血液病患者产生抗HLA 抗体的危险因素分析

季开 王澜 陈璐瑶 鲍晓晶 袁晓妮 吴小津 何军

(苏州大学附属第一医院1.血液科，2.江苏省血液研究所HLA 配型实验室，江苏 苏州 215031)

抗HLA 抗体是人体通过妊娠、输血、移植等途径发生同种异体免疫反应而产生的针对HLA 抗原的抗体[1]，其中针对供者HLA 抗原的抗HLA 抗体称为抗供者特异性抗体(donor specific antibodies，DSA)。 目前异基因造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)技术日趋成熟，但移植前患者存在抗HLA 抗体是影响移植预后的因素之一，很大程度上影响着移植的过程与结局。 国内外多个移植中心的研究均表明，移植前患者体内预存的抗HLA 抗体，特别是DSA 会导致移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)、移植物植入延迟甚至植入失败(graft failure，GF)等不良事件的发生，直接影响血液病患者的移植效果[2-15]。 由于HLA 等位基因频率在不同民族和地域的人群中存在差异，所编码的HLA 抗原具有高度多态性和个体差异性，导致免疫产生的抗HLA 抗体呈现多样化。 本文通过单中心回顾性研究分析了影响血液疾病患者抗HLA 抗体产生的危险因素，可为临床工作者识别高危因素的患者提供参考，从而对高滴度抗HLA 抗体或者DSA 采取治疗措施尽早进行抗体清除，以降低移植的风险和提高移植获益。

1 资料与方法

1.1 研究对象

以2016 年1 月1 日—2018 年12 月31 日期间在本院拟进行HSCT 并且在本院HLA 配型实验室内进行抗HLA 抗体检测的1 008 名血液病患者作为研究对象，标本均为患者移植前获取，收集其抗体检测结果及临床资料。

1.2 抗HLA 抗体检测及结果判断

在流式液相芯片(Luminex)[16]技术平台进行抗HLA 抗体检测，首先采用混合抗体检测法(mixed antigen screen beads，MIX)进行抗HLA-Ⅰ类、抗HLA-Ⅱ类抗体初筛检测，若检测结果存在疑问，则补充进行抗体特异性检测(single antigen beads，SAB)，以明确抗HLA 抗体的阳性情况和类型。 MIX 检测采用美国One Lambda 公司生产的抗HLA 抗体检测试剂盒(LSM12，LAB Screen Mixed，Lot021)，SAB 检测采用美国One Lambda 公司生产的LAB Screen＠Single Antigen HLA Class I(LS1 A04)和LAB Sereen＠Single Antigen HLA Class 11(LS2A01)。 试剂厂家提供的说明书没有判断抗HLA 抗体的阳性和阴性值，实验室可自行建立。

本实验室制定抗HLA 抗体阳性和阴性判定标准的方法如下:分析2012-2019 年间实验室参加美国组织相容性和免疫遗传学会(American Society for Histocompatibility and Immunogenetics，ASHI)组织的抗HLA 抗体国际间能力验证项目，实验室和同期国际多中心所上报全部抗体的平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)值及对该抗体判断其阳性和/或阴性符合率，以不同的抗HLA 抗体符合率将MFI 值由高到低分成可能饱和度值、阳性决定值、阳性判定界限值、可疑阳性参考值及可疑阴性参考值5 个区间，建立本实验室的抗HLA 抗体判定界限值。 根据本实验室发表文章的结果，抗HLA 混合抗体检测试剂1 ～17 号微珠的MFI 值为26.86 ～21 925.58，NBG 比值为0 ～434.65。 按照包被抗原对应单抗原试剂的阳性检出率，将各混合试剂微珠的MFI 值及NBG 比值分段为阳性区间、可疑阳性区间、可疑阴性区间、阴性区间。 当某区段90% 以上单抗原试剂检测抗体MFI 值达到5 000、8 000 或10 000 时，各混合试剂微珠在该区段的最低MFI 值分别设定为强阳性、强强阳性、强强强阳性界限值(详见参考文献18:表1、表2)[17-18]。 由本实验室制定的这一判定抗HLA 抗体阳性和阴性的判断标准，既反映了本实验室针对抗HLA-Ⅰ类抗体、抗HLA-Ⅱ类抗体特异性检测结果的判定情况，同时也借鉴了国际间中心的抗体检测情况，并征求了临床医生的意见和建议，具有一定应用和推广价值。

1.3 研究因素

1)疾病确诊至抗体检测采样时间:患者从确诊之日起(包括在本院或在外院确诊)，到在本院进行抗体检测采样之日为止，期间所经历的时间，以“天”(d)为单位。 2)初诊白细胞(WBC)、血红蛋白(Hb)及血小板(PLT)计数:指患者因本病初次就诊时的WBC、Hb 和PLT 计数(包括在本院或外院就诊)。 3)既往史、感染史、妊娠史:患者初次在本院进行抗体检测采样前的相应病史，以“有”和“无”进行统计。 4)入院前输血史:指患者来本院就诊前的输血情况，以“有”和“无”进行统计。 5)入院后输血史:指患者自在本院就诊之日起，到进行抗体检测的采样之日止，在此期间的输血情况，以“有”和“无”进行统计。 6)红细胞(RBC)、PLT、血浆(FP)的输注总量、输注次数:均指患者来本院就诊后至抗体检测采样前的详细输血情况。

1.4 统计学分析

抗HLA 抗体阳性率＝抗HLA 抗体检测阳性人数/总人数。 对影响抗体产生的因素采用IBM 公司SPSS26.0 软件进行统计学分析，单因素分析计数资料的组间比较采用皮尔森卡方(Pearson′s chisquared test)检验；计量资料经检验均符合非正态分布，用受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线筛选出具有诊断价值的因素(曲线下面积＞0.5)，再根据坐标求出最佳截断点，用截断点对应的值将计量资料转换为计数资料进行比较，最终年龄、疾病确诊至抗体检测采样的时间、妊娠次数、入院后至抗体检测采样前RBC 输注总量、RBC 输注次数、PLT 输注总量、PLT 输注次数、FP输注总量、FP 输注次数和输血总次数转换为计数资料进行统计分析。 ROC 曲线中无明确诊断意义的因素，结合临床人为确定相应的截断值或直接作为计量资料纳入研究，最终初诊Hb 和PLT 计数按照输血的临界值(Hb:＜60g/L VS ≥60g/L，PLT:＜20×109/L VS ≥20×109/L)进行分类，转变为计数资料后进行比较；而初诊WBC 计数视作计量资料，采用曼-惠特尼U 检验(Mann-Whitney U test)或克鲁斯卡尔-沃利斯H 检验(Kruskal-Wallis H test)进行分析。 多因素分析采用二元Logistic 回归模型进行。 对影响抗体类型的单因素分析参考上文进行，多因素分析采用多元Logistic 回归模型进行。 双侧检验，P＜0.05 为有统计学意义。

2 结果

2.1 基本临床信息

共纳入1 008 名患者，其中男性575 名，女性433 名；中位年龄35(26 ～47)岁，＜35 岁患者486名，≥35 岁患者522 名；疾病诊断包括急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia，AML)患者408名、急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)患者226 名、骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome，MDS)患者141 名、再生障碍性贫血(aplastic anemia，AA)患者123 名和其他血液病患者(other hematologic diseases，Others)110 名。

2.2 抗HLA 抗体阳性率

所有患者中共有250 名在移植前检测出抗HLA 抗体，阳性率为24.80%(250/1 008)；其中在男性和女性患者中分别有80 名和170 名检测出抗HLA 抗体，阳性率分别为13.91%(80/575) 和39.26%(170/433)；在年龄＜35 岁和年龄≥35 岁的患者中分别有88 名和162 名检测出抗HLA 抗体，阳性率分别为18.11%(88/486)和31.03%(162/522)；在AML、ALL、MDS、AA 和其他患者中分别有112、28、51、34、25 名检测出抗HLA 抗体，阳性率分别为27.45%(112/408)、12.39%(28/226)、36.17%(51/141)、27.64%(34/123)和22.73%(25/110)。 抗体阳性人群特征:女性阳性率高于男性，≥35 岁年龄段阳性患者较多，疾病诊断以MDS、AML 和AA 较高，ALL 较低。

2.3 影响抗HLA 抗体产生的危险因素

2.3.1 单因素分析

单因素分析显示，阳性组与阴性组患者相比较，性别、年龄、疾病确诊至抗体检测采样前时间、初诊WBC 计数、Hb 计数、PLT 计数、妊娠史、妊娠次数、入院前和入院后输血史、RBC、PLT 和FP 的输注总量、输注次数及输血总次数这些因素之间有显著性差异，P值均＜0.05(表1)。

2.3.2 多因素分析

二元Logistic 回归结果显示:年龄≥30 岁、疾病确诊至抗体检测的时间≥41 d、初诊PLT 计数＜20×109/L、抗体检测采样前有妊娠史、入院前有输血史和入院后PLT 输注总量≥30 U，为影响抗HLA 抗体产生的独立危险因素(图1)。

2.4 影响抗HLA 抗体类型的危险因素

2.4.1 单因素分析

单因素分析显示，性别、年龄、疾病确诊至抗体检测采样前时间、初诊WBC、Hb 计数及PLT 计数、妊娠史、妊娠次数、入院前及入院后输血史、入院后RBC、PLT、FP 的输注总量和输注次数及输血总次数与不同类型的抗HLA 抗体产生有关，P值均＜0.05(表2)。

因素总体(n ＝1 008)未检出抗体(n＝758)检出抗体(n ＝250)χ2/U 值P 值性别85.0930.000男575(57.04)495(65.30)80(32.00)女433(42.96)263(34.70)170(68.00)年龄(岁)35(26-47)33(24-46)40(30-49)31.3320.000＜30371(36.81)316(41.69)55(22.00)≥30637(63.19)442(58.31)195(78.00)疾病确诊至抗体检测采样时间(d)30(4-110)23(3-93)63.5(11.75-164.25)31.3050.000＜41557(55.26)457(60.29)100(40.00)≥41451(44.74)301(39.71)150(60.00)WBC(×109/L)5.86(2.30-32.23)6.57(2.34-37.03)4.39(2.12-16.74)84 163.000∗0.008 Hb(g/L)80(64-100)83(65-104)74(61-93)4.3210.038＜60189(18.75)131(17.28)58(23.20)≥60819(81.25)627(82.72)192(76.80)PLT(×109/L)43(20-97)47(22-107.25)34.5(16.75-71.25)8.8630.003＜20244(24.21)166(21.90)78(31.20)≥20764(75.79)592(78.10)172(68.80)既往史5.1690.023无598(59.33)465(61.35)133(53.20)有410(40.67)293(38.65)117(46.80)感染史1.3600.243无899(89.19)681(89.84)218(87.20)有109(10.81)77(10.16)32(12.80)妊娠史128.6940.000无684(67.86)587(77.44)97(38.80)有324(32.14)171(22.56)153(61.20)妊娠次数(次)0(0-1)0(0-0)1(0-2)128.6940.000＜1684(67.86)587(77.44)97(38.80)≥1324(32.14)171(22.56)153(61.20)入院前输血史12.9010.000无470(46.63)378(49.87)92(36.80)有538(53.37)380(50.13)158(63.20)入院后输血史25.7150.000无539(53.47)440(58.05)99(39.60)有469(46.53)318(41.95)151(60.40)RBC 输注总量(U)0(0-3.5)0(0-3)0(0-5.63)19.3740.000＜1.5645(63.99)514(67.81)131(52.40)≥1.5363(36.01)244(32.19)119(47.60)RBC 输注次数(次)0(0-2)0(0-2)0(0-3)18.6710.000＜1643(63.79)512(67.55)131(52.40)≥1365(36.21)246(32.45)119(47.60)PLT 输注总量(U)0(0-25)0(0-15)10(0-55)41.6080.000＜30762(75.60)611(80.61)151(60.40)≥30246(24.40)147(19.39)99(39.60)PLT 输注次数(次)0(0-3)0(0-2)1(0-6)32.0750.000＜2697(69.15)560(73.88)137(54.80)≥2311(30.85)198(26.12)113(45.20)FP 输注总量(mL)0(0-0)0(0-0)0(0-250)15.5360.000＜100812(80.56)632(83.38)180(72.00)≥100196(19.44)126(16.62)70(28.00)FP 输注次数(次)0(0-0)0(0-0)0(0-1)15.5360.000＜1812(80.56)632(83.38)180(72.00)≥1196(19.44)126(16.62)70(28.00)输血总次数(次)0(0-5)0(0-4)2(0-11)26.7150.000＜1539(53.47%)440(58.05%)99(39.60%)≥1469(46.53%)318(41.95%)151(60.40%)

2.4.2 多因素分析

多元Logistic 回归分析结果显示:年龄≥30 岁的患者相比＜30 岁的患者更容易产生抗HLA-Ⅰ类抗体，抗体检测采样前有妊娠史的患者相比无妊娠史的患者更容易产生抗HLA-Ⅱ类抗体；疾病确诊至抗体检测时间≥41d 相比＜41d 的患者、初诊PLT计数＜20×109/L 相比≥20×109/L 的患者、抗体检测采样前有妊娠史相比无妊娠史的患者、入院前有输血史相比无输血史的患者、入院后PLT 输注≥30U 相比＜30U 的患者更容易产生抗HLA-Ⅰ＋Ⅱ类抗体(图2)。

图2 影响抗HLA 抗体类型的多因素分析Figure 2 Multivariate analysis of factors affecting anti-HLA antibody types

3 讨论

本研究发现患者初诊时的PLT 计数、入院后的PLT 输注总量均是影响抗HLA 抗体产生的重要因素。 这可能是由于初诊时PLT 计数低于临床危急值的患者在治疗过程中需要输注更多的PLT，而HLA 抗原广泛存在于PLT 表面，故异体PLT 表面携带的丰富抗原会刺激人体产生抗HLA 抗体；同时抗HLA 抗体又会破坏携带相应抗原的PLT[19]，反过来使患者PLT 水平持续低下，进一步增加PLT输注量和次数，形成恶性循环。 因此对于PLT 输注效果不佳的患者，应考虑进行抗HLA 抗体检测，尤其是对于MFI 高的患者，可采取输注相匹配HLA抗原，或规避异源型抗原刺激等方法输注PLT，以此改善输血效果。 对于将接受移植的血液病患者，如果化疗后骨髓抑制时间长、程度重，要及时加用促造血药物促进血细胞回升，合理选用对血细胞影响小的抗生素预防感染[20]，避免由感染刺激导致的抗体产生和血细胞消耗增加，尽可能减少输注量和次数，从而减少抗HLA 抗体的产生。

在接受单倍体移植的血液病患者、老年血液病患者、儿童血液病患者和接受同胞全相合移植的血液病患者中，国内研究显示移植前抗HLA 抗体的阳性率分别为21.0%、26.7%、13.0%和25%[21-24]。Ciurea 等学者报道，在恶性血液病患者中，抗HLA抗体的阳性率在18%～39.4%之间[25-28]；而国内不同地区健康人群中抗HLA 抗体的阳性率约为0.6%～13.38%[29-32]，明显低于血液病患者，提示血液病本身或不同的治疗手段(如输血等)等因素有可能导致了其抗体阳性率高于健康人群。 Nickel 等报道，抗HLA 抗体阳性，尤其是抗HLA-Ⅰ类抗体阳性的患者，相比阴性患者接所受的血小板输注量明显更多[33-34]；还有学者研究显示，疾病诊断、性别、年龄、妊娠史和输血史与抗HLA 抗体的产生与有关[21，23，24]，本研究关于影响抗体产生的危险因素的结果支持这一观点。

年龄较大的血液病患者的相关研究发现，妊娠史与抗HLA-Ⅰ类抗体的产生有关，病程(≥7.5 个月)与高MFI 水平的抗HLA-Ⅰ类抗体有关[23]；对儿童患者的相关研究发现，输血与抗HLA-Ⅰ类抗体的产生相关[24]。 本研究发现，年龄与抗HLA-Ⅰ类抗体的产生相关，这可能是因为年龄越大的患者，经历更长的病程和更多的妊娠次数(对于女性而言)，而更长的病程则伴随更多的输血量和次数，最终影响抗HLA-Ⅰ类抗体的产生。 另外有研究发现，在年龄较大的血液病患者中，女性与抗HLA-Ⅱ类抗体的产生有关[23]；另1 项对孕妇妊娠期间抗HLA 抗体检出情况的研究显示，经产妇比初产妇更容易检测到抗HLA 抗体，且抗HLA-Ⅱ类抗体在妊娠晚期的阳性率会增加[35]。 本研究认为妊娠史与抗HLA-Ⅱ类抗体的产生有关，与这些文献报道相一致。

由于HLA-Ⅰ类抗原广泛分布在体内包括PLT在内的多种细胞表面，通过输血进入受者体内的异体血制品所携带的I 类抗原会刺激机体产生抗HLA-Ⅰ类抗体。 也有研究显示，PLT 输注同时与抗HLA-Ⅰ＋Ⅱ类抗体的产生有关[23]，而该课题组的另1 项研究则显示，女性、既往输血或妊娠与抗HLA-Ⅰ＋Ⅱ类抗体阳性有关[21]。 本研究结果则表明，病程、初诊PLT 计数、抗体检测前输血史、妊娠史和PLT 输注量会影响抗HLA-Ⅰ＋Ⅱ类抗体的产生，提示除了输血和妊娠各自的影响之外，更多的因素可产生交互影响，影响抗HLA-Ⅰ类和抗HLA-Ⅱ类两种抗体同时产生。

综上所述，抗HLA 抗体的产生与多种因素有关，如年龄、病程、输血、妊娠等因素均可能影响抗HLA 抗体的产生。 目前抗HLA 抗体对于造血干细胞移植预后的不利影响已成为共识，因此对行HSCT 的血液病患者，在移植前应常规检测抗HLA抗体，这对于选择合适供者和评估移植风险具有重要价值。 对于具有移植相关危险因素的患者，应重点进行监测，必要时采取治疗措施清除抗体或降低其MFI 值，以最大程度规避移植风险。 待确定供者后，还应该结合供、受者HLA 高分辨基因分型，定性、定量分析患者体内抗HLA 抗体情况，并以移植前抗HLA 抗体检测结果为基线和参考，动态追踪移植后不同时间内患者的抗体检出情况、抗体类型和MFI 值的变化，结合临床及时予以相应的处理，降低抗HLA 抗体对移植的影响，改善HSCT 预后[36]。