蓝莓花色苷生理活性、提取纯化及稳态化研究进展

李梓旋，郭佳婧，苏东林，单 杨

（1 湖南大学生物学院隆平分院 长沙410125 2 湖南省农业科学院农产品加工研究所 果蔬贮藏加工与质量安全湖南省重点实验室 长沙 410125）

蓝莓（Vaccinium uliginosum L.）是杜鹃花科越桔属植物，为多年生落叶或常绿灌木，果皮蓝色，果肉近白色，呈圆形，口感细腻，甜度适中，籽小皮薄[1]。蓝莓富含膳食纤维、类黄酮、多酚、维生素等多种活性物质，是“浆果之王”，被联合国粮农组织列为人类五大健康食品之一[2]。

花青素是植物界中含量最多的可溶于水的色素之一，是类黄酮化合物中的一个亚类[3-4]，普遍存在于蓝莓、紫薯、葡萄和黑米等果蔬中，主要有矢车菊色素、天竺葵色素、芍药色素、飞燕草色素、牵牛花色素、锦葵色素6 类。花青素结构中含有多个羟基，性质极不稳定，在自然界中主要是通过糖苷键与葡萄糖苷、鼠李糖苷、半乳糖苷、阿拉伯糖苷等形成花色苷。花色苷具有抗氧化、抗炎、抗癌、降血脂、保护视力等多种功能活性[5]，由于其水溶性强，容易受到水分子的亲核攻击引起褪色，且难以通过被动运输进入细胞中发挥作用，同时加工过程中的pH 值、温度、光照、金属离子、氧化还原剂和糖等也会影响其稳定性。本文综述了蓝莓花色苷的功能活性、提取纯化方法和稳态化技术研究进展，以期为蓝莓花色苷的高效利用和应用提供参考。

1 花色苷的简介

1.1 花色苷的结构特性

花青素具有C6-C3-C6 碳骨架结构，其母核为2-苯基苯并吡喃[4]，化学性质活泼，通常以糖苷化的花色苷存在，根据苷元和糖苷配体的不同可形成多种花色苷，其结构如图1 所示。

图1 花色苷的基本结构Fig. 1 Basic structure of anthocyanins

1.2 花色苷的理化特性

花色苷可溶于水、乙醇、甲醇等溶剂，在水溶液中以黄盐阳离子、醌型碱、假碱、查耳酮形式存在，这几种形式随水溶液的pH 值变化而发生可逆改变，同时，溶液的颜色也随结构改变而改变，在酸性条件下呈红色，在中性条件下呈无色，在碱性条件下呈蓝色[6]。花色苷具有2 种不同的吸收波段，分别是465～560 nm 的可见光区和270～280 nm 的紫外光区。

1.3 花色苷的功能活性

1.3.1 抗肿瘤 花色苷离体细胞试验显示其具有抗肿瘤活性[7]，主要是通过调控多个基因的表达和激活，其中涉及到了磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶（PI3K/AKT）、细胞外信号调节激酶（ERK）、应激活化蛋白激酶（JNK）与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路中的基因。花青素对胃肠道癌症的预防主要是由于其具有抗氧化、抗炎和抗增殖特性，以及其调节基因表达和代谢途径以及诱导癌细胞凋亡的能力。Xue 等[8]的研究表明，蓝莓提取物能够提高HepG2 细胞的活性氧（ROS）含量，并诱导细胞凋亡，从而将HepG2 细胞阻滞在S期。

1.3.2 保护心血管 花色苷在血管内皮中可通过双链转运酶进行转运，激活内皮一氧化氮合酶信号减少氧化应激[9]，可作为血管舒张剂[10]。低密度脂蛋白（LDL）的氧化会导致巨噬细胞白细胞在动脉壁的积累，斑块破裂将氧化胆固醇沉积到动脉壁上引起动脉粥样硬化，花色苷能增加血清抗氧化能力从而防止LDL 氧化和预防心血管疾病。

1.3.3 神经保护 脑组织由于需氧量大，且抗氧化防御能力较低，因此对ROS 和活性氮（RNS）特别敏感[11]，花色苷由于具有一个或几个羟基的芳香环的化学结构，因此使其能够接受来自ROS 或RNS 的未配对电子，穿过血脑屏障进入脑组织清除自由基，降低患神经退行性疾病和认知能力下降的风险。

1.3.4 减轻氧化应激反应 低浓度活性氧对人体免疫系统、细胞信号传导和其它正常身体功能很重要，而ROS 过量则会引起细胞损伤，导致炎症、心血管疾病、癌症和衰老等退行性疾病[12]。线粒体是细胞内ROS 的主要来源，通过呼吸链渗漏电子，ROS 在线粒体中的积累会导致线粒体膜的去极化，在心肌细胞等高能量消耗细胞中，线粒体活性受损会干扰葡萄糖和脂肪酸代谢引起心肌疾病，而花色苷及其代谢物原儿茶酸可以降低线粒体ROS 浓度减轻损伤[13]。

1.3.5 预防肥胖和糖尿病 肥胖是能量摄入和消耗不平衡引起的脂肪组织积累过多，通常与各种代谢紊乱有关，也增加了患2 型糖尿病、心血管疾病、糖尿病、脂肪肝、痴呆和骨关节炎等疾病的风险。花色苷可改善脂肪细胞功能，缓解代谢综合征和肥胖。尤丽等[14]研究发现，蓝莓花色苷能提高2型糖尿病模型小鼠糖代谢水平，促进胰岛素分泌，减少胰岛抵抗，显著降低总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白LDL 的含量，升高高密度脂蛋白（HDL）胆固醇的含量，且为剂量-效应关系。

1.3.6 调节肠道菌群 肠道菌群的变化被认为是多种疾病的原因[15-20]，如胃肠道疾病（炎症性肠病）、神经系统疾病（精神分裂症和帕金森病）、代谢综合征、心血管疾病和糖尿病等。花色苷经过小肠代谢吸收后，不能被降解的部分（酰基化的花色苷）会进入结肠作为益生元调节菌群，如促进乳杆菌和双歧杆菌等的定植[21]。Huang 等[22]研究表明灌胃11 周矢车菊素-3-葡萄糖苷【7.2 mg/（kg·d）】和花色苷提取物【8.0 mg/（kg·d）】可以调节高脂肪高糖饮食引起的小鼠肠道菌群变化，增加了门拟杆菌门细菌的丰度，降低了厚壁菌门细菌的丰度。

1.3.7 改善视力 随着手机和电脑等电子产品的普及，越来越多的人因为用眼过度导致眼酸、眼胀，诱发多种眼部疾病。蓝莓花色苷可有效保护眼部微血管、改善血液循环，加速视紫质再生。杨丹等[23]研究表明蓝莓花色苷可通过调控PI3K/AKT信号通路蛋白，使糖尿病视网膜病变大鼠的视网膜视野灰度值、黄斑水肿厚度下降，减轻视网膜氧化应激损伤和炎症反应。

1.3.8 其它功效活性 蓝莓花色苷还具有抗衰老[24]、抗疲劳[25]、抗抑郁[26]、提高认知功能[27]等作用。王紫玉等[25]利用含蓝莓花色苷的谷物（LH）发酵物灌胃小鼠，结果表明，LH 干预组的小鼠负重游泳时间显著增加，且体内乳酸的积累量显著降低，肝糖原储备量显著增高。罗丽平等[26]用乙醇提取蓝莓花色苷并灌胃抑郁小鼠，可显著提升抑郁小鼠的糖水偏好，显著缩短小鼠悬尾时间。Boespflug等[27]研究表明，连续16 周在日常饮食中加入蓝莓补充剂，受试者在工作记忆负荷的情况下表现出大脑活动明显增强。

2 蓝莓花色苷的提取与纯化

2.1 蓝莓花色苷的提取方法

蓝莓花色苷的提取方法主要包括溶剂萃取法、酶法提取、微波辅助提取法、超声辅助提取法、超临界流体萃取法、超高压辅助提取法、亚临界水提取法等，详见表1。其中，溶剂提取是基于相似相溶的原理，利用甲醇、乙醇、丙酮等有机试剂进行提取，因操作简单而被广泛使用，还可辅助酶法和超声等技术加速细胞结构破坏，促进花色苷释放，以缩短提取时间和提高提取效率。

表1 蓝莓花色苷的提取方法Table 1 Extraction methods of blueberry anthocyanins

2.2 蓝莓花色苷的纯化方法

经过初提之后的花色苷粗提物通常还有有机试剂和糖类、蛋白质、脂肪等大分子杂质的残留，因此需进一步纯化。花色苷纯化的方法主要有大孔树脂纯化、制备型高效液相色谱、离子交换树脂层析、膜分离法，详见表2。其中大孔树脂法因具有价廉、操作简单、纯化效果好等优点而被广泛使用，同时，也可将多种纯化方法联合使用，逐级分离，获得高纯度花色苷样品。

表2 蓝莓花色苷的纯化方法Table 2 Purification methods of blueberry anthocyanins

3 蓝莓花色苷的稳态化研究

3.1 花色苷微胶囊化技术

花色苷的活性作用主要取决于其在机体内的生物利用度，由于体内酸碱性环境和酶等的作用，其生物利用度较低。花色苷首先经口摄入，虽然口腔pH 值为7.4 且含有大量唾液淀粉酶，但由于作用时间较短，因此只有少部分花色苷会被降解，大部分花色苷则进入胃肠道中。胃部pH 值为1～3，因此花色苷能够稳定存在，只有少量花色苷在钠依赖性葡萄糖共转运体1 的作用下以完整的形式被细胞吸收[46]。肠道是花色苷吸收的主要部位，花色苷在肠道pH 值6～7 的环境下发生大量分解，降解产物通过小肠黏膜进入血液，参与体循环，经肠细胞生物转化后转运到肝细胞，引起一系列水溶性偶联代谢产物迅速释放到肝肠循环系统并随尿液排出。花色苷未能进入体循环的降解产物最终进入pH 值为7～8 的结肠中，被微生物分解成小分子的酚酸。多项研究表明，由于花色苷在机体内环境中的不稳定性，使其未达吸收部位就会被降解，摄入富含花色苷的食物或花色苷提取物后，在血浆中检测到的预测代谢物仅占摄入含量的1%。目前，包埋递送技术是保护花色苷不被降解和提高生物利用度的有效手段，主要有喷雾干燥、冷冻干燥、乳化、凝胶、层层自组装、多电解质络合等。

喷雾干燥是最常用的包埋技术之一，得到的颗粒含水量较低，而干燥过程中设备进风口温度通常为130～170 ℃，会引起花色苷发生降解[47]，冷冻干燥技术可有效解决以上问题，多项研究表明，冷冻干燥可以更好的保持花色苷的抗氧化活性和稳定性。然而，物料经过冷冻干燥后易结块，存在粒度难以控制、制备的颗粒渗透性高等问题[47]。

分子包埋法[48]是通过氢键、范德华力和疏水作用将一种材料从分子层次上嵌入到另外一种材料中，此法生产的制品，其芯、壁结合牢固，颗粒大小分布均匀，具有较好的稳定性。然而，该方法对内芯材料的要求较高，若芯材超过壁材分子的疏水区容纳能力则无法实现芯材的有效包埋。

反溶剂沉淀法[49]是将壁材物质溶解在一种沸点比水低、与水不相溶且易挥发的有机溶剂中，再加入芯材和表面活性剂后形成的油包水型乳状液。在此基础上，制备含有胶体稳定剂的水溶液，将油包水乳化液加入其中，挥发去除有机溶剂后冻干获得微胶囊。此法所制得的微球，其粒径可达到纳米级别，但包埋率低，约达40%。

凝聚微胶囊化是指一种或多种水胶体与初始溶液分离，使用同样的反应介质，在悬浮或乳化的活性组分周围沉淀出新的凝聚相，常用的壁材一般为蛋白质、多糖等大分子成分，根据选择壁材的数量可划分为简单凝聚和复合凝聚两种类型，前者是只有一种壁材，后者则是通过改变溶液的pH值使多糖和蛋白质带着相反电荷，再利用静电相互作用、氢键、疏水相互作用等聚合形成微胶囊。复合凝聚法具有制备条件温和、芯材损耗少、包埋率较高、高温高湿条件下稳定等优点，但存在成本高、仅能包埋不溶于水的芯材等缺点。Shaddel等[50]通过对花色苷进行双重乳化，形成W1/O/W2型乳液后加入明胶和阿拉伯胶溶液，通过静电相互作用实现花色苷的高效包埋，其包埋率可以达到81.12%，载药量为33.53%。

3.2 蓝莓花色苷微胶囊化壁材

常见的包埋材料包括乳清蛋白、酪蛋白、明胶、壳聚糖、阿拉伯胶、果胶等，这些成分因具有良好的生物相容性、生物可降解性、成膜性、营养价值，通常被用作生物活性成分的递送。同时，由于蛋白质和多糖的结构特点，使其在体内能够对酶、pH 值等条件的改变做出响应，实现芯材的靶向释放。

3.2.1 多糖 多糖在递送系统中具有较高的包封效率、高耐酸性、高溶解性和高耐热性等优点。可用于花色苷包埋的多糖主要有甲壳素[51]、壳聚糖及其衍生物[52-53]、果胶[54]、黄原胶[55]、麦芽糊精[56]、海藻酸盐[57]、卡拉胶[58]、硫酸软骨素[59]等，这些物质的羟基、羧基和氨基等亲水官能团可在上皮和黏膜的糖蛋白中与生物分子共价结合；还可通过氢键相互作用、疏水相互作用、静电相互作用等方式和花色苷结合。

由于单一的多糖无法达到稳定花色苷和靶向释放的效果，因此在包埋过程中多采用2 种或者3 种具有不同性能的多糖进行复合，详见表3。

表3 用于花色苷递送的多糖基壁材Table 3 Polysaccharide base wall materials for anthocyanin delivery

3.2.2 蛋白质 蛋白质因具有乳化性、溶解性、凝胶性、生物可降解性、生物相容性等优点可用于花色苷的递送。目前涉及的蛋白质基递送系统主要包括乳清蛋白[62]、酪蛋白[63-65]、大豆蛋白[66]、牛血清白蛋白[67]等。在油-水或气-液界面上，蛋白分子侧链上的亲水基团（如赖氨酸、天冬氨酸或脯氨酸）及疏水基团（如酪氨酸或色氨酸）可在输送系统中起到乳化剂的作用[58]。由于花色苷和蛋白质之间的非共价键、氢键、静电相互作用、范德华力和亲核基团之间的共价键等可使其自发结合[59]，结合类型取决于花色苷分子的性质以及蛋白质的侧链基团和酰胺键，结合强度可改变花色苷-蛋白质聚集颗粒的功能，详见表4。

表4 用于花色苷递送的蛋白质基壁材Table 4 Protein base wall materials for anthocyanin delivery

花色苷与蛋白质结合后能显著提高其抗氧化活性和稳定性，防止褪色和失活。蛋白质与花色苷的相互作用也可以改变蛋白质的二级结构，从而改善其性能。相比于单一的蛋白质或花色苷分子，二者结合之后形成的颗粒的总粒径可能会有所增加，在较高的花色苷浓度下，分子之间的相互作用以及基团之间的物理振动和拉伸可能会使得尺寸减小。由于具有较小粒径的分子更容易被机体吸收，因此在选择花色苷的包封材料时，粒径的颗粒之间的分散性应该作为包封效果的评价指标之一。蛋白质基递送系统容易受到生物机体内蛋白酶的消解作用，蛋白质具有的等电点使其容易受到pH 值的影响发生聚集和沉淀，导致生物利用率下降。Lang 等[65]对比了α-酪蛋白和β-酪蛋白对蓝莓花色苷的稳定效果，两种蛋白均能提高蓝莓花色苷在肠道消化过程中的稳定性，保护其抗氧化能力，且α-酪蛋白的效果优于β-酪蛋白。

3.2.3 多糖-蛋白质 单一的包埋壁材并不能完全实现花色苷的控制释放和靶点递送，因此可将多种类型壁材复合使用以弥补单一材料的缺陷。如多糖和蛋白质复配的递送体系中，多糖提供稳定的空间结构来防止蛋白质降解沉淀，蛋白质则提供良好的乳化和溶解作用，协同花色苷发挥生理功效。Cui 等[68]通过酪蛋白（CA）和羧甲基纤维素（CMC）的自组装制备纳米复合物来包埋蓝莓花色苷，结果表明配合物Ⅲ（CA-CMC-ACNs）的尺寸最小为209.9 nm，而配合物II（CMC-ACNs-CA）的包埋率（EE）最高（44.23%）。Ma 等[69]使用明胶和壳聚糖包埋蓝莓花色苷，包埋率为83.81%，在室温下稳定，15 d 后的保留率为50%。

4 结语

我国蓝莓资源十分丰富，其主要活性成分花色苷虽具有多种功能活性，但存在稳定性差、体内生物利用度低等问题。传统的花色苷提取纯化技术大多集中在有机溶剂提取上，因此，有必要从绿色环保和节能增效两方面出发，创新花色苷绿色提取纯化和稳态化调控技术，实现花色苷功能及应用的品质提升，为促进我国水果产业健康高质量和可持续发展提供参考。