和枢消积方通过调节AsTP3正反馈AKT/GSK-3β/mTOR信号通路对人肝癌细胞增殖及凋亡的影响*

李 玲 汪 静 朱晓宁 张玉蓉 尹 玥

西南医科大学附属中医医院肝胆病科 (四川 泸州,646000)

原发性肝癌(PLC)是世界上第六大最常见的癌症,发病率位居位世界癌症第五,死亡率第三(约8.3%)[1]。目前对于PLC的治疗手段主要包括手术、介入、放化疗及靶向药物,其中手术为治疗早期PLC最常用的方法,但术后5年复发率达70%,且本病起病隐匿,约60%以上的PLC患者发现时已处于中晚期,失去手术治疗的机会[2,3],因此,迫切需要探索和发现新的PLC治疗药物。本课题组前期的临床研究发现,和枢消积方能够延缓PLC进程,提高PHC患者生存率。预实验发现和枢消积方可以下调三氧化二砷反式激活蛋白3(AsTP3)表达,结合前期研究,过表达AsTP3可以上调肝癌细胞中蛋白激酶B(AKT)表达,下调AKT可以抑制糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)及雷帕霉素靶蛋白(mTOR)激活,抑制肝癌细胞增殖[4,5]。故推测和枢消积方抗癌作用与AsTP3及AKT/GSK-3β/mTOR信号通路相关,本研究将对其作用机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 实验材料 和枢消积方(柴胡、黄芩、黄芪等)组方药物经10倍于药物总质量的蒸馏水加热回流提取2次,每次1 h,合并提取的药液,水浴浓缩,配制成相当于生药浓度1 μg/ml的药液,0.22 μm微孔滤器过滤除菌备用,用DMEM培养基稀释为需要的浓度使用,所有药物均来自于西南医科大学附属中医医院药剂科。人肝癌细胞SMMC-7721细胞株为西南医科大学药学院肿瘤药理实验室赠予。DMEM培养基购自美国gibco公司,胎牛血清购自德国PAN公司,CCK8试剂盒购自日本同仁化学公司,Martige基质胶购自美国BD公司,Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒BCA蛋白浓度试剂盒购自中国碧云天公司,无氯仿RNA提取试剂盒购自中国百泰克生物技术有限公司,逆转录、qRT-PCR试剂盒购自日本TOYOBO公司,Bcl2、Bax、P-GSK-3β、GSK-3β抗体均购自美国CST公司,GAPDH、P-AKT、AKT、P-mTOR、AsTP3抗体均购自美国Santa Cruz公司,mTOR抗体购自美国Abcam公司、goat anti-rabbit IgG、Anti-Mouse IgG均购自美国Proteintech公司,引物由上海生工生物科技有限责任公司合成。

1.2 药物浓度筛选及细胞增殖活力测定 将SMMC-7721细胞接种于96孔板,24 h后加入和枢消积方干预。按照CCK8试剂盒说明书以每孔10 μl CCK8试剂混合完全培养基加入96孔板中,37℃孵育1 h,酶标仪检测吸光度(A值)。筛选出最佳药物浓度(18 μg/ml),并根据最佳药物浓度的1/2、1/4设置中、低剂量组。测试不同药物浓度梯度24 h、48 h、72 h细胞活力。

1.3 平板克隆实验 将SMMC-7721细胞按照3 000～5 000个/孔接种于6孔板中,24 h后予以不同浓度的药物干预,每2～3 d更换1次培养基,当出现肉眼可见的细胞集落时终止克隆,PBS清洗1次,甲醇固定30 min,0.5%结晶紫溶液染色20 min,拍照记录。

1.4 细胞划痕实验 将SMMC-7721细胞接种于12孔板中,待细胞长满,不同浓度药物干预24 h后,细胞内做直线划痕,PBS清洗,更换无血清培养基,观察24 h、48 h及72 h细胞愈合情况,并拍照记录。

1.5 细胞侵袭实验 按照Matrigel基质胶说明书,将基质胶加入Transwell小室中,放入孵箱中孵育1 h,待基质胶凝固后取出。将经不同浓度药物干预后的SMMC-7721细胞按照1×105/ml密度,用无血清培养基制成细胞悬液加入上室中,下室加入600 μl含20%胎牛血清的完全培养基,放入孵箱,24 h后取出,荧光倒置显微镜拍照、记录。

1.6 细胞迁移实验 除未在上室中加入基质胶,余操作同细胞侵袭实验。

1.7 流式细胞实验 不同浓度药物干预SMMC-7721细胞48 h,1 000×g离心5 min,PBS洗涤2次,使用Annexin V-FITC试剂盒,上流式细胞仪对细胞进行分析,每个样品至少分析1×105个细胞,实验重复3次。细胞凋亡率(%)=早期细胞凋亡率+晚期细胞凋亡率。

1.8 RT-PCR实验 根据总RNA试剂盒操作说明书提取细胞RNA并将其逆转录为cDNA,按照qRT-PCR试剂盒说明书检测基因AsTP3的表达,结果用2-ΔΔCt方法分析。引物序列见表1。

表1 引物序列表

1.9 Western-Blot实验 不同药物浓度干预SMMC-7721细胞48 h后提取总蛋白,按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行蛋白浓度测定。99℃变性10 min后进行电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显影。

2 结果

2.1 和枢消积方对SMMC-7721细胞增殖的影响 随着和枢消积方药物浓度增大,SMMC-7721细胞活性逐渐降低,当药物浓度大于30 μg/ml时,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01);再次筛选,当药物浓度为18 μg/ml时,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)(图1)。故本实验选用18 μg/ml作为后续实验的药物浓度。予以和枢消积方分别干预SMMC-7721细胞24、48、72 h,与对照组相比,和枢消积方可以显著降低SMMC-7721细胞活力,其中24 h、48 h差异有统计学意义(P<0.05),72 h仅高剂量组差异有统计学意义,低剂量及中剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。细胞克隆形成实验显示,随着药物浓度增加,细胞形成的集落显著减少(图3);同时,和枢消积方可上调Bax蛋白及下调Bcl2蛋白的表达(图4)。

与对照组比较,*P<0.05,#P<0.01

与对照组比较,*P<0.05,#P<0.01

图3 平板克隆形成实验

与对照组比较,*P<0.05,#P<0.01。

2.2 和枢消积方对SMMC-7721细胞侵袭、迁移的影响 细胞划痕实验显示,随着药物浓度增加,SMMC-7721细胞划痕愈合能力逐渐降低,其中,高剂量组与对照组相比,具有显著差异见图5。Transwell实验显示,和枢消积方干预SMMC-7721细胞24 h后,与对照组相比均能抑制SMMC-7721细胞的侵袭及迁移能力,且呈剂量依赖性见图6。

与对照组比较,*P<0.05。

图6 和枢消积方对SMMC-7721细胞侵袭与迁移的影响(结晶紫染色,200×)

2.3 和枢消积方对SMMC-7721细胞凋亡的影响 流式细胞实验检测显示,和枢消积方能明显促进SMMC-7721细胞凋亡,其中中剂量组及高剂量组凋亡率差异有统计学意义(P<0.05),且呈浓度依赖性。见图7。

与对照组比较,*P<0.05,#P<0.01。

2.4 和枢消积方对SMMC-7721细胞内ASTP3基因与蛋白的表达 结果显示和枢消积方能抑制SMMC-7721细胞AsTP3表达。见图8。

与对照组比较,*P<0.05,#P<0.01。

2.5 和枢消积方对SMMC-7721细胞AKT/GSK-3β/mTOR蛋白表达影响 不同浓度和枢消积方干预SMMC-7721细胞均能下调其P-AKT、P-GSK-3β、P-mTOR蛋白的表达。见图9。

与对照组比较,*P<0.05,#P<0.01。

3 讨论

肝细胞癌在传统中医药学中名为“积聚”“癥瘕”,中医认为其主要病机为“肝脾受损,气机阻滞,瘀血内结”形成腹内结块,导致积聚。和枢消积方是传承全国名老中医孙同郊教授经典思想,由汪静教授总结得出,其中柴胡疏肝理气,黄芩清泄邪热,二者配伍,为小柴胡之意,调和少阳枢机,黄芪健脾益气,顾护后天之本,诸药配伍,使气机调畅,肝胃调和,脾气得健,湿热清利,癥积自消。现代研究发现和枢消积方中柴胡、黄芩发挥抗炎、抗氧化、调节免疫作用,能调控癌细胞凋亡、增殖,达到抗癌目的[6,7]。同时,课题组前期临床研究发现和枢消积方在延长肝癌患者生存期方面有显著作用。本研究通过CCK8法、平板克隆、划痕、侵袭及迁移等实验表明,和枢消积方可以明显抑制肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力,流式细胞实验检测显示和枢消积方能够促进SMMC-7721细胞凋亡。CCK8实验中,不同药物浓度干预SMMC-7721细胞72 h后,低剂量及中剂量组差异无统计学意义,考虑与细胞密度相关。Bax及Bcl2是细胞凋亡的主要调节因子,可以激活线粒体外膜透化,产生半胱天冬酶级联反应,导致细胞不可逆的死亡[8]。和枢消积方能够上调SMMC-7721细胞中Bax蛋白、下调Bcl2蛋白表达,提示和枢消积方促进SMMC-7721细胞凋亡可能与介导线粒体外膜透化相关,后期可开展进一步研究。

AsTP3是2004年应用抑制性消减杂交技术克隆并鉴定的新基因,是一种胶原特异性分子伴侣,它在GeneBank中的别名还有SERPINH1、HSP47等,该基因位于人类癌症中最常扩增的区域之一—11q13.5号染色体上[9,10]。ENCORI(Encyclopedia of RNA Interactomes,RNA相互作用百科全书http://starbase.sysu.edu.cn/)数据库表明与正常肝组织相比,AsTP3在肝癌组织中呈高表达水平,且AsTP3高表达组生存期较低表达组生存期短,差异有统计学意义(P=0.047)。本研究显示,和枢消积方干预SMMC-7721细胞能显著下调AsTP3 mRNA及蛋白水平,故和枢消积方可能通过抑制AsTP3表达促进SMMC-7721细胞凋亡、抑制细胞增殖。

AKT是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它为磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)的主要下游效应物,磷酸化的AKT与肿瘤细胞增殖、凋亡、自噬等相关,其过表达是抗肿瘤药物治疗靶点之一[11];AKT作为一种致癌蛋白,能被Thr38或Ser473磷酸化激活,从而激活其下游分子,如磷酸化的GSK-3β及Bcl2相关启动子,导致Bcl2在线粒体膜上解离,继而抑制细胞凋亡[12,13]。有研究报道指出,AKT对GSK-3β活性的抑制可以调节肿瘤细胞凋亡[14];PI3K/Akt信号通路可以通过调控下游哺乳动物mTOR,促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭[15,16],磷酸化的mTOR可以通过Ser473和SGK1(S422)直接激活AKT,调控细胞增殖及凋亡[17]。本实验结果显示和枢消积方可下调人SMMC-7721细胞中P-AKT、P-GSK-3β及P-mTOR蛋白水平,故认为和枢消积方促进SMMC-7721细胞凋亡机制与AKT/GSK-3β/mTOR信号通路相关。研究显示AsTP3在口腔癌中呈高表达,加入PI3K抑制剂能下调AsTP3表达[18],且过表达AsTP3能上调P-Akt、沉默结果与之相反[5]。故认为和枢消积方抗癌及促进细胞凋亡的作用可能与通过靶向AsTP3抑制AKT/GSK-3β/mTOR信号通路有关,但其如何调控AsTP3及具体作用位点尚未明确,不排除还存在其他信号通路协同抗癌。

综上,本研究为和枢消积方的临床运用提供了科学的理论基础,为中医治疗SMMC-7721提供了新思路,但本研究仅从细胞分子层面证明,尚缺乏动物研究论证,仍需进一步探讨和枢消积方如何下调AsTP3表达抑制AKT/GSK-3β/mTOR信号通路。已有研究表明,AsTP3与钙网蛋白及折叠蛋白相结合,可以增加癌细胞的化疗药物抗耐药性[19],这为我们后续研究提供了新思路。