基于网络药理学探讨芩蓟凉血合剂治疗便秘作用机制

李鹏，金文琪，李小嘉，胡婕，朱影，郭修田

上海市中医医院，上海 200071

便秘是全球常见问题，欧美国家成人功能性便秘患病率为7.9%～8.6%[1]。主要包括排便次数减少、排便不尽、排便时间延长、便质干结等症状[2-3]。便秘和年龄、饮食结构密切相关，随着年龄增长，不仅患病率逐渐增加，患者焦虑心理也逐步加重。便秘分为原发性与继发性，原发性便秘包括便秘型肠易激综合征、功能性便秘、慢传输便秘及肌肉或神经损伤引起的排便障碍，继发性便秘可能由代谢紊乱（如高钙血症）、药物（如阿片类药物）、原发性结肠疾病（如结肠癌、直肠炎）和神经系统疾病导致[4-5]。目前，便秘有药物、非药物等疗法，但药物依赖性强、远期复发率较高[6]。

芩蓟凉血合剂是上海市中医医院临床应用近30年的成药复方，包括熟地黄、大蓟、黄芩、火麻仁、茜草、地榆、槐角、侧柏叶、仙鹤草、甘草，共奏清热凉血、润肠通便之功，临证发现其不仅可改善早期急性痔出血，还可减少排便时间，缓解便质干结、排便不尽等症状[7]。该方治疗便秘疗效显著，但作用机制尚未阐明，本文采用网络药理学方法探索芩蓟凉血合剂治疗便秘的活性成分、核心靶点及作用机制，以期为芩蓟凉血合剂治疗便秘提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 芩蓟凉血合剂活性成分及靶点筛选

通过TCMSP 数据库（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）以口服生物利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥0.18进行筛选，获取黄芩、火麻仁、熟地黄、侧柏叶、大蓟、地榆、茜草、槐角、仙鹤草、甘草的活性成分及靶点，并在UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）中明确靶蛋白对应的基因名称与ID。

1.2 便秘潜在靶点筛选

采用GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/about）、TTD数据库（http://bidd.nus.edu.sg/group/ttd/ttd.asp）及DisGeNET数据库（https://www.disgenet.org/），以“Constipation”为关键词，以“gene”与“homo sapiens”为限制条件检索便秘相关疾病靶点，并挖掘DrugBank数据库（https://go.drugbank.com/）涉及的疾病靶点为补充，删除重复靶点后建立便秘的疾病靶点库。

1.3 芩蓟凉血合剂-活性成分-靶点网络构建

利用BioVenn在线作图软件工具平台（http://www.biovenn.nl/）制作芩蓟凉血合剂活性成分靶点与疾病交集靶点韦恩图，获取的交集靶点即芩蓟凉血合剂治疗便秘的潜在作用靶点。

1.4 蛋白相互作用网络构建与核心靶点筛选

将“1.3”中获取的交集靶点输入STRING数据库（https://cn.string-db.org），选择“Homo sapiens”，最小相互作用阈值（minimum required interaction score）为0.9，隐藏游离节点，构建蛋白相互作用（PPI）网络并下载.tsv格式文件，将以上数据导入Cytoscape3.8.1软件，利用CytoNCA插件进行数据分析，计算出节点的中介中心性（BC）、接近中心性、度中心性（DC）及特征向量中心性（EC）。最后，按照上述4类数值均大于中位数筛选，得出核心靶点。将Network及Type数据导入Cytoscape3.8.1软件构建芩蓟凉血合剂治疗便秘中药-活性成分-靶点网络，分析节点连接度、介度等。采用CytoHubba插件对中药-活性成分-便秘靶点网络进行度值计算，选取排名前5位的关键成分。

1.5 GO功能和KEGG通路富集分析

以P＜0.01 为限定条件，利用Metascape 数据库（https://metascape.org）对核心靶点进行GO 功能与KEGG通路富集分析。GO功能富集分析包括细胞组分（CC）、分子功能（MF）及生物过程（BP）。采用KEGG富集分析获取芩蓟凉血合剂与便秘的共同靶点所富集的信号通路，并以条形图展示结果。

2 结果

2.1 芩蓟凉血合剂活性成分筛选结果

全方共筛选得出活性成分134个，其中侧柏叶7个、大蓟7个、地榆9个、茜草13个、槐角6个、仙鹤草5个、火麻仁6个、熟地黄2个、黄芩12个、甘草88个，靶点共289个。

2.2 便秘潜在靶点收集

通过数据库检索并删除重复基因后，共得到857个便秘靶点（见图1），芩蓟凉血合剂与便秘交集靶点共216个（见图2）。

图1 综合数据库便秘靶点韦恩图

图2 芩蓟凉血合剂与便秘交集靶点韦恩图

2.3 蛋白相互作用网络构建结果

将216个交集靶点导入STRING数据库构建PPI网络（见图3），代表相互作用的边共823条。

图3 芩蓟凉血合剂治疗便秘靶点PPI网络

2.4 核心靶点筛选结果

最终得出55个核心靶点（见图4），排名前10位的关键基因为：HSP90AA1、STAT3、MAPK3、TP53、AKT1、MAPK1、RELA、TNF、FOS、IL6。

图4 芩蓟凉血合剂治疗便秘核心靶点PPI网络

2.5 核心靶点筛选结果

采用Cytoscape构建芩蓟凉血合剂治疗便秘-靶点网络。图中共360个节点、3 167条边（见图5）。A1为侧柏叶、大蓟共有成分，B1为侧柏叶、地榆、茜草共有成分，C1、C2为侧柏叶、地榆、甘草、槐角、仙鹤草共有成分，D1为大蓟、甘草、火麻仁、茜草共有成分，D2为大蓟、火麻仁、熟地黄共有成分，E1为地榆、甘草共有成分，E2为地榆、茜草共有成分，F1为槐角、黄芩共有成分，G1为火麻仁、仙鹤草共有成分。CytoHubba插件分析后得出度值排名前5位关键成分为槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇及豆甾醇。

图5 芩蓟凉血合剂治疗便秘中药-活性成分-靶点网络

2.6 GO功能和KEGG通路富集分析结果

对216个交集靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析，分别选取前10位MF、CC、BP条目绘制条形图。MF包括DNA结合转录因子结合、转录辅助调节因子结合、泛素样蛋白连接酶结合、核受体活动、磷酸酶结合、细胞因子受体结合、激酶结合、蛋白激酶活性、一氧化氮合酶调节因子活性及MAP激酶活性；CC包括转录调节因子复合体、膜阀、囊腔、转录抑制因子复合体、质膜蛋白复合体、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合体、髓鞘、纺锤体、血小板α颗粒内腔及细胞质的核周区域；BP包括细胞对脂质的反应、腺体发育、细胞对化学应激的反应、对DNA结合转录因子活性的调节、对上皮细胞增殖的调控、对细胞分化的负调控、对辐射的反应、对缩氨酸的调控及对miRNA转录的调控。KEGG通路富集分析主要富集在癌症的途径、脂质和动脉粥样硬化、乙型肝炎、化学致癌-受体激活、甲状腺激素、HIF-1信号通路、PD-L1在肿瘤中的表达与PD-1检查点通路、铂类药物耐药性、JAK-STAT信号通路及甲状腺癌（见图6）。

图6 芩蓟凉血合剂治疗便秘靶点GO功能和KEGG通路富集分析

3 讨论

治疗便秘的西药如渗透性泻药、分泌性泻药及粪便膨化剂等，存在不良反应较多[8]，长期应用后肠道敏感性降低，对药物耐受性增加，导致药效变差，严重者最终只能选择手术治疗。芩蓟凉血合剂不仅可改善早期急性痔疮出血，还可改善粪质干结的症状，有效缓解便秘，但相关机制仍未明确[9]。本研究采用网络药理学方法探索芩蓟凉血合剂治疗便秘的作用机制，为后续芩蓟凉血合剂的基础实验提供基础。

本研究发现，芩蓟凉血合剂关键成分为槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇等。槲皮素、山柰酚和木犀草素是常见的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎等药理作用[10]。槲皮素是一种常见的天然黄酮类化合物，通常以糖基化形式存在，可影响多种生理过程及疾病的发生发展，包括血压、免疫功能、神经功能、癌症、衰老等[11-12]。槲皮素在剂量为25 mg/kg、50 mg/kg时可增加肠道推进率、胃泌素、胃动素及P物质水平，改善胃肠蠕动，并可通过增加肠道Cajal间质细胞标志物水平，如c-kit、干细胞因子SCF、水通道蛋白3（AQP3），缓解由洛哌丁胺导致的便秘[13]。在胃肠道中，槲皮素不仅可稳定肥大细胞，抑制组胺及其他化学物质的释放，调节小鼠回肠、结肠的钙氯通道活性，以剂量依赖性的方式激活氯离子转运，促进大鼠肠内液体分泌，从而改善便秘[14-15]。槲皮素可通过调控mACHRs信号通路改善由洛哌丁胺诱导的大鼠便秘模型，增加大鼠胃肠道运动及黏蛋白分泌，表明槲皮素治疗便秘有效[16]。山柰酚可通过抑制Toll 样受体4（TLR4）、信号转导和转录激活因子（STAT）和核因子-κB（NF-κB）的激活，减轻脂多糖诱导的大鼠肠道微血管内皮细胞（RIMVECs）炎症介质释放，包括肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）[17]。还可改善猪肠上皮细胞的氧化损伤和凋亡，减轻敌草快诱导的氧化损伤和肠屏障功能障碍，表明摄入富含山柰酚的药物及食物可能改善肠上皮细胞完整性和功能[18]。MAPK信号通路包括细胞外信号调节激酶1/2、c-Jun氨基末端激酶和p38，与炎症介质的表达和氧化损伤密切相关，山柰酚可抑制人单核细胞系THP-1中脂多糖诱导的MAPK通路表达[19-20]。木犀草素是一种天然类黄酮，在细胞因子诱导的HT-29细胞（人上皮细胞系）中抑制Janus激酶（JAK）/STAT通路，减缓炎症[21]。β-谷甾醇不仅可降低胆固醇，还具有抗炎、抗血管生成、免疫调节及化学预防等活性，可能对肠道疾病发挥作用。

通过PPI网络研究发现，芩蓟凉血合剂治疗便秘的核心靶点为HSP90AA1、STAT3、MAPK3、TP53、AKT1 等。HSP90AA1 基因编码的热休克蛋白90α（HSP90α）是分子伴侣蛋白HSP90应激诱导亚型。细胞应激时，HSP90α水平升高，组织特异性表达水平各异，在多种癌症中上调，与疾病预后相关[22]。STAT是JAK的重要底物，JAK/STAT信号通路与细胞增殖、分化、凋亡、免疫调节等密切相关[23]。肠道微血管内皮细胞是肠道毛细血管的主要组成部分，是炎症过程中最重要的分泌和免疫细胞之一。MAPK是一组可被多种细胞外刺激物激活的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，包括细胞因子、神经递质等。MAPK1和MAPK3在MAPK信号通路中起关键作用，抑制MAPK通路可增加肠道水分、促进肠道蠕动，从而改善便秘[24]。TP53是抑癌基因，可抑制细胞分裂、增殖过快或防止突变以维持细胞稳定性，抑制癌症的发生。Vacante等[25]研究表明，便秘可导致肠道菌群失调或代谢物异常，导致肠道微环境异常引起的免疫异常、基因突变或缺失，从而参与结直肠癌的发生发展。结肠Cajal间质细胞自噬持续缺失可能是便秘病理生理学的体现。AKT是PI3K/AKT/mTOR信号通路的枢纽，PI3K被生长因子与其同源受体结合而激活，被激活的PI3K 磷酸化后激活AKT，进一步通过TSC1/2复合物激活下游分子mTOR从而阻断结肠Cajal间质细胞自噬，改善便秘[26]。因此，芩蓟凉血合剂可能通过槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇等活性成分作用于JAK/STAT、MAPK等信号通路，从而改善肠道功能、缓解便秘。

综上所述，基于芩蓟凉血合剂治疗便秘的临床有效性，本研究采用网络药理学方法对芩蓟凉血合剂治疗便秘的关键成分、关键靶点及通路进行预测与分析，体现芩蓟凉血合剂通过多靶点、多通路治疗便秘的作用特点，为临床治疗便秘提供依据，但今后仍需大量实验验证分析，以明确芩蓟凉血合剂治疗便秘的关键作用机制。