真菌发酵银杏叶产纤维素酶效果的比较

刘秋晨 单春乔 刘恩 刘星 雷梓伦 刘艳 庄国宏

摘要 为获得银杏叶饲料纤维素酶高产菌株，对从古银杏土壤中分离出的40株真菌进行发酵试验，结果表明：在供试各类真菌中，曲霉菌产生的纤维素酶分解银杏叶中的纤维素能力最强，其次是青霉，再其次是毛霉和木霉。若用于真菌发酵产纤维素酶的生产中，曲霉和青霉是比较优良的菌种，其中编号为YX201040C的黑曲霉和编号为YX2010216的焦曲霉最为合适。

关键词 真菌；纤维素酶； 酶活力；葡萄糖

中图分类号 S816.7  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2024）03-0187-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.03.045

Comparation of Cellulase Activity from Fungus Fermenting Gingko Leaves

Abstract To obtain fungus that can generate cellulase productively，the fermentation experiment of 40 strains of fungi isolated from ancient ginkgo soil was carried out.According to the experiment，we found that cellulose generated by Aspergillus can degradate the cellulose in ginkgo leaf fastest，Penicillium is in the next place，mucoraceae and trichoderma are in the third place. If we want to apply fungus to generate cellulose， Aspergillus and Penicillium are good selection， among them， Aspergillus niger named YX201040C and Aspergillus ustus named YX2010216 are the best choice.

Key words Fungus;Cellulase;Enzymatic activity;Glucose

银杏又称白果、公孙树，国家二级保护植物，为银杏科银杏属银杏种，属于裸子植物门，为我国独有的树种。在我国，银杏分布范围广，20多个省市（区）都有银杏的自然分布，银杏资源非常丰富［1］。银杏营养丰富，含有淀粉、糖类、蛋白质、脂肪、维生素C、核黄素、胡萝卜素和钙、磷、铁、钾、镁等矿质元素，以及银杏酸、白果酚［2］。银杏叶多皱折，完整者呈扇形，上缘呈不规则的波状弯曲，具二叉状平行叶脉，细而密，光滑无毛，易纵向撕裂，多呈黄绿色或浅棕色［3］。作为药材多用于治疗肺虚咳喘、冠心病、心绞痛等［4］。银杏叶中的主要活性成分有黄酮、萜内酯、花青素和多糖等，且以黄酮为主。

银杏黄酮不仅对机体的免疫细胞、体液及非特异性免疫功能有影响，而且还能增强机体的免疫器官功能［5］。黄酮类化合物中抗菌成分较多，对多种细菌有广泛的抗菌谱。研究表明，黄酮对鸡白痢沙门氏菌、猪霍乱沙门氏杆菌、大肠杆菌等均有抑制效果，并且其对金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌的效果好于红霉素［6］。黄酮通过影响体内促性腺激素释放激素（GnRH）、黄体生成素（LH）、阿片肽受体等与生殖相关的激素，提高动物的生殖能力。禽类产蛋高峰期及其后期添加适量黄酮可提高产蛋率，可能与血液中T3、T4水平增高有关［7］。大量研究表明，黄酮还可通过作用于动物的下丘脑—垂体—靶器官生长调节轴，发挥促进动物生长的作用［8］。银杏叶提取物可明显抑制丙二醛（MDA）生成和红细胞溶血作用，并且在清除自由基方面，银杏叶提取物效率比维生素E还要高，能防止高脂肪的细胞膜被氧化［9］。研究表明，在肉仔鸡中添加0.06%～0.12%的银杏叶提取物，能显著或极显著降低血清甘油三酯，并有提高高密度脂蛋白含量，降低血清胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇含量的趋势［10］。说明银杏叶提取物在提高机体对脂肪代谢能力方面有较明显的效果。

银杏叶具有多种保健功能，但银杏叶的主要组分是木质纤维素，这部分物质的存在，大大降低了动物对功能物质的吸收利用［11］。 对木质纤维素有较強降解能力的多为丝状真菌，如瑞氏木霉（Trichoderma reesei） 的纤维素酶能有效地将纤维素转化为葡萄糖； 康氏木霉 （T.koningii）、拟康氏木霉 （T.pseudokoningii） 和绿色木霉 （T.viride） 等也都具有很强的纤维素降解能力。

为获得银杏叶饲料纤维素酶高产菌株，对从古银杏土壤中分离出的40株真菌进行发酵试验，旨在为银杏叶的深加工利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌种：从湖北古银杏森林公园古银杏土壤中分离出真菌，共40株，主要为曲霉菌、青霉菌、木霉、毛霉和少数其他种属菌种。

银杏叶：由邳州银杏研究所提供，为2011年秋季收获，经晾干后粉碎成40目左右的粉末。

1.2 银杏叶固体培养基的制作、接种和培养

称取30 g银杏叶粉末，放入250 mL锥形瓶中，加入一定量的蒸馏水，调节蒸馏水到需要的pH，用玻璃棒搅拌均匀。用无菌培养封口膜封口，放入立式压力蒸汽灭菌锅中，121 ℃灭菌30 min后冷却至室温。采用相同的方法按需要制作培养基若干。在无菌条件下，用接种针挑取培养2 d的菌种菌体，接种到已灭菌的银杏叶培养基中，并尽量混合均匀。将各接种后的培养基置于25 ℃隔水式恒温培养箱中进行培养。

1.3 总纤维素酶活性的测定 参照文献［12］的方法测定。

2 结果与分析

2.1 曲霉菌发酵银杏叶产纤维素酶的效果

曲霉菌是食品和饲料中广泛使用的真菌菌种，尤其是黑曲霉应用最为广泛，安全性好。目前我国允许使用黑曲霉生产饲料酶制剂，世界上一些国家，如美国已把黑曲霉列为动物安全饲料微生物，允许应用于生产饲用微生物饲料。笔者将从银杏土壤中分离获得的真菌用于银杏叶的发酵，以期具有更好的适应性，获得更好的生长和产酶能力。使用从土壤中分离得到的曲霉菌对银杏叶进行发酵，曲霉的产酶能力见表1。

由表1可知， 参与试验的曲霉产生的纤维素酶活力在0.469～1.881 U/g，其中大部分集中在1.000～1.881 U/g，僅有个别品种产生的纤维素酶的活性低于对照组。

对照组中纤维素酶的活力为0.599 U/g左右，根据这个对照值可以看到，在曲霉属中，编号为YX201040C的黑曲霉产生的纤维素酶的活性最强，达到了1.881 U/g；其次是编号为YX2010236的黑曲霉，它产生的纤维素酶活力是1.802 U/g；这2个品种曲霉产生的纤维素酶的活性较强，均为对照组中酶活性的3倍以上。

花斑曲霉产生的纤维素酶活力为1.404 U/g左右，焦曲霉产生的纤维素酶活力为1.517 U/g左右，仅次于编号为YX2010236的黑曲霉。

综上所述，曲霉属中，除了编号为YX2010027的黑曲霉、棒曲霉以及采色曲霉产生的纤维素酶活力低于对照组外，其余曲霉产生的纤维素酶活性均高于对照组，而且都在1.000～1.881 U/g。

虽然该试验中曲霉产生的纤维素酶活力最高也达到了1.881 U/g左右，但相对于现有文献所测得的曲霉产生的酶类450 U/g 左右的活力［13］还是较低的，这可能是由于测定和计算方法不同所致。

2.2 青霉菌发酵银杏叶产纤维素酶的效果 用从土壤中分离出的14株青霉属菌种对银杏叶进行发酵，考察青霉菌株产生的纤维素酶活力，结果如表2所示。

由表2可知，在青霉中，各品种产生的纤维素酶活性在0.300～1.458 U/g。小刺青霉和编号为YX2010324的青霉产生的纤维素酶活力远低于对照组，均在0.300 U/g左右，其余的青霉品种产生的纤维素酶活力均高于对照组。编号为YX2010201的青霉和编号为YX2010310的爪哇正青霉产生的纤维素酶活力是青霉属中最高的，均在1.400～1.500 U/g；仅次于这2种青霉的是编号为YX2010227的紫青霉，其产生的纤维素酶活力为1.336 U/g；剩下的青霉品种产生的纤维素酶活力主要在0.600～1.200 U/g。总体而言，青霉产生的纤维素酶的活力比曲霉产生的纤维素酶活力要低，而且各品种间的差异也比曲霉大。因此，曲霉比青霉更适合发酵生产纤维素酶，其产生的纤维素酶活性也相对较大。

2.3 毛霉菌和木霉菌发酵银杏叶产纤维素酶的效果

用从土壤中分离出的毛霉属和木霉属菌株对银杏叶进行发酵，考察毛霉和木霉属菌株产生的纤维素酶活力，结果如表3所示。

由表3可知，毛霉菌产生的纤维素酶的活性均高于对照组，编号为YX2010050的多分枝毛霉菌产生的纤维素酶活性为0.995 U/g，编号为YX2010305的多分枝毛霉菌产生的纤维素酶活性为0.638 U/g。可见，编号为YX2010050的多分枝毛霉菌产生的纤维素酶活性比编号为YX2010305的多分枝毛霉菌要高出0.300 U/g。木霉菌产生的纤维素酶活性也都高于对照组，均在0.600～1.700 U/g，品种之间的差距偏大。其中，木霉产生的纤维素酶活性最大，达到了1.620 U/g；其次是康氏木霉和哈茨木霉，它们产生的纤维素酶活性分别为1.308和1.238 U/g 。李氏木霉和绿色木霉产生的纤维素酶活性均高于对照组，但是都低于1.000 U/g。其中，李氏木霉产生的纤维素酶活性为0.906 U/g ，绿色木霉产生的纤维素酶活性为0.744 U/g。

综上所述，木霉产生的纤维素酶活性最高，甚至比所有青霉都高，在进行相关试验和生产时，木霉可以作为除一些曲霉以外的选择。

根据相关文献，金属离子是许多菌种生长和繁殖过程中必不可少的物质，尤其对毛霉而言［14］，在该试验中，毛霉产生的纤维素酶活性虽然都高于对照组，但都未超过1.000 U/g，应该是存在一些因素影响了毛霉产纤维素酶活性。

2.4 其他真菌发酵银杏叶产纤维素酶的效果

用从土壤中分离出的少量其他种属菌株对银杏叶进行发酵，考察它们产生的纤维素酶活性，结果如表4所示。

由表4可知，供试菌种产生的纤维素酶活性均高于对照组，主要集中在0.700～1.600 U/g。其中，编号为YX2010048的镰刀霉产纤维酶的活性最高，达到了1.561 U/g ，高于大部分菌种；其次是弗基克罗（氏）赤霉，其产生的纤维素酶活性达到了1.411 U/g；链格孢菌产生的纤维素酶活性相对较低，只有0.728 U/g；其余菌种产生的纤维素酶活性大多集中在0.900～1.200 U/g，这与大部分菌种都很相似。

3 结论

供试菌种中，曲霉属中除了编号YX2010027的黑曲霉外，其他黑曲霉产生的纤维素酶的活性相对较高，均在1.000 U/g以上，有些甚至在1.800 U/g以上；其余曲霉中，花斑曲霉和焦曲霉产生的纤维素酶活性与大部分黑曲霉产生的纤维素酶活性相当，而泡盛曲霉、棒曲霉、采色曲霉产生的纤维素酶活性均较低，都与对照组相差不多。

在青霉属中，编号为YX2010310的爪哇正青霉、编号为YX2010227的紫青霉以及编号YX2010201的青霉产生的纤维素酶活性较高，其余的青霉品种产生的纤维素酶活性大多低于曲霉产生的纤维素酶活性，其中以小刺青霉产生的纤维素酶活性最低，只有0.300 U/g左右，甚至低于对照组。

在毛霉属和木霉属中，编号为YX2010050的多分枝毛霉菌和李氏木霉产生的纤维素酶的活性均在0.900～1.000 U/g，差距很小；编号为YX2010305的多分枝毛霉菌和绿色木霉产生的纤维素酶的活性则相对较低，均在0.650 U/g左右，只比对照组稍高一些。

综上所述，供试各类真菌中，曲霉菌产生的纤维素酶分解银杏叶中的纤维素能力最强，其次是青霉，再其次是毛霉和木霉。若用于真菌发酵产纤维素酶的生产中，曲霉和青霉是比較优良的菌种，其中编号为YX201040C的黑曲霉和编号为YX2010216的焦曲霉最为合适。

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