大疱性类天疱疮与血管性痴呆的关系及抗体表达分析

刘桂丽, 房硕, 李丙南, 赵子申, 秦兰英, 刘朋, 赵园莹

沧州市人民医院 1皮肤科, 2神经内科(河北沧州 061000)

大疱性类天疱疮(bullous pemphigoid,BP)属于自身免疫性皮肤疾病,常见于老年人,目前临床上对于此类疾病仅有免疫抑制或免疫调节疗法,通常患者需要较长时间使用上述药物,导致病程较长,且疾病期间临床表现较重,极易由于感染等并发症导致死亡[1-2]。得益于基因研究的普及,临床研究发现皮肤组织细胞中表达的跨膜半桥粒蛋白(transmembrane hemidesmosome,BP180),可以作为BP致病性抗体识别的主要靶抗原,在明确诊断、疾病严重程度及疗效方面具有较好的效果[3]。而通过基因组学对BP180进行探讨后发现,该蛋白还在神经细胞中高度敏感,故国外有研究发现BP180与部分神经系统疾病有直接关系,故进一步引申出是否皮肤细胞组织内BP180异常表达会导致神经系统疾病的发生的探讨[4-5]。而本研究在既往研究的基础上,以临床较常见且已经被证实与BP180具有相关性的血管性痴呆(vascular dementia,VD)及BP患者作为对象,对其血清内BP180情况进行探讨,旨在进一步明确两种疾病之间的关系,为完善临床治疗方案提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2021年1月至2023年1月于我科就诊的BP患者、同时间段于我院就诊的VD患者及我院体检中心明确为健康或疾病控制稳定人群作为研究对象,分别纳入BP组、VD组及对照组。

纳入标准:(1)BP组患者符合《大疱性类天疱疮诊断和治疗的专家建议》中对于BP的诊断标准[6];(2)VD组患者符合文献[7]中对于VD的诊断标准;(3)年龄在18周岁以上;(4)所有患者及家属均知情同意。

排除标准:(1)BP组患者合并有神经系统类疾病;(2)VD组患者合并有皮肤类疾病;(3)合并有自身免疫系统类疾病;(4)半年内糖皮质激素、免疫调节药物及细胞毒类药物使用史;(5)严重的肝肾功能不全;(6)合并恶性肿瘤疾病;(7)1年内严重外伤史及手术史。

符合上述条件后共计纳入BP组63例,VD组83例,对照组90例。本研究经我院伦理委员会审查批准同意后实施(批准号:K-2020284)。

1.2 BP180检测方法 上海臻科生物科技有限公司生产的人抗BP180抗体ELISA检测试剂盒对血清中BP180含量及滴度进行检测;具体如下:抽取患者空腹静脉血5 mL后加入EDTA作为抗凝剂,混合10～20 min后,使用离心20 min(2 000～3 000 r/min),并收集上清液作为待测样本。试剂盒室温状态平衡20 min后设置标准品孔、空白孔及样本孔;标准品孔各加标准品50 μL,样本孔中加入待测样本50 μL,空白孔加入缓冲液;而后分别于标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100 μL,并密封所有反应孔,并置于37℃恒温箱温育60 min。弃去孔内液体,并使用吸水纸拍干后于每孔加350 μL洗涤液,静置1 min后甩去洗涤液,再次使用吸水纸上拍干,共计重复5次。完成上述操作后每孔加入底物A、B各50 μL,37℃避光孵育15 min。每孔加入终止液50 μL,15 min内,使用赛默飞世尔公司提供的NanoDrop ONE型分光光度计在450 nm波长处测定各孔的OD值,并根据OD值按照试剂盒标准计算样本孔BP180阳性率及浓度。

1.3 观察指标

1.3.1 一般资料 包括:年龄、性别、体质指数(BMI)、文化程度、吸烟史、基础疾病。

1.3.2 实验室检查资料 包括:白细胞(WBC)、嗜酸性粒细胞计数(EOS)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总胆红素(TBiL)、血肌酐(Cr)、白蛋白、血压、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、空腹血糖(FGB)、D-D二聚体、同型半胱氨酸(Hcy)、BP180阳性率及浓度。

1.4 统计学方法 数据处理采用SPSS 25.0软件。计数资料以例(%)表示,组间比较采用2检验;计量资料以表示,组内比较采用配对t检验,三组间比较采用方差分析,两两组间比较采用LSD-t检验。倾向性评分匹配(PSM)过程利用PSM扩展程序进行:以是否分组情况为因变量,各协变量为自变量,通过logistics回归分析估计倾向性评分值,采用1∶1临近匹配法进行匹配,通过卡钳值为0.02保证匹配结果的优良性,然后比较组间协变量的标准差异在匹配前后的改变,匹配后的标准差异越接近于0,匹配结果越满意,当标准差异绝对值<0.1时,认为组间变量的均衡性较好;最后使用多分类logistic回归分析三组之间的关系;P<0.05时为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 三组样本匹配前一般资料比较 匹配前三组患者在年龄、BMI及吸烟史占比指标比较,差异具有统计学意义(P<0.05),其余指标比较差异均不具有统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 三组样本匹配前一般资料比较 例

2.2 三组样本匹配后一般资料比较 三组患者经过倾向性评分匹配后每组共55例患者配对成功,在两组间的协变量经匹配后均达到平衡,经PSM各协变量的均衡性得到了明显提高(P>0.05),且匹配后样本量经过计算后符合正态分布(P>0.05)。见表2。

表2 三组样本匹配后一般资料比较 例

2.3 三组样本匹配后实验室检查资料比较 BP组患者EOS及BP180抗体阳性率及浓度高于其他两组,白蛋白低于其他两组(P<0.05);而VD组BP180抗体阳性率及浓度高于对照组(P<0.05),VD组和对照组EOS及白蛋白比较差异无统计学意义(P>0.05)。VD组患者TG、TC、D-D二聚体及Hcy高于其他两组(P<0.05);BP组患者D-D二聚体及Hcy高于对照组(P<0.05),但BP组及对照组TG、TC比较差异无统计学意义(P>0.05)。BP组及VD组患者BP180抗体阳性率均高于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 三组样本匹配后实验室检查资料比较

2.4 影响VD及BP的危险因素分析 以分组为因变量,以单因素分析P<0.05的指标作为自变量进行无序多分类logistic回归分析,结果显示: D-D二聚体、Hcy、BP180抗体浓度及BP180抗体阳性是影响VD的独立危险因素(P<0.05);BP180抗体浓度及BP180抗体阳性是影响BP的独立危险因素(P<0.05),见表4。

3 讨论

BP早期临床特征主要以躯体局部红斑或表皮下水疱为首发症状,由于症状较普通,故通常会被当作湿疹等其他皮肤疾病治疗,从而导致病情进展,且后期疾病发展速度较快,极易诱发局部感染、低蛋白血症、电解质紊乱等并发症导致患者死亡[8-9]。有流行病学研究表明,罹患神经系统及神经退行性疾病患者,如脑血管病、多发性硬化症和阿尔茨海默病发生BP的概率大于普通人群,我们可以认为,这些神经系统疾病的存在增加了个体患BP的风险,故二者之间可能存在一定的联系[10]。

在本研究中,BP患者EOS明显高于其他两组,因为EOS作为固有免疫细胞,在真表皮交界处有大量分布,其在维持宿主防御功能及机体免疫稳态方面存在显著作用[11-12]。EOS浸润是BP突出病理特征,当BP患者真皮下EOS被激活后发生脱颗粒改变,进而黏附在基底膜角质形成细胞上并破坏基底角质形成细胞导致真皮-表皮分离,此为BP患者发生大疱的主要病理机制[13]。临床研究提示,在BP患者外周血、皮损中均可见EOS升高,本研究结果与之类似[14]。而白蛋白低于其他两组则主要是由于大疱处大量组织液渗出,其中蛋白是渗出液的主要成分,故会导致机体白蛋白含量下降,从而诱发低蛋白血症[15]。而VD与对照组患者由于排除了感染、寄生虫等疾病,故二组上述两指标比较并无显著差异。VD组患者TG、TC、Hcy、D-D二聚体均高于其他两组,在Gui 等[16]的研究中,TC与TG浓度与VD的发病有着显著的相关性。而Hcy作为蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中产生的重要中间产物,在血管壁细胞由于损伤等因素的影响会导致Hcy浓度升高,此项也是VD发病重要产物[17-18]。值得注意的是,此项在BP患者中浓度亦明显高于对照组,说明BP患者在发生局部皮肤组织改变的同时,可能由于全身免疫反应导致血管壁细胞代谢状态改变,故而此项可能与BP患者发生血管神经类疾病明显相关,但由于BP主要病理改变并未集中于循环系统,故BP患者此项低于VD组。D-D二聚体是纤溶酶溶解的交联纤维蛋白凝块,有研究指出,VD由于血管内皮状态变化会导致D-D二聚体升高[19-20]。但在本研究中,BP患者D-D二聚体也明显高于对照组,分析原因可能是由于BP患者炎性反应加剧,导致大量细胞因子释放并进入血液,继而诱发纤维蛋白溶酶、组织纤溶酶原激活物的过度表达,最终导致纤溶系统亢进,而D-D二聚体是反应机体纤溶系统功能的重要标志物,故其含量会显著升高。通过以上叙述不难看出,血管改变是BP患者全身并发症之一,并非其主要病理改变,故BP患者此项指标低于VD患者,但再次说明此两种疾病之间关系密切。

通过对各项指标进行logistic回归分析结果提示,BP组及VD组患者BP180抗体浓度及BP180抗体阳性为共同危险因素,而将D-D二聚体及Hcy排除BP的独立影响因素,由此我们不难看出,相较于血管改变,BP180抗体表达情况作为VD及BP的相似点更为可靠。在 BP 患者中存在有HLA-DQB1过表达,从而可能会增加 T 细胞对 BP180 的亲和力,进而导致T细胞异常分化为Th17,最终导致神经系统炎症的发生[21]。但有研究结果提示了相反的方向,T细胞分化为Th17后也会进行凋亡细胞清除,并承担对病毒等抗原的呈递作用,故而会导致此细胞的消耗,并不一定会通过负反馈导致BP180表达的升高。因此,在体内发现的抗BP180自身抗体水平的升高可能仅仅反映了细胞损伤增加及蛋白水解过程的改变,以及对自身反应性淋巴细胞的抗原呈递,并不能说明BP180是否可能通过表位扩散参与到VD的病理过程中[22-23]。通过以上分析我们不难看出,既往研究通过BP180构成的关系解释BP和VD之间的关系尚存在争议。但是通过本研究结果,再次证明了BP180浓度升高时VD与BP患者之间联系的重要因素。近期最新研究结果显示血浆中BP180高表达可能引起神经变性或神经炎症,导致血脑屏障的破坏,BP180穿过血脑屏障后主要作用于皮层和海马神经节层的锥体细胞中,引起皮肤和脑自身抗原之间的交叉反应性免疫反应,进而导致中枢神经系统微循环长期处于高炎性反应状态,从而诱发局部血管痉挛、闭塞等反应诱发局部缺血的产生[4]。既往研究指出,VD可能是由于反复发作的局部缺血性疾病导致神经功能受损所诱发,结合之前的叙述,在BP180高表达状态下,中枢神经系统可能发生反复缺血的可能性,此项也是导致VD的基础病理改变之一[24-25]。通过以上结果不难发现,BP所导致的BP180升高有导致VD发生的病理基础,故BP180在BP及VD的发生中扮演着重要的角色。

本研究为单中心小样本量研究,结果可能存在偏倚;同时对于BP180在VD及BP患者中的作用机制是建立于既往研究基础之上进行解释,说服力欠佳,故以后会针对上述不足进一步加强基础研究,进一步完善具体BP180在上述两病中的作用机制。但这并不影响通过本研究得出BP180在BP及VD患者中表达变化类似,且可能是两种疾病相互影响的关键因素的结论。

利益相关声明:本文所有作者均声明不存在相关利益冲突。

作者贡献说明:刘桂丽、房硕负责实验总体设计、实验部分操作、数据收集及论文拟稿;李丙南、赵子申、秦兰英负责试验部分操作及数据整理分析;刘朋负责实验方法设计及论文内容润色、修改;赵园莹协助实验准备及进行。