具有表面微孔的3D打印PCL网状支架的制备及性能

郭芳，曾辉，刘宁，黄硕，郭亚媛，刘昌奎

(西安医学院口腔医学院牙颌面组织再生与修复研究中心，西安 710021)

三维支架或骨移植物是骨组织工程的重要组成部分，它们为细胞附着和增殖、蛋白质生产和骨组织再生提供了机械支持和仿生环境[1]。聚己内酯(PCL)是一种人工合成高分子有机化合物，经美国食品药品监督管理局批准，具有良好的生物相容性和生物可降解性，且易成型[2-3]，但其本身不具有生物活性，且表面光滑、疏水性强，如果作为植入物使用，其表面不具有利于细胞生长的物理、生理特性。尽管3D打印技术在实现骨移植物制造的复杂几何形状方面取得了成功[4-5]，但在植入物-生物表面方面仍不够理想。而材料的亲疏水性，对其润湿性、生物相容性等方面起到非常重要的作用，PCL的化学惰性以及低的表面能导致其与生物表面的相互作用不足[6]，而成骨细胞更喜欢黏附在粗糙材料的表面[7]。近年来的研究证实[8-9]，表面形貌的改变，直接影响依附于支架生长的细胞增殖分化行为，表面粗糙的多孔支架对于细胞成骨分化具有促进作用。

已有学者采用通过蛋白质涂层、等离子体等技术改善骨组织工程亲水性的策略[10]。然而综合时间成本、技术复杂程度、设备经费等问题，开发一种简单的、能够有效改善3D打印PCL骨组织工程支架亲水性的方法是十分必要的。据报道，用碱性溶液水解聚合物材料表面可以改善细胞的表面性能，从而更好地促进细胞附着和增殖[11]。Gao等[12]对聚乙醇酸纳米纤维进行氢氧化钠(NaOH)处理，结果显示，纤维直径随着处理时间的增加而减小，纤维保持了完整的纤维网状结构，改善了血管平滑肌细胞的附着。梅倩倩等[13]为了优化PCL纳米纤维膜的蛋白吸附性能，利用乙醇和NaOH对其进行改性处理，结果显示改性处理提升了PCL纳米纤维膜的蛋白吸附能力。由此可见，使用NaOH处理3D打印PCL骨组织工程支架，对于改善支架表面微形貌具有重要的意义。笔者为了系统研究NaOH处理对3D打印PCL网状支架表面孔隙生成过程的影响，共采用了25组浓度和时间的参数组合，这些参数组合涵盖了从温和至极强处理的范围。研究了不同反应参数组合对PCL网状支架表面孔隙生成及其亲水性的影响，检测分析3D打印PCL网状支架经过NaOH诱导蚀刻后在微观形貌、能谱元素、亲水性、强度、细胞附着等方面的变化，优化反应参数，在强度损失更小的情况下获得最理想的NaOH处理反应参数，为改善3D打印PCL网状支架表面亲水性及细胞反应提供借鉴和参考。

1 实验部分

1.1 主要原材料

PCL：PCL-05，吉林省科瑞斯生物科技有限公司；

NaOH：分析纯，纯度≥96%，国药集团化学试剂有限公司；

胎牛血清：美国Gibco公司；

青霉素、链霉素、DMEM/F12培养基：美国Hyclone公司。

1.2 主要仪器和设备

3D打印机：Professor 300，陕西聚康高博医疗科技有限公司；

扫描电子显微镜(SEM)：Sigma 300，德国ZEISS公司；

离子溅射镀膜仪：SC7620，英国Quorum公司；

能量色散X射线光谱仪(EDX)：Oxford Xplore 30，英国牛津公司；

接触角测量仪：OCA20，德国Dataphysics公司；

电动液压伺服机械测试机：SANS CMT4304，美国MTS公司。

1.3 3D打印PCL网状支架的制备及NaOH处理

PCL网状支架采用熔融沉积成型(FDM)打印方法进行制备。支架设计及打印参数如下：孔径为500 μm，丝径为400 μm，打印速度为20 mm/s，层层纤维夹角为90°，喷嘴温度为80 ℃，平铺扫描。3D打印PCL网状支架如图1所示。

图1 3D打印PCL网状支架外观及SEM表面微观结构Fig. 1 3D printed PCL mesh scaffold appearance and SEM surface microstructure

利用NaOH溶液对支架表面进行刻蚀处理，为了系统地研究孔隙生成过程，对支架从温和至极强进行处理。实验分为两组：未处理组、处理组。处理组用去离子水清洗后加入不同浓度的NaOH溶液，将样件固定在室温下不同时间进行处理，处理完成后取出支架，流水彻底冲洗12 h，再用去离子水离心清洗3次，然后在37 ℃烘箱内烘干。NaOH溶液的浓度分别为0.5，1，5，10，15 mol/L，处理时间分别为1，6，12，24，48 h。

1.4 测试与表征

1.4.1 SEM与EDX表征

使用SEM对处理组及未处理组PCL网状支架的表面形貌进行观察。将未经过刻蚀和不同条件下刻蚀的PCL网状支架粘在样品台的导电胶上，经溅射镀膜仪喷金处理后使用SEM拍摄样品形貌，同时使用EDX观察和测试NaOH处理后未彻底清洗的PCL网状支架表面。采用SEM拍摄形貌时加速电压为3 kV，采用EDX测试时加速电压为15 kV，探测器为SE2二次电子探测器。

1.4.2 接触角测试

采用FDM打印10 mm×10 mm×3 mm实体块材，按上述方法进行NaOH处理，置于接触角测量仪测试平台，利用设备自动滴定系统滴上水滴，拍摄测试照片，用量角法量取接触角角度，每个测量3个平行样件。

1.4.3 压缩性能测试

参照GB/T 1041-2008进行单轴压缩试验，样件尺寸为10 mm×10 mm×4 mm，测试25%应变对应的压缩强度，使用电动液压伺服机械测试机以1 mm/min压缩速率对未处理组及处理组支架进行压缩性能测试，每组测试3个样本。

1.4.4 支架表面细胞形态学观察

使用的SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)为本实验室冻存，采用含体积分数10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基在37 ℃，5% CO2培养箱中培养BMSCs，待BMSCs贴壁生长至细胞密度70%～80%融合状态时传代，笔者采用3～5代BMSCs进行后续试验。将60Co辐照灭菌的未处理组、处理组PCL网状支架(尺寸为10 mm×10 mm×3 mm)放入24孔板内，每组3个复孔。将BMSCs细胞以5×104个/mL的密度滴种于支架表面，在37 ℃的CO2孵箱内孵育6，24 h后，移除培养基，采用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗后用2.5%戊二醛固定细胞1 h，然后无水乙醇梯度脱水。样品喷金后以SEM观察细胞在微结构上的黏附以及黏附的形态。

1.4.5 统计学分析

采用SPSS13.0软件，应用单因素方差分析法(One-way ANOVE)进行均数比较，各组数据均用均数±标准差表示，对比处理组与未处理组PCL网状支架的亲水性和力学差异，p＜0.05表示具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 NaOH处理对3D打印PCL网状支架表面形貌的影响

利用SEM观察NaOH浓度和反应时间对3D打印PCL网状支架表面粗糙度的影响，为了系统地研究孔隙生成过程，共采用了25种浓度和时间的组合，从极温和到极强处理，限于篇幅，只进一步讨论和分析具有代表性的表面形貌及其对应的参数组合，如图2所示。未处理组支架表面光滑(这可以从图1b和图1c看出)，而从图2可以看出，3D打印PCL网状支架经不同NaOH反应参数处理后主要产生了3种类型的表面形态：第1种是温和处理形成的褶皱表面(图2a～图2c)；第2种是较强处理形成的粗糙表面(图2d～图2f)；第3种是NaOH处理强度进一步增加后形成凹坑和孔洞(图2g～图2i)。结果表明在较低的NaOH浓度下，NaOH针均匀地分散在PCL的表面，表面的起伏较为均匀；随着NaOH浓度的增加，起伏增加，在高浓度下，它们聚集并形成针簇，从而形成更大的孔隙。与Wang等[14]报道较为一致，NaOH处理板材表面粗糙，随着NaOH浓度增加表面形成小孔。

图2 不同NaOH溶液浓度和处理时间的3D打印PCL网状支架蚀刻后表面形态Fig. 2 Surface morphology formed after etching of the 3D printed PCL mesh scaffolds with different NaOH solution concentrations and treating times

PCL网状支架的表面改性是通过两种途径形成的：一是PCL主链上的酯键发生皂化反应，其中NaOH中的氢氧根离子破坏PCL的主链，形成羟基和羧基，这些官能团与水相互作用，从而增强了材料的亲水性；二是溶液中NaOH以针、束状晶体的形式被固定在聚合物表面(图3a)，其可蚀刻PCL支架的表面，从而产生凹坑和孔洞。为证实这些晶体的组成，通过EDX对PCL网状支架进行表征，发现晶体含有Na，O两种元素，可证实其为NaOH晶体(图3b、图3c)。此外，由于NaOH晶体聚集在蚀刻材料表面，因此在进行任何表征方法之前都需要彻底清洗支架。

图3 3D打印PCL网状支架的SEM和EDX分析Fig. 3 SEM and EDX analysis of 3D printed PCL mesh scaffold

2.2 NaOH处理对3D打印PCL网状支架亲水性的影响

微结构的粗糙度和接触角的改变可影响材料表面的润湿性，从而影响材料表面蛋白的黏附，进而影响细胞的黏附[15-17]。材料表面粗糙度会影响细胞的增殖和分化[18-20]。根据蚀刻后SEM分类结果，只进一步讨论了以下5种处理反应参数组合制备的PCL支架的亲水性和力学性能：5 mol/L-24 h，10 mol/L-6 h，10 mol/L-12 h，10 mol/L-24 h，15 mol/L-24 h。未处理组及处理组PCL网状支架接触角变化如图4所示，相应接触角大小见表1。由图4和表1看出，经NaOH处理后的各组支架表面接触角均显著低于未处理组(F=271.591，p＜0.001)，处理组中NaOH反应参数组合为5 mol/L-24 h，10 mol/L-6 h，10 mol/L-12 h的组间无差异(p＞0.05)，其余组间差异均有统计学意义(p＜0.05)；PCL网状支架未处理组接触角为101.53°±1.71°，处理组中以15 mol/L NaOH处理24 h组的接触角度数最低(43.67°±1.95°)。结果表明，碱处理组PCL网状支架材料的接触角较对照组均显著降低。根据润湿性的定义，接触角在＞90°(或＜90°)时，材料表现为疏水性(或亲水性)。当接触角为65°时，材料表面最有利于成骨细胞的黏附[21]，大于或小于65°都会导致细胞的黏附能力降低。由测试结果可知，处理组支架均表现为亲水性增强，其中10 mol/L-6 h处理支架的接触角为62.80°±1.85°，最接近65°。

表1 未处理及经5种反应参数组合的NaOH处理后PCL网状支架表面接触角数据Tab. 1 Surface contact angle data of PCL mesh scaffolds without treatment and after NaOH treatment with five parameter combinations

图4 未处理及经5种反应参数组合的NaOH处理后PCL网状支架表面接触角的变化Fig. 4 Changes in surface contact angle of PCL mesh scaffolds without treatment and after NaOH treatment with five parameter combinations

2.3 NaOH处理对3D打印PCL网状支架压缩强度的影响

理想的支架材料强度要适中，能够承受得住生理压力，为新生的组织提供较好的力学支撑。未处理及处理组(NaOH反应参数组合：5 mol/L-24 h，10 mol/L-6 h，10 mol/L-12 h，10 mol/L-24 h，15 mol/L-24 h)PCL网状支架压缩强度的变化如图5所示。图5结果显示，与未处理组压缩强度相比，NaOH处理参数为5 mol/L-24 h，10 mol/L-6 h的支架的差异没有统计学意义(p＞0.05)；NaOH处理参数为10 mol/L-12 h，10 mol/L-24 h，15 mol/L-24 h的支架的差异具有统计学意义(p＜0.001)。

图5 经不同反应参数组合的NaOH处理后PCL网状支架压缩强度的变化Fig. 5 Changes in compressive strength of PCL mesh scaffolds after NaOH treatment with different reaction parameter combinations

压缩试验结果表明，支架强度随着NaOH处理强度的增加而不断降低，经5 mol/L-24 h，10 mol/L-6 h NaOH处理后支架的压缩强度分别为(11±1)MPa和(11.33±1.53) MPa，在松质骨抗压强度范围内，满足骨组织工程支架力学要求。同时，试验发现，两组支架在压缩过程中均没有发生碎裂，显示出较好的韧性。

2.4 NaOH处理对3D打印PCL网状支架细胞黏附情况的影响

Voisin等[22]发现表面粗糙度的增加可引发细胞的早期成熟，以丝状伪足延伸的形式可见。为了进一步研究细胞在蚀刻PCL网状支架表面微结构上的黏附以及黏附的形态，观察细胞接种后6，12 h与底物立即相互作用后的细胞反应。结合亲水性和压缩试验结果，选择NaOH处理参数组合为10 mol/L-6 h的处理支架进行细胞黏附试验。图6的SEM结果显示了细胞黏附在未处理及处理组(10 mol/L-6 h)网状支架表面的形态差异。由图6可以看出，接种细胞6 h后，在未处理组PCL支架表面观察到细胞产生细胞质片状结构，纤维状突起较少；而在NaOH处理组支架表面，细胞产生丝状延伸，锚定在粗糙表面的凸起和凹陷内，即NaOH蚀刻后支架黏附细胞伸出的突触更多(图6b)。接种细胞12 h后黏附的“接触诱导”效应更为明显，呈现“拉伸”状态(图6d)；与处理组对比，未处理支架上的细胞数目少、细胞铺展面积小。通过SEM观察可得出碱蚀刻促进了黏附细胞在支架上的伸展，这一结果和文献[22]的结果一致。

图6 未处理组及处理组PCL网状支架在大鼠BMSCs细胞接种6，12 h后材料表面细胞黏附情况Fig. 6 Cell adhesion on material surface of untreated and treated PCL mesh scaffolds after 6，12 h of cell inoculation with rat BMSCs cells

3 结论

(1)不同NaOH反应参数组合处理3D打印PCL网状支架可有效改善其表面微形貌，主要产生了3种类型的表面形貌特征：一是温和处理条件下形成的褶皱表面；二是较强处理形成的粗糙表面；三是NaOH处理强度进一步增加时形成的凹坑和孔洞。

(2)不同NaOH反应参数组合处理后，支架亲水性相较于未处理组显著增加，但支架压缩强度随着NaOH处理强度的增加而降低。

(3) NaOH处理3D打印PCL网状支架可有效改善细胞反应。NaOH最适宜的处理反应参数组合为10 mol/L-6 h，支架显示较佳的亲水性且压缩强度损失最小，增加了黏附细胞的数量，促进了黏附细胞的伸展。