生物炭对黑胫病抗性不同烤烟品种根际土壤真菌群落结构的影响

任志超，李 想，李先锋，毋丽丽，王 景，彭志良，刘国顺，殷全玉

（1.河南农业大学烟草学院，河南 郑州 450002；2.陕西省烟草公司汉中市公司，陕西 汉中 723000；3.陕西省烟草公司商洛市公司，陕西 商洛 726000）

土壤是影响甚至决定植物生长发育状况的重要因素之一[1]。大量微生物存在于土壤之中，其在土壤中的分布特征和组成多样性反映土壤质量的好坏，对土壤肥力的演变、有效养分的持续供给以及各种土传病害的防治起着举足轻重的作用[2-6]。生物炭是指由各种固体农林废弃物在厌氧条件下热解产生的富碳有机产物[7-10]，已被证明是农业生产中一种很有前景的土壤改良剂，具有抑制病原菌繁殖、改善土壤理化性质、促进作物生长及调节土壤微生态环境等功能[11-13]。TIAN 等[14]进行西洋参盆栽试验，发现土壤灭菌后施加生物炭可调节西洋参酚酸的化感作用，与蚯蚓粪联合施用可有效防治镰刀菌根腐病。DE MEDEIROS等[15]研究表明，施加生物炭可有效降低番茄青枯病的发病率。ROSE 等[16]在种植甘蔗的土壤中添加生物炭，发现土壤pH 值和水分含量随生物炭含量的增加而增加，同时抑制了甘蔗红腐病病原菌数目的增长。同种作物不同品种对施加生物炭的响应有所不同。丁玮等[17]在田间水稻移栽前施加生物炭，发现水稻品种玉针香和黄华占的土壤微生物群落结构受生物炭影响较大，而五常香稻等其他水稻品种受生物炭影响较小。FORNES 等[18]发现，施用高剂量生物炭对番茄品种Cuarenteno 地上部分无影响，而对番茄品种Gransol RZ的地上部和根部有较大的负面影响。

由疫霉菌引起的烟草黑胫病是全球范围内的一种破坏性土传病害[19-20]。烟草黑胫病分布广泛且可在任何阶段侵染烟草，给烟草产业带来了严重的经济损失[21-22]。疫霉菌可与土壤中其他微生物互作从而影响烟草的根际微生态环境，这将严重制约烟草行业的可持续发展[23-24]。目前，生物炭的应用在玉米、黄瓜、辣椒及番茄等作物病害防治上已有报道[25-28]，但生物炭对黑胫病抗性不同烤烟品种根际土壤真菌群落结构的影响却鲜有报道。鉴于植烟土壤的真菌数量及多样性与烤烟黑胫病关系密切，通过高通量测序的方法对施加生物炭及未加生物炭条件下黑胫病抗性不同烤烟品种土壤真菌群落结构进行分析，探究生物炭对黑胫病抗性不同烤烟品种植烟土壤真菌多样性的影响，以期为利用生物炭调控烟草微环境及烤烟黑胫病的综合防治提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 供试材料

试验于2020 年5—9 月在河南农业大学许昌校区现代烟草科教园区（34°18'N、113°48'E）玻璃温室内进行。

供试土壤：取自科教园区休耕烟田0～30 cm 耕层土，褐土，基础理化性质为pH值7.57，有机质含量11.5 g∕kg，速效氮含量81.59 mg∕kg，速效磷含量10.09 mg∕kg，速效钾含量134.57 mg∕kg。土样经风干后过1 mm孔径筛备用。

供试生物炭：花生壳生物炭，在450 ℃密闭缺氧条件下连续炭化制成，基础理化性状为pH 值8.33，总C 414.72 g∕kg，总N 14.36 g∕kg，C∕N 28.88，比表面积22.97 m2∕g，由河南惠农土质保育研发有限公司提供。

供试烤烟品种：中抗黑胫病品种K326（K），高抗黑胫病品种NC82（N）和高感黑胫病品种净叶黄（J），由河南农业大学烟草育种实验室提供。

1.2 试验设计

采用盆栽试验，每个品种分别设施炭和不施炭2个处理，同时均设置不种植烟株的空白对照，共计8 个处理（表1），每个处理重复5 次，每4 盆为1 次重复，一共160盆。盆规格为外径33 cm、高31.5 cm、底径22.5 cm，每盆装土15 kg，每盆施氮（N）2.5 g，氮（N）∶磷（P2O5）∶钾（K2O）为1∶1.5∶3。供试氮肥NH4NO3，磷肥和钾肥为KH2PO3和K2SO4，均为分析纯试剂。生物炭用量为100 g∕盆，移栽前将生物炭、肥料与土壤均匀混合装入盆中，置于玻璃温室内，室内温度25 ℃。于2020 年5 月5 日移栽，移栽后浇足定根水，使烟苗及时复苏。之后每周定时浇水，以防止土壤板结。移栽后35 d 接种烟草黑胫病病原菌，用注射器针头在烟株茎基部划2个伤口，然后采用灌根法接种10 mL 1×106cfu∕mL 烟草疫霉孢子液。移栽后40 d 调查烟株发病情况，并取烟株根际土，提取土壤总DNA，检测真菌群落结构。

表1 试验处理设置Tab.1 Test treatment settings

1.3 样品采集和测定方法

1.3.1 烟草黑胫病发生调查方法 根据GB∕T 23222—2008《烟草病虫害分级及调查方法》标准（表2），在移栽后40 d 分别调查各处理全部烟株黑胫病的发病情况，并计算发病率和病情指数。

表2 烟草黑胫病分级标准Tab.2 Classification standard of tobacco black shank disease

发病率=[病叶（株）数∕调查总数（株数）]×100%；

病情指数=∑（病级数×该级病株数）∕（最高病级数×调查总株数）×100；

防治效果=（对照组病情指数-处理组病情指数）∕对照组病情指数×100%。

1.3.2 烟株根际土取样方法 烟苗移栽后40 d，拔出整株烟根，抖去根围土，用无菌刷子小心地把紧贴烟根的土壤刷下来，搜集到无菌的塑料离心管内，于-80 ℃保存，一周内完成土壤总DNA抽提。

1.3.3 土壤DNA 提取和PCR 扩增方法 根据E.Z.N.A.® soil DNA kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）说明书进行微生物群落总DNA抽提，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的提取质量，使用NanoDrop 2000 测定DNA 浓度和纯度；采用ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）对ITS基因ITS1 可变区进行PCR 扩增，扩增程序如下：95 ℃预变性3 min，27 个循环（95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），然后72 ℃稳定延伸10 min。PCR 反应体系：5×TransStart FastPfu 缓冲液4 µL，2.5 mmol∕L dNTPs 2 µL，上游引物（5 µmol∕L）0.8µL，下游引物（5 µmol∕L）0.8 µL，DNA 聚合酶0.4µL，模板DNA 10 ng，补足至20 µL。每个样本3个重复。

1.3.4 Illumina Miseq 测序 将同一样本的PCR 产物混合后，使用2%琼脂糖凝胶检测，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）进行PCR 产物回收纯化，2%琼脂糖凝胶电泳检测，并用Quantus ™ Fluorometer（Promega，USA）对回收产物进行检测定量。使用NEXTFLEX® Rapid DNA-Seq Kit 进行建库：（1）接头连接；（2）使用磁珠筛选去除接头自连片段；（3）利用PCR 扩增进行文库模板的富集；（4）磁珠回收PCR 产物得到最终的文库。利用Illumina 公司的Miseq PE300 平台进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。将原始数据上传至NCBI SRA（Sequence read archive，http:∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕Traces∕sra）数据库。

1.4 数据处理

使用Trimmomatic 软件对原始测序序列进行质控，使用FLASH软件进行拼接：

（1）过滤reads 尾部质量值20 以下的碱基，设置50 bp 的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50 bp 以下的reads，去除含N碱基的reads。

（2）根据PE reads 之间的overlap 关系，将成对reads 拼接（merge）成一条序列，最小overlap 长度为10 bp。

（3）拼接序列的overlap 区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列。

（4）根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode 允许的错配数为0，最大引物错配数为2。

使用的UPARSE 软件（version 7.1，http:∕∕drive5.com∕uparse∕），根据97%的相似度对序列进行OTU聚类并剔除嵌合体。利用RDP classifier（2.13）（http:∕∕rdp.cme.msu.edu∕）对每条序列进行物种分类注释，比对UNITE 8 数据库（SSU128），设置比对阈值为70%。

2 结果与分析

2.1 施用生物炭对抗性不同烤烟品种黑胫病发生的影响

由表3可见，未施生物炭条件下，烟草黑胫病发病率和病情指数在烤烟品种间差异达到显著水平，表现为净叶黄＞K326＞NC82；施用生物炭明显降低了高感品种净叶黄、中抗品种K326 和高抗品种NC82的黑胫病发病率和病情指数，对3个品种黑胫病的防治效果分别为56.52%、31.00%和27.00%。

表3 不同烤烟品种黑胫病发生情况Tab.3 Occurrence of black shank disease in different flue-cured tobacco varieties

2.2 施用生物炭对黑胫病抗性不同烤烟品种土壤真菌Alpha多样性的影响

研究环境中微生物的多样性，可以通过单样本的多样性（Alpha 多样性）分析反映微生物群落的丰富度和多样性，包括一系列统计学分析指数估计环境群落的物种丰度和多样性。各处理土壤真菌多样性指数差异结果如图1 所示。Coverage 指数用来描述样本菌落的覆盖率，即本次测序是否代表真实状况；Chao1 指数反映真菌群落结构的丰度，Chao1指数值越大，说明物种总数越多；Shannon 指数和Simpson 指数反映真菌群落结构的均匀性，Shannon指数和Simpson 指数值越大，说明群落多样性越高。由图1 知，各个样本的Coverage 指数都接近100%，表明此次测序反映了真菌群落结构的真实性。不施生物炭条件下，各烤烟品种根际土壤真菌Chao1 指数之间无显著差异，施用生物炭影响了Chao1 指数的大小，使K326 的Chao1 指数显著高于CK；不施生物炭条件下，各品种的Shannon指数整体低于CK，K326与CK存在显著差异，施用生物炭后各处理的Shannon 指数无显著差异；不施生物炭条件下，K326的Simpson指数显著低于其他品种，施用生物炭后各烤烟品种的Simpson指数无显著差异。

图1 基于ITS基因的土壤样本真菌多样性指数Fig.1 Fungal diversity index of soil samples based on ITS gene

2.3 施用生物炭对黑胫病抗性不同烤烟品种土壤真菌群落组成的影响

2.3.1 门水平上优势物种相对丰度 由图2 可见，CK 及各品种根际土壤中的优势菌门有子囊菌门（Ascomycota）、被孢霉门（Mortierellomycota）和担子菌门（Basidiomycota），平均丰度之和在90%以上。与未施用生物炭相比，施用生物炭后，除NC82 的子囊菌门相对丰度增加7.18%外，CK、K326、净叶黄的相对丰度分别减少了5.39%、12.46%、4.12%；NC82的被孢霉门相对丰度减少了1.75%，而CK、K326、净叶黄分别增加了5.01%、9.50%、3.05%；CK、NC82、净叶黄的担子菌门相对丰度分别降低2.14%、3.77%和1.46%，而K326 升高2.18%（图2）。无论是未植烟土壤还是不同烤烟品种的植烟土壤，施用生物炭没有改变优势菌群的种类，但优势菌群的丰度占比受到一定影响。

图2 不同烤烟品种根际土壤真菌相对丰度（门水平）Fig.2 Relative abundance of fungi（phylum level）in rhizosphere soil of different tobacco varieties

2.3.2 属水平上优势物种相对丰度 各处理真菌属水平上的相对丰度如图3 所示，总共检测到14 个属，其相对丰度在黑胫病不同抗性烤烟品种间存在明显差异。与不施生物炭相比，施用生物炭后14个属的总丰度在不植烟土壤和3种烤烟品种土壤中均表现为升高。与不施生物炭相比，高抗品种NC82中，毛壳属（Chaetomium）、Gibellulopsis、镰刀菌属（Fusarium）、腐质霉属（Humicola）、unclassified_o__Glomerellales 和小不整球壳属（Plectosphaerella）6 个属相对丰度增加，被孢霉属（Mortierella）、短柄菌属（Solicoccozyma）、白 子 菌 属（Leucothecium）、unclassified_k__Fungi、新赤壳属（Neocosmospora）、赤 霉 属（Gibberella）、新 型 隐 球 酵 母 属（Cystofilobasidium）和青霉菌属（Penicillium）8 个属相对丰度降低；中抗品种K326 中，被孢霉属、毛壳属、短柄菌属、白子菌属、unclassified_k__Fungi、新赤壳属、新型隐球酵母属和小不整球壳属8 个属相对丰度增加，Gibellulopsis、镰刀菌属、赤霉属、腐质霉属、unclassified_o__Glomerellales 和青霉菌属6个属相对丰度降低；高感品种净叶黄中，被孢霉属、毛壳属、短柄菌属、unclassified_k__Fungi、镰刀菌属、赤霉属和unclassified_o__Glomerellales 7 个属相对丰度增加，Gibellulopsis、白子菌属、新赤壳属、腐质霉属、新型隐球酵母属、小不整球壳属和青霉菌属7个属相对丰度降低。

图3 不同烤烟品种根际土壤真菌相对丰度（属水平）Fig.3 Relative abundance of fungi in rhizosphere soil of different tobacco varieties（genus level）

2.3.3 黑胫病抗性不同烤烟品种根际土壤关键真菌对生物炭输入的响应 鉴于土壤中微生物的数量之多，丰度差别之大，因此有必要明确生物炭输入对黑胫病抗性不同烤烟品种根际土壤微生物的影响。以LDA值4.0以上作为LDA判别分析的阈值进行LefSe 分析，以明确不同处理的差异微生物以及它们在不同分组中的富集情况，结果具体见图4和图5。由图4 和图5 可见，不施生物炭条件下，CK根际土壤中高度富集的微生物有散囊菌纲（Eurotiomycetes）、曲霉属（Aspergillus）和肉座菌纲（Hypocreales）等，施入生物炭后髌壶菌门（Chytridiomycota）显著富集；不施生物炭条件下，K326 根际土壤中高度富集的微生物有子囊菌门（Ascomycota）、散子囊菌目（Eurotiales）和曲霉科（Aspergillaceae）等，施入生物炭后银耳纲（Tremellomycetes）、拟球菌科（Plectosphaerellaceae）和黑轮枝菌属（Gibellulopsis）等显著富集；不施生物炭条件下，NC82 根际土壤中高度富集的微生物有被孢霉科（Mortierellaceae）等，施入生物炭后粪壳菌纲（Sordariomycetes）和镰刀菌属（Fusarium）等显著富集；不施生物炭条件下，净叶黄根际土壤中高度富集的微生物有拟球菌属（Plectosphaerella）、囊丝菌目 （Cystofilobasidiales） 和 座 囊 菌 纲（Dothideomycetes）等，施入生物炭后担子菌门（Basidiomycota）和球腔菌属（Plectosphaerella）等显著富集。

图4 不施用生物炭条件下烤烟品种对根际土壤关键微生物的影响Fig.4 Effects of flue-cured tobacco varieties on key microorganisms in rhizosphere soil without biochar application

图5 施用生物炭条件下烤烟品种对根际土壤关键微生物的影响Fig.5 Effects of flue-cured tobacco varieties on key microorganisms in rhizosphere soil under the condition of applying biochar

2.4 施用生物炭对黑胫病抗性不同烤烟品种土壤真菌群落相似性特征的影响

由图6 可见，无论是未植烟土壤还是种植不同品种烤烟土壤，施用生物炭均改变了其土壤真菌群落结构特征，总体上呈现出“处理组内相对聚集，处理组间相对分离”的特点。土壤处理组内分离性在PC1 及PC2 轴上均有体现，施用生物炭后未植烟土壤和净叶黄组内聚集性减弱，NC82 和K326 组内聚集性增强。对于未植烟土壤，施用生物炭极显著地改变了土壤样本的分布态势，沿着PC1 轴向右方向分布；中抗品种K326 沿着PC1 轴左方向分布；高抗品种NC82 样本点沿着PC1 轴向左上分布；高感品种净叶黄沿着PC2 轴向上方分布。可见，黑胫病抗性不同烤烟品种根际土壤真菌群落结构对生物炭输入的响应模式不同。

图6 生物炭对不同烤烟品种根际土壤真菌群落相似性的影响Fig.6 Effects of biochar on similarity of rhizosphere soil fungal communities of different flue-cured tobacco varieties

基于门水平对黑胫病抗性不同烤烟品种根际土壤真菌群落进行主坐标分析（PCoA），结果（图7）显示，不施生物炭条件下，组间差异达到显著水平（P=0.02＜0.05），PC1 和PC2 是降维提取的对真菌群落结构作用最大的2 个主成分，分别达到57.34%和16.11%；与不种植烟草土壤相比，黑胫病抗性不同烤烟品种根际土壤的样本点与其呈现明显的分离，高感品种净叶黄和高抗品种NC82 根际土壤真菌群落结构具有一定的相似性，中抗品种K326 根际土壤真菌群落结构与高抗品种NC82 发生明显的分离效应。而施用生物炭后，黑胫病抗性不同烤烟品种根际土壤真菌群落结构相似性增加，分布向未植烟土壤聚集且显著差异性消失变为无显著差异性（P=0.055＞0.05）。

图7 不同烤烟品种根际土壤真菌群落（门水平）主坐标分析Fig.7 Principal coordinate analysis of fungal community（phylum level）in rhizosphere soil of different flue-cured tobacco varieties

3 结论与讨论

本研究发现，施加生物炭可不同程度降低烟草黑胫病的发生，施用生物炭后，黑胫病抗性不同烤烟品种发病率与病情指数均明显降低，发病率表现为NC82＞K326＞净叶黄，病情指数表现为K326＞NC82＞净叶黄，这与王光飞等[29]在辣椒上的研究相似，可能是生物炭的多孔性为土壤中抑制病原菌的真菌提供了繁殖发育所需的附着位点[30-31]，同时生物炭的降解为土壤提供真菌生存所需的物质和能量，促进有益菌的增殖并抑制疫霉菌的生长发育，从而降低烟草黑胫病的发生[32]。

黑胫病抗性不同烤烟品种根际土壤真菌群落结构Alpha 多样性对生物炭输入的响应不同，不施生物炭条件下，高感品种净叶黄的根际土壤真菌多样性高于高抗品种NC82 和中抗品种K326，说明根际土壤真菌多样性受品种抗性的影响，这是因为不同品种植物的根系分泌物具有特异性，而根系分泌物的不同会影响微生物生长发育进而导致土壤真菌群落结构Alpha 多样性不同[33-34]；施用生物炭对黑胫病抗性不同烤烟品种真菌群落结构的多样性影响不同，中抗品种K326 的真菌多样性显著升高，高感品种净叶黄和高抗品种NC82 的真菌多样性均有不同程度的降低，这与丁玮等[17]在水稻上的研究结果相似。可能是因为生物炭可提供真菌所需的物质和能量，能促进真菌的繁殖生长从而使中抗品种K326根际土壤真菌多样性增加，同时也会改善土壤微环境，促进某些真菌的生长发育，导致真菌群落个体大小或数量差异增大，群落均匀度降低，进而导致多样性指数减小[35-36]。

未植烟土壤及各品种烤烟根际土壤真菌的优势菌门有子囊菌门（Ascomycota）、被孢霉门（Mortierellomycota）和担子菌门（Basidiomycota），平均丰度之和在90%以上，这与前人研究结果[37-38]一致。施用生物炭后，不同品种烤烟根际土壤真菌在门水平上相对丰度发生显著改变的表现不同。通过LefSe 分析可知，黑胫病抗性不同烤烟品种根际土壤关键微生物的种群类别不同，且其对生物炭的响应也存在差异。生物炭影响真菌菌群相对丰度变化的原因复杂，还需更进一步研究。

由PCoA 分析可知，不施用生物炭条件下，3 个烤烟品种根际土壤样本点与不种植烟草土壤呈现明显的分离，高感品种净叶黄和高抗品种NC82 根际土壤真菌群落结构具有一定的相似性，中抗品种K326根际土壤真菌群落结构与高抗品种NC82发生明显的分离效应。施用生物炭后，不同烤烟品种真菌群落结构分布向未植烟土壤聚集且显著差异性消失变为无显著差异性，说明施用生物炭改变了黑胫病抗性不同烤烟品种的群落结构，这与王光华等[39]在大豆上的研究相似。

此外，该试验也具有一些局限性。首先，试验是在同一生物炭类型及同一用量的情况下进行的，不同类型生物炭及用量可能会造成不同影响，张继旭等[40]在烟田土壤中添加不同类型生物炭后发现，不同类型生物炭具有不同的增碳固氮效果。石吕等[41]发现，水稻产量和施用生物炭量之间呈正相关关系。其次，试验采用温室盆栽的种植方法，具有固定的环境和土壤条件，避免了大田试验中气候因素不可控及试验土壤差异性，因此，要在考虑上述局限性的情况下进一步研究并评估生物炭对黑胫病抗性不同烤烟品种根际土壤真菌群落结构的影响。

综上，生物碳可有效降低烤烟黑胫病发生。黑胫病抗性不同烤烟品种真菌群落结构在不施生物炭情况下显著不同，对生物炭的响应趋势也不同，施用生物炭可改变黑胫病抗性不同烤烟品种的群落结构。