胰岛素、前列腺素、氢化可的松、转铁蛋白和三碘甲状腺激素作为血清替代品，使MDCK 细胞在其中生长一个月，生长速度与细胞在添加血清培养基中生长的速度相当。

现在，人们已经成功地开发了许多特定于不同细胞类型和应用的无血清培养基。无血清培养基的发展历程是通过不断的实验和探索，研究人员逐渐揭示了细胞生长和增殖的复杂机制，并找到了能够代替血清的替代品［33］。这不仅改变了细胞培养的方式，也推动了细胞生物学和生物医学研究的进步。随着技术的不断演进，无血清培养基的发展仍在继续，并为许多生命科学领域的研究提供了更好的工具和平台。在2003 年召开的“改进体外培养方法,减少胎牛血清使用”的会议中，专注于改善体外培养方法并减少对胎牛血清的依赖。与会者一致呼吁全球减少血清的使用，并积极推动无血清培养细胞技术的发展。这一会议的召开为无血清培养细胞技术的逐渐兴起提供了契机［34］。现已有许多公司已逐步研发出了适用于MDCK 悬浮细胞培养的无血清培养基，例如Ultra-MDCK 培养基、MDSS2N 培养基、Invitrogen 公司的EpiSerf 培养基及Sigma-Aldrich 公司的 MDCK-LP、MDCK-LPM 培养基等［19,35-37］。

4 MDCK 细胞悬浮驯化技术的应用

近年来，MDCK 细胞悬浮驯化技术在细胞生物学和生物医学领域引起了广泛的关注和研究。通过驯化MDCK 细胞，可以实现大规模生产、快速复制和高效表达特定蛋白质等目标。这为病毒研究、药物开发、基因工程等方面提供了重要工具和平台。

4.1 流感疫苗制备

MDCK 细胞悬浮驯化技术可应用于流感疫苗的制备。传统的流感疫苗制备通常使用鸡胚进行病毒繁殖和疫苗生产，但病毒利用鸡胚进行繁殖存在繁杂的操作、变异和污染等问题。而MDCK 悬浮细胞基质生产工艺可以避免这些问题，具有生产效率高、病毒感染效率高、适应多种流感病毒株、稳定性高、安全性高等优势，可替代传统病毒培养方法，提高疫苗的生产效率。

目前以MDCK 细胞为基质生产并已获准上市的疫苗如表1 所示。其中，Novartis 公司使用悬浮细胞MDCK 33016-PF 生产，商名为Optaflu®/Flucelvax®。临床数据显示，与传统的鸡胚流感疫苗相比，Optaflu®/Flucelvax®在免疫原性、安全性和有效性等方面表现出更好的性能。这一疫苗的上市为流感疫苗的生产提供了一种更先进和可靠的方法［12］。韩国SK Chemicals 公司生产的SKYCellflu 三价和四价亚单位疫苗由MDCK-Sky3851 细胞生产，在韩国获得6 个月及以上的许可，在马来西亚和泰国获得3 年及以上的许可［38］。

表1 国际上已获批上市的MDCK 细胞基质流感疫苗Table1 Internationally approved MDCK cells matrix influenza vaccine

此外，其他研究者也对于MDCK 悬浮细胞培养流感病毒做了相关的研究。2009 年，黄锭［43］成功开发了适合MDCK 单细胞悬浮培养的无血清培养基MDCK-SLP、MDCK-SHP，通过使用硅化方瓶-摇床体系与调整培养基配方相结合的方法，成功驯化得到适合单细胞悬浮培养的ssf-MDCK 细胞，并对MDCK 无血清悬浮培养体系生产流感病毒的过程条件进行了初步优化，在优化条件下比较含血清培养基与无血清培养基的产毒情况；实验结果表明，无血清培养基MDCK-SLP 和MDCK-SHP 中病毒的产量均高于含血清培养基中的病毒产量，二者的最大病毒TCID50滴度值为10（9.37±0.83）TCID50/mL、10（2.85±0.81）TCID50/mL。

在2013 年，张良艳等［44］进行了一项研究，采用直接法和间接法对MDCK 细胞进行驯化，使其适应于已知成分的无血清培养液SFM4MEGAvir，再通过细胞旋动培养器Cellspin 进行悬浮培养，成功地获得了MDCKS 悬浮培养细胞。该细胞在营养充足的条件下生长良好，并可以进行大规模培养，满足流感病毒培养的需求。在接种H5N1 疫苗株VN 株后，MDCKS 细胞能够产生较高滴度的流感病毒。2021 年，Bissinger 等［45］用MDCK 悬浮细胞以单细胞悬浮方式生长，接种H1N1 流感病毒，测定各个时期的细胞活力及代谢产物，及接毒后的TCID50滴度。结果表明，TCID50滴度在接毒后18-27 h 内能够达到最大值（2.7±0.5）×109TCID50/mL。赵彩红等［46］通过直接适应的驯化方式获得了一株悬浮细胞命名为MDCK-XF03，并且实现了从5 L 生物反应器到75 L生物反应器的扩大培养。2022 年，李乐凯等［47］在经无血清悬浮驯化得到的MDCK 细胞上分别接种4 种型别流感病毒，结果表明，H1N1 的血凝滴度7 log2（HAU/25 μL），HA 含量达到20 μg/mL；H3N2的血凝滴度达11 log2（HAU/25 μL），HA 含量达到40 μg/mL；BV 的血凝滴度达9 log2（HAU/25 μL），HA含量达30 μg/mL；BY 的血凝滴度达9 log2（HAU/25 μL），HA 含量达40 μg/mL；4 种型别的流感病毒培养效果均可达到预期。另外中国生物上海生物制品研究所的四价流感病毒裂解疫苗（MDCK 细胞）于2023 年1 月获得了国家药品监督管理局签发的《药物临床试验批准通知书》［48］。该疫苗是国内首个基于无血清全悬浮细胞培养技术的流感疫苗，获得了进入临床试验的批准。这意味着它可以进一步进行临床试验，并为未来的流感防控提供新的和潜在的可行选择。

4.2 细胞工程和基因表达

MDCK 细胞悬浮驯化技术在基因工程领域也得到了广泛的应用。通过基因编辑和转染技术，可以在MDCK 细胞中引入特定基因或删除目标基因，从而实现对特定蛋白质的过表达或沉默，提供了一种灵活和可控的工具，用于研究细胞信号通路、蛋白质功能以及疾病模型的建立［49-50］。举例来说，通过转染MDCK 细胞的特定基因，可以构建与疾病相关的细胞模型，用于研究疾病的发病机制和新药的筛选。通过引入与特定疾病相关的突变基因或表达特定蛋白质，可以模拟疾病的发生过程并研究其相关的生物学效应。这为疾病研究领域提供了一种可控的实验平台，有助于更好地理解疾病的发生机制以及寻找新的治疗方法。同时，MDCK 细胞悬浮培养的优势使得基因工程研究更具可行性。相比于传统的MDCK 细胞贴壁培养方式，悬浮细胞培养能够提供更大的细胞产量和更方便的操作。这对于大规模表达目标蛋白质或进行高通量筛选实验十分重要。通过MDCK 细胞的悬浮驯化技术，科学家们可以更好地利用该细胞系统进行基因工程实验，加速药物研发和疾病机制研究的进程。MDCK 细胞悬浮驯化技术在基因工程领域的应用为研究人员提供了一种灵活、可控的工具，用于探究细胞信号通路、蛋白质功能以及疾病模型的建立。

5 MDCK 悬浮细胞在疫苗生产中的安全性研究

MDCK 悬浮细胞在疫苗生产中的安全性研究已经被广泛关注，研究人员对MDCK 悬浮细胞进行了多方面的安全性研究。一方面，通过培养MDCK 细胞的稳定性和一致性来评估其安全性。这包括细胞的遗传稳定性、生长特性和表型特点的监测等。另一方面，研究人员对使用MDCK 悬浮细胞生产的疫苗进行了安全性评估。他们通过对疫苗制剂的物质成分、病毒含量和活性进行检测，以保证疫苗的纯度和有效性。此外，还会通过动物实验和临床试验来评估疫苗的免疫原性和安全性［51］。

5.1 成瘤性与致瘤性

用MDCK 细胞作为疫苗生产中病毒复制的基质具有许多显著的优势，但有实验表明，该细胞在免疫缺陷小鼠皮下或肌肉接种后可诱导肿瘤发生［52］。出于对安全性的慎重考虑，制约了其在国内用于人用疫苗的生产。有效评估MDCK 细胞的致癌能力，避免细胞的致癌基因可能会对人类的健康构成潜在威胁，确保该细胞系安全用于流感疫苗生产是目前研究的重点［39,53］。近年来，科学家们对于MDCK细胞的成瘤机制进行了深入研究发现，了一些与细胞增殖、转移和侵袭相关的信号通路和因子，如MDCK 细胞中的Ras/MAPK 和PI3K/Akt 信号通路被认为在肿瘤的发生和发展中发挥着重要作用［39］。这两个信号通路的异常激活可能导致细胞凋亡抑制、细胞增殖增加以及侵袭和转移能力的提高。因此，研究人员对于这些信号通路的调节和干预具有极大的兴趣，希望通过抑制这些通路的活性来抑制肿瘤的生长和进展。深入了解这些信号通路的作用机制将有助于我们更好地理解肿瘤发生发展的分子基础。另外，研究发现，MDCK 细胞在体内具有一定的转移能力，可以通过侵入周围组织和血管来形成转移瘤。研究人员正在探索MDCK 细胞转移的调控机制，以及与转移相关的因子和信号通路［54-55］。这些研究可以帮助我们更好地理解肿瘤的转移过程，并为转移性肿瘤的治疗提供新的思路。通过比较不同类型的MDCK 细胞株和不同分化状态下的MDCK 细胞发现，了一些与肿瘤相关的分子特征。如表观遗传修饰、肿瘤抑制基因和肿瘤相关基因的表达水平可能与其成瘤性和致瘤性有关［52,56-57］。利用MDCK 细胞构建的肿瘤模型也被广泛应用于抗肿瘤药物筛选和治疗研究中。这些模型可以评估候选药物的抗肿瘤活性，并帮助研究人员更好地了解肿瘤细胞的药物敏感性和耐药机制。

5.2 宿主细胞的遗传稳定性

MDCK 悬浮细胞的遗传稳定性是评估其在疫苗生产中安全性的关键因素之一。研究表明，MDCK细胞在长期培养过程中能够维持相对稳定的染色体结构和基因表达模式。通过使用分子生物学技术和细胞遗传学方法，可以检测细胞中的染色体改变和突变频率，以评估MDCK 细胞在疫苗生产中的遗传稳定性。此外，通过利用新的高通量测序技术以及基因组学和转录组学分析方法，可对MDCK 细胞的基因组进行全面的解析［58-59］。这些研究揭示了MDCK 细胞中存在的染色体易位、突变和拷贝数变异等染色体改变，并确定了其中一些对细胞生长和稳定性具有重要影响的关键基因。此外，通过结合CRISPR/Cas9 基因编辑技术，还成功地对MDCK 细胞中的关键基因进行了精确的编辑和改造，以进一步提高其遗传稳定性［60］。

5.3 疫苗产品的安全性评估

MDCK 悬浮细胞疫苗产品的安全性是在多个方面进行评估的，以确保其在疫苗接种中的安全性［61］。这包括对疫苗产品中的杂质、残留物和可能的毒性成分以及重复给药、生殖毒性、免疫原性和保护作用等方面进行分析和检测［62］。研究人员通过对疫苗产品的成分、结构和功能进行详细的分析，以确保疫苗在临床应用中的安全性。此外，还需要进行动物实验和临床试验，评估疫苗在动物和人体中的免疫原性和安全性［63-65］。

通过这些安全性评估，可以有效地确保MDCK悬浮细胞生产的疫苗在应用中的安全性和可靠性，为疫苗的研发和生产提供重要的保证。然而，仍需要进一步的研究和监管标准的制定，以应对不断出现的新病毒和疫苗需求的挑战。

6 总结与展望

综上所述，流感疫苗对公共健康具有重要影响。随着现代生物技术的发展，生产安全高效的疫苗以更快的速度和更低的成本成为迫切需求。利用细胞培养技术进行疫苗生产已成为生物制药行业发展的必然趋势。

传统的MDCK 细胞培养方式多采用含血清的贴壁培养方法，但血清的成分复杂，成本高且存在批次差异大、污染风险高和下游纯化困难等问题，使生产难以实现标准化。此外，贴壁细胞培养受到基质表面积限制，消化工艺复杂且生产时间长，难以实现大规模细胞培养和流感疫苗的生产。相比之下，MDCK 悬浮细胞培养突破了细胞生长受到表面积限制的制约。悬浮细胞能够在反应器中快速生长，培养环境更为均一，细胞密度更高，这有利于大规模病毒繁殖，提高病毒产量。结合无血清培养基，在反应器中实现规模化培养，便于检测和控制细胞生长的参数，并降低企业生产成本，方便下游纯化，满足疫苗大规模生产的需求。

然而，由于MDCK 细胞在免疫缺陷小鼠中可能引发肿瘤发生的潜在风险，限制了其在国内用于人类疫苗生产。因此，评估MDCK 悬浮细胞的安全性成为当前研究的焦点。通过深入研究MDCK 细胞的致癌机制、转移调控机制和与肿瘤相关的分子特征，以全面评估其安全性，并探索新方法以降低潜在的肿瘤风险。因此，MDCK 细胞悬浮驯化及无血清悬浮培养技术的研究具有广阔的应用前景，但必须在保证安全性的前提下进行进一步研究和探索，以确保其在疫苗生产中的可靠性和可行性。