薯蓣皂苷元对人骨肉瘤细胞自噬的影响

聂 超，黄华明，侯保权，周 杰，张 蕾*

（1.江苏卫生健康职业学院，江苏 南京 211800； 2.无锡市锡山人民医院，江苏 无锡 214015； 3.南京帝玛生物技术有限公司，江苏 南京 210033）

骨肉瘤是起源于骨骼的恶性肿瘤，患者大多为青少年，恶性程度高，预后差［1］，这为患者及其家庭带来极大的精神伤害，也为社会乃至国家带来沉重的经济负担。骨肉瘤的发生、发展与细胞生长有关，目前临床化疗是治疗手段之一，但由于缺乏理想效果、耐药性频繁出现、毒副作用较强等问题［2］，在临床上颇受争议。因此，从天然产物中提取高效、低毒的活性成分进行替代成为当前新的趋势。

薯蓣皂苷元是从薯蓣科植物穿龙薯蓣根中分离出的一种植物甾体化合物，也是合成甾体激素类药物的重要原料，具有抗肿瘤、抗糖尿病、降血脂、抗免疫逃逸等作用［3-6］，但关于诱导骨肉瘤的自噬未见报道，而且分子作用机制不明。本实验旨在对薯蓣皂苷元诱导骨肉瘤产生自噬进行探讨，并阐明其作用机制。

1 材料

1.1 细胞株 人骨肉瘤MG63、U2OS 细胞均购自美国ATCC 库，分别用90% MEM＋10% FBS、90%DMEM＋10% FBS 完全培养基，在37 ℃、5% CO2条件下培养，每2 d 更新1 次培养液，取对数生长期者进行实验。

1.2 试剂与药物 薯蓣皂苷元（成都曼思特生物科技有限公司，货号A0124，纯度≥98%）。TRIzol（美国Invitrogen 公司，货号15596-026）； cDNA 第一链合成试剂盒、Taq DNA Polymerase （美国Thermo Fisher Scientific 公 司，货 号 K1622、EP0405）； LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PI3K、Akt、mTOR、pPI3K、p-Akt、p-mTOR、Beclin1、cleaved-caspase3 蛋白抗体、抗体稀释液、GAPDH 内参抗体、Braford 蛋白含量检测试剂盒 （江苏凯基生物技术股份有限公司）。

2 方法

2.1 MTT 法检测细胞增殖 取MG63、U2OS 细胞悬液，调整密度至5.0×104/mL，接种于96 孔细胞培养板中，每孔100 μL，培养24 h，分别加入含40、20、10、5、2.5、1.25 mg/L 薯蓣皂苷元的完全培养基，同时设立阴性对照组，将细胞培养板置于含37 ℃、5% CO2的培养箱中培养24 h，按说明书进行MTT 染色，于490 nm 波长处测定光密度（OD），计算细胞增殖抑制率及药物IC50。

2.2 透射电镜检测细胞自噬情况 取MG63、U2OS 细胞悬液，调整密度至5.0×105/mL，加入含薯蓣皂苷元的培养基 （MG63，0、16 mg/L；U2OS，0、8 mg/L） 共同培养24 h，0.25%胰蛋白酶消化细胞，制成单细胞悬液，1 000 r/min 离心10 min，弃上清后PBS 洗涤2 次，加入2.5%戊二酸，4 ℃固定90 min，经包埋、切片、柠檬酸铅、醋酸双氧铀染色后观察各组细胞自噬小体。

2.3 免疫荧光观察Beclin1 蛋白表达 取MG63、U2OS 细胞悬液适量，调整密度至5.0×104/mL，加入含薯蓣皂苷元的培养基（MG63，0、16 mg/L；U2OS，0、8 mg/L），培养24 h 后自然晾干并用多聚甲醛固定液浸泡，加入H2O2-甲醇溶液、即用型山羊血清室温孵育20 min，PBS 洗涤3 次，滴加一抗（1 ∶100）、二抗，37 ℃避光孵育1 h，PBS 洗涤3 次，加入DAPI 染液后用防萃灭封片胶封片，在荧光显微镜下观察细胞高表达区域。通过Image-Pro Plus 6.0 软件计算视野面积下的积分光密度（IOD） 值，求得平均光密度，公式为平均光密度＝IOD/视野面积。

2.4 Western blot 法检测细胞LC3、Beclin1、cleavedcaspase3、PI3K、Akt、mTOR 蛋白表达 取MG63、U2OS 细胞悬液适量，调整密度至5.0×105/mL，加入含薯蓣皂苷元的培养基（MG63，0、16 mg/L；U2OS，0、8 mg/L），培养24 h 后采用全蛋白提取试剂盒提取细胞中的总蛋白，BCA 蛋白浓度测定试剂盒进行浓度测定。蛋白样本经10% SDS-PAGE凝胶电泳进行分离，通过Bio-Rad 半干转印系统进行转膜，所得PVDF 膜用5% 脱脂奶粉封闭过夜，加入一抗（1 ∶200） 孵育过夜，次日室温孵育二抗（1 ∶4 000） 1 h，ECL 试剂显色，凝胶成像仪和Gel-Pro32 软件采集图像，对条带进行灰度分析。

2.5 RT-qPCR 法检测细胞Beclin1、caspase3 mRNA表达 取MG63、U2OS 细胞悬液适量，调整密度至5.0×105/mL，加入含薯蓣皂苷元的培养基（MG63，0、16 mg/L； U2OS，0、8 mg/L），培养24 h 后收集细胞，TRIzol 法提取总RNA，测定纯度后反转录为cDNA，荧光染色法和荧光定量PCR仪进行实时定量PCR 反应，扩增条件为95 ℃预变性3 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火/延伸20 s，72 ℃变性35 s，共循环45 次。扩增产物特异性通过熔解曲线监测，以GAPDH为内参，2-ΔΔCT法分析基因相对表达量，所用引物由金斯瑞生物科技股份有限公司合成，序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.6 统计学分析 通过SPSS 16.0 软件进行处理，数据以（±s） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，2 组间比较采用t检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 薯蓣皂苷元对骨肉瘤细胞增殖的影响 如图1 所示，不同质量浓度 （40、20、10、5、2.5、1.25 mg/L） 薯蓣皂苷元对骨肉瘤MG3、U2OS 细胞均有抑制作用，并呈剂量依赖性。薯蓣皂苷元对MG63 细胞作用24 h 的IC50值为15.7 mg/L，U2OS细胞的IC50值为8.3 mg/L，故后续实验选取薯蓣皂苷元16 mg/L 作用于MG63 细胞，8 mg/L 作用于U2OS 细胞。

图1 薯蓣皂苷元对骨肉瘤细胞增殖的影响（±s，n＝5）Fig.1 Effects of diosgenin on the proliferation of osteosarcoma cells （±s，n＝5）

3.2 薯蓣皂苷元对骨肉瘤细胞超微结构形态变化的影响 如图2 所示，对照组骨肉瘤MG3、U2OS细胞可见正常细胞核和大量线粒体； 薯蓣皂苷元处理后，MG3、U2OS 细胞损伤明显，细胞破碎，线粒体消失，出现包裹着线粒体的自噬体。

图2 薯蓣皂苷元对骨肉瘤细胞超微结构形态变化的影响Fig.2 Effects of diosgenin on ultrastructural changes of osteosarcoma cells

3.3 薯蓣皂苷元对骨肉瘤细胞Beclin1 蛋白表达的影响 如图3 所示，对照组骨肉瘤MG3、U2OS 细胞Beclin1 蛋白荧光表达较低； 与对照组比较，薯蓣皂苷元干预后MG3、U2OS 细胞Beclin1 蛋白荧光表达增强（P＜0.05，P＜0.01）。

图3 薯蓣皂苷元对骨肉瘤细胞Beclin1 蛋白表达的影响（±s，n＝3）Fig.3 Effects of diosgenin on expression of Beclin1 protein in osteosarcoma cells （±s，n＝3）

3.4 薯蓣皂苷元对骨肉瘤细胞LC3、Beclin1 蛋白表达的影响 如图4 所示，与对照组比较，薯蓣皂苷元干预后骨肉瘤MG3、U2OS 细胞LC3 Ⅰ蛋白表达降低（P＜0.01），LC3 Ⅱ、Beclin1 蛋白表达升高（P＜0.01）。

图4 薯蓣皂苷元对骨肉瘤细胞LC3、Beclin1 蛋白表达的影响（±s，n＝3）Fig.4 Effects of diosgenin on protein expressions of LC3 and Beclin1 in osteosarcoma cells （±s，n＝3）

3.5 薯蓣皂苷元对骨肉瘤细胞PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白表达的影响 如图5 所示，与对照组比较，薯蓣皂苷元干预后骨肉瘤MG3、U2OS 细胞PI3K、Akt、mTOR 蛋白表达无明显变化 （P＞0.05），p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表达降低（P＜0.05，P＜0.01）。

图5 薯蓣皂苷元对骨肉瘤细胞PI3K/Akt/mTOR 通路相关蛋白表达的影响（±s，n＝3）Fig.5 Effects of diosgenin on expressions of PI3K/Akt/mTOR pathway-related proteins in osteosarcoma cells （±s，n＝3）

3.6 PI3K 通路抑制剂LY294002 对薯蓣皂苷元干预骨肉瘤细胞Beclin1 mRNA 表达的影响 如图6所示，与对照组比较，骨肉瘤MG3、U2OS 细胞薯蓣皂苷元组Beclin1 mRNA 表达升高（P＜0.01）；与薯蓣皂苷元组比较，薯蓣皂苷元＋LY294002 组Beclin1 mRNA 表达降低（P＜0.01）。

图6 LY294002 对薯蓣皂苷元干预骨肉瘤细胞Beclin1 mRNA 表达的影响（±s，n＝3）Fig.6 Effects of LY294002 on expression of Beclin1 mRNA in osteosarcoma cells pretreated by diosgenin （±s，n＝3）

3.7 自噬抑制剂3MA 对薯蓣皂苷元干预骨肉瘤细胞增殖的影响 如图7 所示，与3MA 组比较，骨肉瘤MG3、U2OS 细胞薯蓣皂苷元组增殖抑制率升高（P＜0.01）； 与薯蓣皂苷元组比较，MG3、U2OS细胞薯蓣皂苷元＋3MA 组增殖抑制率降低 （P＜0.01）。

图7 3MA 对薯蓣皂苷元干预骨肉瘤细胞增殖的影响（±s，n＝5）Fig.7 Effects of 3MA on proliferation of osteosarcoma cells pretreated by diosgenin （±s，n＝5）

3.8 自噬抑制剂3MA 对薯蓣皂苷元干预骨肉瘤细胞caspase3 mRNA、蛋白表达的影响 如图8～9 所示，与对照组比较，骨肉瘤MG3、U2OS 细胞薯蓣皂苷元组caspase3 mRNA 表达和cleaved-caspase3 蛋白表达升高（P＜0.01）； 与薯蓣皂苷元组比较，MG3、U2OS 细胞薯蓣皂苷元＋3MA 组caspase3 mRNA 表达和cleaved-caspase3 蛋白表达降低（P＜0.01）。

图8 3MA 对薯蓣皂苷元干预骨肉瘤细胞caspase3 mRNA表达的影响（±s，n＝3）Fig.8 Effects of 3MA on caspase3 mRNA expression in osteosarcoma cells pretreated by diosgenin （±s，n＝3）

图9 3MA 对薯蓣皂苷元干预骨肉瘤细胞caspase3 蛋白表达的影响（±s，n＝3）Fig.9 Effects of 3MA on caspase3 protein expression in osteosarcoma cells pretreated by diosgenin （±s，n＝3）

4 讨论

本研究通过MTT 实验，计算出24 h 薯蓣皂苷元对MG63 细胞IC50为15.7 mg/L，U2OS 细胞IC50为8.3 mg/L，结果显示薯蓣皂苷元对2 种骨肉瘤细胞均有抑制作用，呈剂量依赖性。

自噬是另一种有别于凋亡的细胞死亡方式，指在真核细胞中由双层膜包裹部分胞质以及细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体［7］。通过透射电镜实验发现，薯蓣皂苷元干预后，2 种骨肉瘤细胞中的自噬体均开始增多，初步证明薯蓣皂苷元可以诱导2 种骨肉瘤细胞产生自噬。

Beclin1 是Atg6 的同源基因，Beclin1 表达与多种恶性肿瘤细胞发生自噬呈正相关。微管相关蛋白轻链3 （LC3） 是自噬体中酵母Atg8 的同源基因，LC3 被刺激后可产生胞浆LC3I，经过类泛素化修饰最终形成LC3Ⅱ［8］。LC3Ⅱ表达量与自噬泡的数量呈正相关性，LC3Ⅱ增加可启动自噬发生［9］。本实验结果显示，经薯蓣皂苷元干预后，2 种骨肉瘤细胞Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达升高，LC3I 蛋白表达降低，证明薯蓣皂苷元能够诱导骨肉瘤细胞产生自噬。

众多信号通路参与自噬的调节，其中PI3K/Akt/mTOR 信号通路被认为是负性调控自噬启动的经典通路［10］。PI3K 被激活后，激活下游蛋白Akt，活化的Akt 通过激活其下游蛋白雷帕霉素的蛋白激酶受体（mTOR），促进细胞生长［11-12］。本实验结果显示，薯蓣皂苷元可以抑制2 种骨肉瘤细胞PI3K、Akt、mTOR 蛋白的磷酸化水平，提示薯蓣皂苷元可以通过PI3K/Akt/mTOR 信号通路激活骨肉瘤细胞的自噬。PI3K/Akt/mTOR 信号通路除了与自噬的生成有关，在肿瘤细胞的生长、凋亡、炎症产生等多方面均能发挥作用［13-15］。本实验通过薯蓣皂苷元和PI3K 通路抑制剂LY294002 联合处理，发现在通路抑制剂的干预下，2 种骨肉瘤细胞Beclin1 mRNA 表达降低，提示PI3K/Akt/mTOR 信号通路可能是薯蓣皂苷元抑制骨肉瘤细胞产生自噬的作用靶点。

近年来研究表明，自噬具有抑制肿瘤的作用，也可保护肿瘤细胞生存［16-17］，当前多种化疗药物就是通过自身产生的保护性自噬作用产生耐药性［18］。本实验通过薯蓣皂苷元和自噬抑制剂3MA联合处理，对细胞增殖抑制、凋亡蛋白caspase3 蛋白表达进行检测，以探究抑制自噬后薯蓣皂苷元对2 种骨肉瘤细胞凋亡的影响［19-20］。结果，在3MA的干预下2 种骨肉瘤细胞增殖抑制率降低，caspase3 mRNA 表达和cleaved-caspase3 蛋白表达均降低，提示薯蓣皂苷元诱导骨肉瘤细胞产生的自噬可抑制肿瘤细胞活性。

综上所述，薯蓣皂苷元能抑制骨肉瘤细胞的增殖，诱导细胞产生自噬，可能与激活PI3K/Akt/mTOR 信号通路以及上调LC3 Ⅱ和Beclin1 蛋白表达有关，同时其诱导的自噬可以促使骨肉瘤细胞死亡，诱导自噬性凋亡。