胶体金免疫层析试验在梅毒抗体检测中的价值及适用范围研究

石杜娟

梅毒作为一种可引起人体皮损和多系统多器官损伤的性传播疾病，近些年来有逐渐上升的趋势[1］。2023年1 月的全国法定传染病疫情概况中显示报告发病数居前5 位的病种中，梅毒位列第三；当月梅毒发病人数达到28 708 人，为性传播疾病之首[2］。梅毒早期感染较隐匿，症状不明显，而梅毒的早发现和早干预可有效预防梅毒期的进展。目前临床常用于梅毒螺旋体抗体筛查实验多为化学发光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）、光激化学发光法（lightinduced chemiluminescence immunoassay，LICA）、酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay ，ELISA）。而梅毒螺旋体颗粒凝集试验（treponema pallidum antibody，TPPA）常作为梅毒螺旋体抗体的确认试验[3］。偏远和社区基层检测点多采用胶体金免疫层析试验（gold immunochromatography assay，GICA）作为初筛方法[4］。本文以TPPA 结果作为金标准，拟通过比较GICA 法与常用的初筛试验（ELISA、LICA、CLIA）的性能指标、一致性分析、受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线下面积、以及与该3 种方法的不同S/CO 值（样本吸光值/临界值）分区范围的符合率比较，以此探寻胶体金免疫层析法在诊断梅毒中的价值和适用范围。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2022 年2～5 月合肥市滨湖医院住院患者、门诊就诊者以及体检者共143 人份血清标本，采用5 种不同方法学试剂进行梅毒螺旋体抗体的平行检测。以TPPA 为金标准，119 例TPPA 阳性作为疑似梅毒组，年龄1～91 岁。24 例TPPA 阴性为非梅毒组，年龄分布1～71 岁。两组受试者的一般资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。梅毒诊断标准参照卫生部的《梅毒诊断标准（中华人民共和国卫生行业标准）WS 273-2018》。本研究已通过医院伦理委员会审批，伦理批文号：[2023（44）］。

表1 两组患者一般资料分析

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：①流行病学史或临床表现符合梅毒特征；②既往梅毒实验室血清学试验阳性或快速血浆反应素试验（rapid plasma regain test，RPR）阳性。排除标准：①合并血液高凝状态的疾病；②合并类风湿性关节炎；③临床信息不详。

1.3 方法

1.3.1 仪器与试剂 CLIA 采用由深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司生产的迈瑞CL8000i 全自动化学发光分析仪、原装配套试剂以及质控品；TPPA 试剂盒为日本富士瑞必欧株式会社产品；LICA 采用由北京科美生物技术有限公司生产的LICA 500 自动光激化学发光检测仪，其配套试剂盒和质控品由博阳生物科技（上海）有限公司提供；ELISA 采用由上海科华生物工程股份有限公司生产的梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒（酶联免疫吸附法）；GICA 采用英科新创（厦门）科技股份有限公司生产的梅毒螺旋体抗体检测试剂盒（胶体金法）。

1.3.2 标本采集 被检标本均为空腹采集肘静脉血，以4 000 r/min 离心10 min 来分离血清，将血清冻存于-20°C。

1.3.3 结果判定

1.3.3.1 TPPA 检测法 将血清稀释液按100 μL、25 μL、25 μL、25μL 依次加入微孔板中的1～4 孔，再取25 μl 血清加至第一孔，然后依次从上一孔吸取25 μL 至下一孔。然后在第3 孔、第4 孔中分别滴入未致敏颗粒、致敏颗粒，混匀后室温静置2 h。结果为未致敏粒子（最终稀释倍数1∶40）的反应图象判定为梅毒螺旋体抗体阴性，致敏粒子（最终稀释倍数1∶80 以上）的反应图象判定为阳性时，最终判定为梅毒螺旋体抗体阳性。

1.3.3.2 GICA 检测法 取100 μL 血清加入加样区，18～22 min 内观察结果：检测线和对照线同时出现红色条带即为梅毒螺旋体抗体阳性，仅对照线出现红色条带为阴性。

1.3.3.3 ELISA 检测法 取100 μL 待测样本严格按照试剂盒说明进行，结果为：待测样本的OD 值≥（阴性对照平均OD 值+0.1），待测样本梅毒螺旋体抗体为阳性；待测样本的OD 值＜（阴性对照平均OD 值+0.1），待测样本梅毒螺旋体抗体为阴。

1.3.3.4 LICA 检测法 样本检测严格按仪器的标准化操作进行，结果按试剂标准化操作规程判定：S/CO＜1.0 即待测样本梅毒螺旋体抗体阴性，S/CO≥1.0 即待测样本为梅毒螺旋体抗体阳性。

1.3.3.5 CLIA 检测法 样本检测严格按仪器的标准化操作进行，结果按试剂标准化操作规程判定：S/CO＜1.0 即待测样本梅毒螺旋体抗体阴性；S/CO≥1.0 即待测样本为梅毒螺旋体抗体阳性。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0 进行数据分析，偏态分布计量资料用M（P25，P75）表示，组间比较采用Mann-WhitneyU方法检验。计数资料以百分比表示，组间比较采用χ2检验；不同试剂间的一致性分析采用Kappa 分析；采用MedCalc 软件分析4 种检测试剂的ROC 曲线对梅毒的诊断效果。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 对各筛查试剂的性能评价 GICA 的特异度与ELISA 的特异度相比，差异有统计学意义（差值=0.292，差 值95%CI：5.42%～52.92%，χ2=5.169，P=0.049）；GICA 的特异度与LICA 的特异度相比，差异有统计 学意 义（差 值=0.292，差 值95%CI：5.42%～52.92%，χ2=5.169，P=0.049）；GICA 与CLIA 的特异度比较，差异有统计学意义（差值=0.625，差值95%CI：40.70%～84.30%，χ2=19.048，P＜0.001）；GICA 的阳性预测值（97.54%）与CLIA 阳性预测值（86.76%）比较，差异有统计学意义（差值=0.108，差值95%CI：4.45%～17.10%，χ2=9.988，P=0.002）。见表2。

表2 各筛查试验性能评价

2.2 不同试剂间的符合率和一致性分析 GICA 和TPPA 的符合率与ELISA 和TPPA 的符合率相比，差异有统计学意义（差值=0.049，差值95%CI：0.10%～9.69%，χ2=3.949，P=0.047）； GICA 和TPPA 的符合率与LICA 和TPPA 的符合率相比，差异有统计学意义（差值=0.049，差值95%CI：0.10%～9.69%，χ2=3.949，P=0.047）；GICA 和TPPA 的符合率与CLIA 和TPPA的符合率相比，差异有统计学意义（差值=0.112，差值95%CI：5.15%～17.23%，χ2=12.606，P＜0.001）。ELISA 和GICA 的符合率与LICA 和GICA 的符合率一致，两组分别与CLIA 和GICA 的符合率相比，两组比较差异均有统计学意义（差值=0.077，差值95%CI：1.21%～14.18%，χ2=5.304，P=0.021）。见表3。

表3 不同试剂间的符合率和一致性性分析

2.3 5 种试剂检测抗TP 抗体阳性结果的交叉示意图可见CLIA 和LICA 均会出现单一试剂阳性的情况，以CLIA 最多（12 例）。同时TPPA（-）GICA（+）ELISA（+）LICA（+）CLIA（+）共2 例，TPPA（-）GICA（+）ELISA（+）LICA（+）CLIA（-）共1 例。GICA 和ELISA 无单独阳性例数。CLIA 有1 例漏检。见图1。

图1 5种试剂检测抗TP抗体结果阳性的示意图

2.4 GICA、ELISA、LICA、CLIA 4 种检测梅毒抗体的ROC 曲线分析 以TPPA 结果为金标准，采用MedCalc软件绘制GICA、ELISA、LICA、CLIA 4 种方法的ROC曲线。通过对4 种ROC 曲线的比较分析可见GICA、ELISA、LICA、CLIA 4 种试剂曲线下面积（area under curve，AUC）差异无统计学意义（P＞0.05）。同过计算得出ELISA、LICA、CLIA 的最大约登指数分别为0.847、0.841、0.849，对应的S/CO 最佳临界值分别为11.65、10.07、3.76。见图2、表4。

图2 以TPPA诊断为标准时4种试剂检测TP抗体的ROC曲线

表4 四种试剂的ROC曲线比较结果

2.5 3 种梅毒检测方法S/CO 值不同区间与GICA 的TPPA符合率比较

2.5.1 ELISA 法S/CO 值不同区间与GICA 的TPPA 符合率比较 按ELISA 的S/CO 值最低值（0.001）到最大值（32.78）分为4 个不同的范围，以TPPA 为标准：S/CO 值在1.00～12.00 时，ELISA 与GICA 的TPPA 符合率比较，差异有统计学意义（差值=0.286，差值95%CI：2.65%～54.49%，χ2=4.200，P=0.040）；其他区间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5。

表5 ELISA法S/CO值不同区间与GICA的TPPA符合率比较[例（%)］

2.5.2 LICA 法S/CO 值不同区间与GICA 的TPPA 符合率比较 按LICA 法检测梅毒抗体的S/CO 值最低值（0.08）到最大值（657.83）分为5 个不同区段，以TPPA为标准： S/CO 值在1.00～10.00 时，LICA 与GICA 的TPPA 符合率比较，差异有统计学意义（差值=0.546，差值95%CI：21.43%～87.66%，P=0.024）；其他区段两者差异无统计学意义（P＞0.05）。见表6。

2.5.3 CLIA 法S/CO 值不同区间与GICA 的TPPA 符合率比较 按CLIA 法检测梅毒抗体的S/CO 值最低值（0.06）到最大值（14.98）分为6 个不同区段： S/CO 值在1.00～4.00 时，CLIA 与GICA 的TPPA 符合率比较，差异有统计学意义（差值=0.517，差值95%CI：31.57%～71.88%，χ2=17.611，P＜0.001）；其他区间两者差异无统计学意义（P＞0.05）。见表7。

表7 CLIA法S/CO值不同区间与GICA的TPPA符合率比较[例（%)］

3 讨论

ELISA、LICA 和CLIA 是梅毒螺旋体免疫学诊断常用方法，这些方法易自动化和标准化，结果判定客观。但是上述方法需要采购大型仪器设备，在基层和偏远地区的应用受限。且随着近些年来梅毒高居性传播疾病的榜首，加上感染者由于心理和社会因素在有临床症状时才来就诊，易错过感染早期治疗。若疑似梅毒感染者能居家检测后再到医院做确认试验，将有利于梅毒早期的检出和治疗。而GICA 可在血清、血浆、全血的模式下检测梅毒螺旋体抗体，且可单人份独立包装、用血量少、操作简便、结果判读简单。为了确定GICA 法能否达到医院常规初筛梅毒抗体方法的性能指标，本文对不同试剂的性能指标进行了分析。结果GICA 的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值均优于ELISA、LICA、CLIA 这3 种方法。这可能与GICA、ELISA、LICA、CLIA 4 种方法检测原理不同或包被抗原不同有关。早在1996 年Gerber 等利用基因重组表达出不同的梅毒螺旋体抗原，用ELISA 检测后发现TP47、TP17 和TP44.5 的抗体滴度最高，而且这3 种抗原联合检测的灵敏度要比单一任何一种抗原的灵敏度要高[5］。目前ELISA 检测梅毒抗体多采用双抗原夹心法，选取TP47、TP17、TP15 和TP45 抗原中的一种、两种或多种抗原融合包被。而GICA 一般采用胶体金免疫检测技术和层析原理。早在1998 年Young 等[6］将TP47、TP17、TP15 这3 种重组抗原联合起来设计出梅毒螺旋体抗体快速诊断试剂盒。Mabey 等在评价4 种不同国家生产的GICA 试剂盒时发现其特异度均超过95.00%[7］。邹冬梅等[8］采用GICA 对幼儿园从岗人员梅毒检测时发现GICA 的灵敏度可达100.00%、特异度为96.40%。陈邦锐等[9］也指出GICA 的梅毒检出率高达91.40%，建议献血前加做GICA 初筛来降低血液报废。周振兴等[10］也发现了GICA 的灵敏度和特异度均大于ELISA，这与本次研究结果一致。但刘学政[11］在比较ELISA 与GICA 两种方法时，发现GICA 的灵敏度（89.39%）、阴性预测值（74.07%）低于ELISA；而GICA 的特异度（90.91%）和阳性预测值（96.72%）与ELISA 的差异无统计学意义。这可能与他选择的ELISA 试剂品牌与本文使用的品牌不一致有关。即使包被抗原相同，但各厂家在各种抗原的配比和工艺上会有差异，在检测结果上也会有差异，主要体现在低值阳性标本上[12］。

LICA 由TP47、TP17、TP15 抗原分别包被的发光微粒、生物素标记TP47、TP17、TP15 抗原，在均相条件下，采用双抗原夹心免疫光激化学发光法和免洗免分离技术检测梅毒螺旋体抗体。有研究显示梅毒螺旋体抗体LICA 法的灵敏度可达100.00%，特异度为99.35%[13］。官士珍等[14］在对LICA 法检测梅毒抗体进行性能验证时，发现LICA 与TPPA 的符合率为95.00%。本次试验结果LICA 的灵敏度也可达100.00%，但是特异度只有58.33%，与TPPA 的符合率也只有93.00%。这可能与本次试验中LICA 灰区范围内的假阳性标本数量较多造成统计数据的不同有关。本试验使用的CLIA包被的抗原为TP15、TP17、TP47 重组抗原，采用两步间接化学发光法原理，这与常用于梅毒螺旋体抗体检测的双抗原夹心法不同。这可能也是本试验中CLIA 的敏感度和特异度不如GICA、ELISA、LICA 的重要原因。

同时笔者发现GICA 与TPPA 的一致性和符合率均高与ELISA、LICA、CLIA，且通过交叉示意图可见GICA 无单独阳性的情况出现。GICA 出现的假阳性共3 例，都伴有ELISA 和LICA 同时阳性。可能跟重组抗原与TPPA 的天然抗原不同有关。彭振亚等[15］在鉴别梅毒血清学假阳性实验中提出，重组抗原在复性时形成的差错空间抗原决定簇可能是假阳性反应的原因。按照2023 年《梅毒螺旋体血清学试验生物学假阳性处理专家共识》中指出特异性抗体阳性而非特异性抗体阴性时，采用另一种不同原理的特异性抗体验证：验证特异性抗体阳性即支持梅毒诊断；验证特异性抗体阴性时，需建议1、2、6 周后再次采样复查[16］。本试验中GICA 假阳性样本由于伴有ELISA 和LICA 均阳性，也是需1、2、6 周后再次采样复查才能排除是否梅毒感染的。因再采样属于就诊者自愿再就诊过程，后续结果往往难以随访。在本次研究可见GICA 与ELISA、LICA、CLIA 均有很高的一致性和符合率，同时其操作简单、方便、快捷，GICA 作为复检方法也是一种不错的选择，庞彩云等[17］也选择GICA 作为梅毒螺旋体抗体筛查过程中的复检方法。本文示意图中LICA 和CLIA 均有单试剂阳性的情况，且以CLIA 最多（12 例）。贾敏利等[18］指出CLIA 的阳性率最高且容易出现假阳性，但CLIA 的灵敏度和特异度高于GICA 又与本文结果不同。闫朝春等[19］指出CLIA 法S/CO 值在弱阳性时与TPPA 的符合率最低。贾易萌[20］指出CLIA 检测梅毒抗体的敏感度和特异度比ELISA 高。这些不同之处可能与其选择的试剂厂家与本研究不同有一定的关系。

通过对GICA、ELISA、LICA、CLIA 4 种试剂的ROC曲线曲线下面积比较，发现无统计学差异（P＞0.05）。为了进一步找出GICA 与ELISA、LICA、CLIA 之间的差异所在范围，将后3 种方法进行分区可见，ELISA、LICA和CLIA S/CO 值分别在1.00～12.00、1.00～10.00、1.00～4.00 时的TPPA 符合率明显低于GICA 的TPPA 符合率，存在统计学差异（P＜0.05）。且CLIA S/CO 值为0.80～0.99 时有1 例漏检。若疑似感染者采用GICA 检测为阴性或阳性，而就诊时出现ELISA、LICA 或CLIA 的S/CO 结果在上述范围内，均需要继续采用TPPA 做进一步验证。当ELISA、LICA、CLIA 3 种方法的S/CO 值分别大于12.00、200.00、4.00 时，GICA与TPPA 符合率为100.00%。若疑似感染者采用GICA 检测为阳性，而就诊时出现ELISA、LICA 或CLIA的S/CO 结果在上述范围内，则无需采用TPPA 做进一步验证。当然本试验所得数据和划分S/CO 值只能适用于本试验使用的试剂品牌，并不能单纯以方法学来定义S/CO 值的大小。同时夏德菊等[21］在对梅毒螺旋体抗体快速试剂进行性能评价时发现，国内的GICA 试剂评分差距较大，而且不同批次试剂的也存在一定的误差。本试验未对试剂的不同批号进行实际误差计算，可能也会造成本文中所得S/CO 值和区间会与其他研究者略有不同的原因之一。

综上所述，GICA 的灵敏度、特异度以及与TPPA的一致性和符合率均优于ELISA、LICA、CLIA；差异主要集中在S/CO 为1.00～12.00（ELISA）、1.00～10.00（LICA）、1.00～4.00（CLIA）区间。当ELISA、LICA、CLIA 3 种方法的 S/CO 值分别大于12.00、200.00、4.00 时，GICA 可100%检出梅毒螺旋体抗体。可见在梅毒螺旋体抗体的检测过程中，GICA 既可以作为初筛试验也可以用于ELISA、LICA、CLIA 初筛阳性后的复检试验，为日后患者自行检测模式的实现增加了可行性依据。