CircRNA 在乳腺癌中的研究进展

殷飞 倪毅 刘伟 钱炜伟 刘蕾 马家礼 许桐林

目前乳腺癌成为了中国女性最常见的癌症。2018 年, 乳腺癌在我国女性最常见的5 种恶性肿瘤中排第1 位, 占我国恶性肿瘤患者总数的19.2%；在女性5 种最常见的癌症相关死亡原因中位于第4 位, 占我国癌症总死亡人数9.1%［1］。目前早期乳腺癌患者即使给予了规范化的治疗, 仍有30%～40%有可能发生转移［2］。因此从分子层面了解乳腺癌的发生、进展发病机制尤为重要。

CircRNA 是一类非线性的非编码核糖核酸(RNA),它们通过特殊的反向拼接, 形成不含3'末端和5'末端的共价闭合连续环。1976 年科学家发现类病毒是单链共价封闭的CircRNA 分子［3］。早期研究认为CircRNA是线性信使RNA(mRNA)加工过程中误剪接的副产品,没有特殊功能［4］。随着高通量RNA 测序(RNA-seq)技术的发展和应用, 目前CircRNA 作为一类新的非编码RNA 被人们重视。CircRNA 从产生机制上可以分为外显子CircRNA、内含子CircRNA、内含子-外显子CircRNA。CircRNA 的功能主要有：内源性竞争RNA(ceRNA), 海绵擦拭微小RNA(miRNA)；调控蛋白的表达；调控基因转录［5］。近年来研究发现CircRNA在乳腺癌的发生、进展、转移过程中起着重要作用, 现就CircRNA 在乳腺癌中的研究进展总结如下。

1 乳腺癌中CircRNA 的表达变化

CircRNA 在乳腺癌发生、发展中起到重要作用, 很多学者分析和检测了乳腺癌相关CircRNA 的表达变化。Li 等［6］使用ceRNA 微阵列技术检测在6 对乳腺癌和相应的癌旁组织中筛选出4370 个异常表 达CircRNA, 其 中2735 个 上 调, 1995 个 下 调。进一步使用聚合酶链式反应(PCR)技术确认了hsa_circ_0069094、hsa_circ_0062558、hsa_circ_0074026、hsa_circ_0079876 在乳腺癌组织及细胞系中表达上调, hsa_circ_0017536、hsa_circ_0023302、hsa_circ_0017650、hsa_circ_0017545 表达下调。Yan 等［7］高通量测序技术在乳腺癌干细胞中筛选出27 个异常表达的CirRNA(fold change≥1.8, Pvalue ＜ 0.05), 其 中19 个表达下调, 8 个表达上调；并随机选取了circVRK1,circBRIP, circOLA, circETFA, circMED13 和circBCL11B进行PCR 验证, 最终证明PCR 结果与RNA 测序数据一致。Yin 等［8］从5 个乳腺癌和配对健康志愿者的血浆中利用微阵列分析发现41 个CircRNA 异常表达(fold change≥2), 其中19 个上调和22 个下调, 通过PCR 确认了hsa_circ_0001785、hsa_circ_0108942 上调和hsa_circ_0068033 下调；进一步研究发现hsa_circ_0001785在乳腺癌患者血中表达术后明显低于术前。Yuan 等［9］利用微阵列技术在激素受体阳性的乳腺癌组织中鉴别出3653 个异常CircRNA, 其中1953 个 circRNAs 表达上调, 1700 个circRNA 表达下调；后续利用定量PCR技 术, 验 证 了hsa_circ_0072304, hsa_circ_0087378 和hsa_circ_0087377 在乳腺癌组织中表达下调。He 等［10］对3 个三阴性乳腺癌细胞系(MDA-MB-231、MDAMB-468 和BT549)和1 个HME 细 胞 系(MCF-10A)进行了高通量微阵列分析, 发现174 个CircRNA 表达下 调, 93 个CircRNA 表 达 上 调(P＜0.05, FDR＜0.05)。Fu 等［11］利用高通量测序技术检测比较了乳腺癌脑转移细胞系231 和对应的非转移乳腺癌细胞系MDAMB-231, 发 现 共 有215 个circRNA 上 调, 191 个circRNA 下调, 进一步PCR 验证了hsa_circ_0001944、hsa_circ_0001481、hsa_circ_0000646、hsa_circ_0001006和hsa_circ_0000732 上 调, hsa_circ_0001910、hsa_circ_0008285 和hsa_circ_0000002 下 调。Gao 等［12］通过微阵列技术从阿霉素耐药MCF-7 乳腺癌细胞和亲本MCF-7 乳腺癌细胞中鉴别出18 个表达变化的Circ RNA, 其中hsa_circ_0002113、hsa_circ _0001667、hsa_circ_0006528 等12 个 上 调, hsa_circ_0008131、hsa_circ_0003838、hsa_circ _0007551 等6 个下调。

CircRNA 在乳腺癌组织、干细胞、外周血以及不同的分子分型中、乳腺癌转移及耐药均有表达变化, 说明CircRNA 在乳腺癌发生、发展及转移及治疗过程中均起到重要作用, 因此研究乳腺癌中表达变化CircRNA 的功能, 对进一步了解乳腺癌的病变机制及治疗有着重要作用。

2 CircRNA 在乳腺癌中的生物学功能及调控

miRNA 在乳腺癌致癌过程中调节基因表达, 调节恶性肿瘤的增殖、转移和侵袭。CircRNA 在乳腺作用miRNA 的内源性竞争RNA, 海绵吸附MirRNA 调节下游蛋白的表达, 形成CircRNA/miRNA/蛋白轴。Pan等［13］发现hsa_circ_0061825 (circ-TFF1)在乳腺癌中表达上调, 功能上海绵吸附miR-326 上调TFF1 表达, 通过miR-326/TFF1 轴介导促进乳腺癌进展, 敲除Circ-TFF1 阻碍乳腺癌细胞在体外的增殖、迁移、侵袭。Tang 等［14］发现 CirKIF4A 在三阴性乳腺癌中表达上调, 功能上作为Mir-375 的海绵调节KIF4A 的表达,形成 CirKIF4A/miR-375/KIF4A 轴调节三阴性乳腺癌细胞的增殖和迁移。Xiao 等［15］发现CircAHNAK1 在三阴性乳腺中表达显著下调, CircAHNAK1 作为miR-421 海绵, 减弱miR-421 对其靶基因RASA1 的抑制作用, 过表达Circ AHNAK1 可抑制三阴性乳腺癌的增殖、迁移以及体外侵袭。Zhou 等［16］发现CircFBXL5(hsa_circ_0125597)在乳腺癌肺转移组织中上表达上调, 功能上作为海绵与miR-660 结合调节SRSF6 表达, 功能分析提示敲除CircFBXL5, 能抑制乳腺癌细胞的增殖和向肺的迁移。Sang 等［17］发现hsa_circ_0025202 他莫昔芬耐药的MCF-7 细胞系中表达下调, 功能上作为miR-182-5p 的 海 绵, 调 控miR-182- 5p/FOXO3a 轴,能抑制细胞增殖、集落形成和迁移, 增加细胞凋亡和对他莫昔芬的敏感性。

上述研究发现乳腺癌中CircRNA 作为miRNA海绵在乳腺发生、分子分型、远处转移及耐药过程中发挥调控作用, 但是也有一部通过部分研究提示CircRNA 通过其他方式调控乳腺癌, 如调控信号通路、编 码 蛋 白。Zhou 等［18］发 现hsa_circ_0011946/RFC3信号通路可抑制乳腺癌MCF-7 细胞的迁移和侵袭能力。Ma 等［19］发现在对紫杉醇耐药的三阴性乳腺癌细胞系中CircAMOTL1 具有调节AKT 通路的功能, 通过激活AKT 产生磷酸化的AKT, 抑制细胞凋亡, 促进细胞存活。Wang 等［20］研究发现circ_0067934 在乳腺癌组织中表达上调, 具有调控蛋白的功能, 实验发现敲除circ_0067934, 发现MCL-1 表达降低；通过上调蛋白MCL-1 来促进乳腺癌细胞增殖, 调节细胞周期。Ye 等［21］发现在三阴性乳腺癌中CircFBXW7 具有编码的FBXW7-185AA 蛋白的功能, 通过上调FBXW7的表达来抑制三阴性乳腺癌的进展。Du 等［22］发现circSKA3 在乳腺癌细胞系表达上调, 功能上可以结合TKS5 和Integrinβ1, 诱导侵袭性伪足的形成, 促进乳腺癌转移。目前乳腺癌CircRNA 相关的上游调控机制研究较少, Zheng 等［23］发现E2F1 和EIF4A3 分别结合了SEPT9 基因的启动子和转录前体RNA, 对CircSEPT9 的生成有调控作用。

综上可知, CircRNA 对乳腺癌的调控是多途径, 可以作为miRNA 海绵, 可以调节乳腺癌的相关信号通路,可以编码相应的蛋白, 在乳腺癌发生、发展及转移过程中起到关键作用。

3 CircRNA 在乳腺癌临床诊疗中的应用

3.1 CircRNA 成为乳腺癌潜在的诊断及判断预后的生物标志物 早发现、早诊断、早治疗是目前降低乳腺癌死亡率, 提高治愈率的关键。目前乳腺癌主要诊断方法包括超声、钼靶和穿刺活检等是侵入性或昂贵的, 因此微创和便宜的方法是迫切需要的。此外, 乳腺癌术后复发风险评估对乳腺癌的术后治疗起到重要指导作用。Li 等［6］发现CircRNA 在乳腺癌患者血浆与正常人血浆表达水平的显著差异, hsa_circ_0069094、hsa_circ_0079876 上 调, hsa_circ_0017650 和hsa_circ_0017536 下调, 因此可以作为乳腺癌诊断潜在血液标记物。Yin 等［8］研究示提了与健康人群比较, 乳腺癌患者外周血中hsa_circ_0001785、hsa_circ_0108942上调和hsa_circ_0068033 下调, 受试者工作特征曲线(ROC)显示hsa_circ_0001785 的诊断价值［曲线下面积(AUC)=0.771］优于其他CircRNA；进一步研究发现hsa_circ_0001785 在乳腺癌患者血中表达术后明显低于术前, 因此hsa_circ_0001785 有成为乳腺癌潜在诊断标记物的价值。Liu 等［24］研究提示hsa_circ_001783 在乳腺癌中表达上调, 高水平的hsa_circ_001783 与乳腺癌患者的不良预后有关, 因此可作为乳腺癌的一种新的预后标记物。Zeng 等［25］研究发现circANKS1B 在三阴性乳腺癌中表达增加与淋巴结转移及晚期临床密切相关, 是乳腺癌患者整体生存的独立危险因素。Li 等［26］发现circ-VRK1 在乳腺癌组织及细胞系中下调, 具有抑制细胞增殖, 促进细胞凋亡的作用, 可作为患者预后的独立预测因子。Yan 等［27］发现与癌旁正常组织比,hsa_circ_0072309 在乳腺癌组织中表达下调, 具有抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭的功能, 可以作为判断乳腺癌预后的生物标志物。

3.2 CircRNA 具有成为乳腺癌潜在治疗靶点的可能目前, 许多circRNA 已被证明与乳腺癌的增殖和进展有关, 表明它们有在乳腺癌治疗中作为靶点的潜在作用。CircRNA 有望为乳腺癌治疗提供新的途径, 目前,一些技术为部分或完全去除致癌CircRNA 提供了可能,如小干扰RNA(siRNA)的技术。Zhou 等［16］发现敲除CircFBXL5, 能抑制乳腺癌细胞的增殖和向肺的迁移,可以作为乳腺癌肺转移治疗潜在靶点。Zeng 等［25］证明在三阴性乳腺中ESRP1/CircANKS1B/miR-148a/152-3p/USF1 通路通过诱导TGF-β1介导的乳腺癌上皮间质化, 促进细胞侵袭和转移, CircANKS1B 作为治疗靶点可更好地预防乳腺癌转移。

3.3 CircRNA 具有逆转乳腺治疗耐药的可能 化疗、内分泌治疗是乳腺癌全身治疗的主要方法, 但是内分泌或化疗耐药性而降低临床治疗效果, 导致相关乳癌患者预后差。因此了解乳腺癌发病过程中引起耐药的分子途径是至关重要。Ma 等［19］发现CircAMOTL1 在对紫杉醇耐药的三阴性乳腺癌MDA-MB-231 细胞系中表达上调, 能够增加细胞活力, 减少细胞凋亡, 增强侵袭能力, 通过调节AKT 途径、促进抗凋亡蛋白和抑制促凋亡蛋白, 能降低紫杉醇对乳腺癌细胞的杀伤。Gao等［12］从阿霉素耐药的MCF-7 乳腺癌细胞中表达上调, 进一步研究发现Circ0006528/miR-7-5p/Raf1 轴在乳腺癌阿霉素耐药中起到调节作用。Liang 等［28］发现在有转移的乳腺癌组织中CircBMPR2 的表达下调。在功能上, 敲除CircBMPR2 有效地促进细胞增殖、迁移和侵袭。此外, 敲除CircBMPR2 通过抑制他莫昔芬诱导的细胞凋亡来促进乳腺癌细胞对他莫昔芬的耐药性,CircBMPR2 表达上调能降低他莫昔芬耐药性；进一步研究发现CircBMPR2 海绵擦拭miR-553, 减轻USP4的抑制作用, 以抑制乳腺癌的进展和他莫昔芬的耐药性。Sang 等［17］在他莫昔芬耐药的乳腺癌MCF-7 筛查出hsa_circ_0025202 表达下调, 功能有增加他莫昔芬的敏感性作用。Liu 等［29］在Monastrol 耐药的乳腺癌细胞系中筛选出CircRNA-MTO1 (hsa_circRNA_007874)在细胞系中下调, 提高circRNA-MTO1 表达能增加Monastrol 的作用, 逆转耐药。因此抑制表达上调的耐药CircRNA 或上调表达下调的药敏circRNA 具有逆转临床乳腺癌治疗耐药的可能。

CircRNA 刚发现时认为是错误剪接的无功能产物,但目前研究发现CircRNA 具有包括海绵、翻译等多种功能。根据本文综述可知CircRNA 参与乳腺癌的各种生物学过程, 包括增殖、迁移、侵袭、凋亡和转移, 可以作为乳腺癌诊断、预后、复发和风险评估的潜在生物标志物、治疗靶点。CircRNA 为乳腺癌的诊断和治疗提供了新的视角, 然而目前研究中仍有很多不足。尽管目前已经发表了很多关于乳腺癌CircRNA 研究的文章, 但关于CircRNA 在乳腺癌发生和发展过程中的确切机制还需深入研究。目前乳腺癌CircRNA 的研究主要集中于组织样本, 对血液中及循环肿瘤细胞中的研究尚有不足。CircRNA 的功能研究主要集中在其下游调控机制及作用, 其上游调控机制目前研究较少。CircRNA 具有成为潜在的诊断和预后生物标志物潜力,但其临床意义还进一步扩大样本量的研究。CircRNA具有作为乳腺癌治疗的潜在靶点可能, 如何有效的增加具有抑癌作用CircRNA 的表达, 或降低或敲除具有促癌作用CircRNA 的表达满足临床治疗的需要仍有待进一步研究。随着技术进步, 未来CircRNA 在临床应用将为癌症治疗带来巨大的进步。