“复方常青”对鸡柔嫩艾美耳球虫感染的疗效

杜 鹏,杨佳佳,向万江,王艺舟,3,罗天麻 ,鲜思美,3*,王 碧,3*

(1.贵州大学动物科学学院,贵州贵阳 550025;2.贵州省动物疫病研究室,贵州贵阳 550025;3.贵州省动物生物制品工程技术研究中心,贵州贵阳 550025)

鸡球虫病对养鸡行业每年造成的经济损失高达35亿美元[1]。其中柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)致病力最强,主要危害 15～50日龄雏鸡,并专性寄生于鸡的盲肠上皮细胞,引起的疾病又称盲肠球虫病;临床主要表现为贫血、盲肠肿大、腹泻便血、生长迟缓和突然死亡,带球虫成年鸡一般不发病,但是其为主要传染源[2-3]。E.tenella还能诱发雏鸡机体炎症损伤,造成白介素6(interleukin 6,IL-6)、白介素17(interleukin 17,IL-17)、γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)和白介素10(interleukin 10,IL-10)等炎性细胞因子异常变化[4-6]。

近年来治疗鸡球虫病以地克珠利、马杜霉素、妥曲珠利、磺胺类等化学药物为主。化学药物防治效果明显,但长期使用会造成严重的耐药性[7],导致食品安全问题突出[8]。鸡球虫疫苗在一定程度上减少了球虫病的暴发,但使用不当导致毒力恢复的风险增加,并且疫苗具有局限性,对不同地区及不同毒株难以同时具有良好的保护效果[9]。

中药因具有来源广泛、不产生耐药性、药物残留低及使用安全等优势而成为国内外研究的热点[10],但中药各类繁多且不同组方之间的疗效缺乏系统比较。因此,本研究前期借鉴人医循证医学的成功经验[11-12],以存活率为结局指标,检索中国知网(CNKI)和PubMed数据库中有关中药组方治疗E.tenella的相关文献,用Stata.15软件对纳入的文献进行网状Meta分析,经Rank疗效排序发现以“常山”作为君药构建组方,对提高雏鸡存活率的作用最大;再依据鸡球虫病的中兽医辩证治疗理论配制出以常山为君药的组方“复方常青”,通过构建E.tenella感染模型,使用该组方进行治疗,从病鸡的增重情况、料肉比、盲肠病变、每克盲肠内容物卵囊数、存活率、抗球虫指数(anti-coccidial index,ACI)及细胞因子稳态的变化等多方面来评价该组方的治疗效果,以期为筛选安全高效的抗球虫中药以及对中药抗球虫机制的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验药物 复方常青由常山、青蒿、黄芪、柴胡、地榆、白茅根、陈皮、仙鹤草和炙甘草组成,购自贵州省贵阳市太升中药市场。地克珠利(100 mL/瓶),购于安徽省合肥市千方动保公司。

1.1.2 主要试剂 鸡IL-10、IL-17、酶联免疫吸附(ELISA)检测试剂盒,上海酶免生物科技公司产品。

1.1.3 主要仪器 旋转蒸发仪,郑州生化仪器有限公司产品;全自动酶标仪,美国BioTeK Instruments公司产品;改良麦克马斯特虫卵计数板,上海碧欧环境仪器公司产品。

1.1.4 试验动物及球虫孢子化卵囊 220只黄羽肉鸡(1日龄)购于贵州大学动物养殖场,在严格消毒无球虫的环境下饲养,且饲料饮水中不含任何抗球虫成分。E.tenella孢子化卵囊由中国农业大学动物医学院刘贤勇老师赠送,置于25 g/L重铬酸钾溶液于4℃冰箱避光保存,每3个月经鸡体复壮1次。

1.1.5 中药制备 将青蒿、柴胡、陈皮等中药浸泡30 min,用旋转蒸发仪收集挥发油及活性成分。药渣与常山、地榆加入3～5倍的水再煮沸并文火维持30 min,过滤,重复煮制3次,滤液混合浓缩至每1 mL含生药1 g,调pH7.0制成中药原药,装瓶灭菌后放置于4℃冰箱备用。

1.2 方法

1.2.1 试验分组 攻虫之前,逐羽称重,剔除过大过小、体弱的雏鸡,再随机分为6组,进行整体称重调整,使每组体重基本相等;分别设为复方常青高、中、低剂量组(A、B、C),地克珠利组(D),不给药也不攻虫的阴性对照组(E),攻虫不给药的阳性对照组(F),每组3个重复,每个重复10只雏鸡。

1.2.2 球虫感染和给药方法 除E组外,15日龄,各组经口感染1×105个E.tenella孢子化卵囊。18日龄起,连续5 d给药治疗,A、B、C 3组以中药原药兑水给药,给药浓度分别为5、2.5、1 mL/L,D组以地克珠利溶液1 mL/L兑水给药。

1.2.3 增重变化及料肉比 分别于15日龄(攻虫前)、18日龄(攻虫3 d,连续给药前)、21日龄(攻虫6 d,连续给药3 d)、23日龄(攻虫8 d,连续给药5 d)、25日龄(攻虫10 d,停药2 d),对各组雏鸡进行称重,记录15～25日龄各组雏鸡的平均采食量。计算各组雏鸡平均增重、相对增重率及料肉比。

平均增重=停药2天体重-攻虫前的体重;

相对增重率=(各试验组增重率/阴性对照组增重率)×100%;

料肉比=平均采食量/平均增重。

1.2.4 每克盲肠内容物卵囊数及卵囊值 25日龄(攻虫10 d,停药2 d),断颈处死各组雏鸡,取出盲肠内容物并研磨均匀,按照麦克马斯特氏法计算各组每克盲肠内容物的卵囊数(oocysts per gramme,OPG)[10],卵囊值(0～40)参照文献[2]进行换算。

1.2.5 盲肠病变记分及病变值 25日龄(攻虫10 d,停药2 d),断颈处死各组雏鸡,逐羽观察盲肠病变,参照文献[13]对各组进行盲肠病变记分。盲肠病变分5个等级(表1);当两侧盲肠病变不一致时,以严重的一侧为准,因球虫死亡的雏鸡盲肠病变记4分。病变值=平均盲肠病变记分×10。

表1 盲肠病变记分标准

1.2.6 抗球虫指数判定标准 抗球虫指数(ACI)由存活率、相对增重率、病变值和卵囊值构成,当评价药物的疗效时,ACI>180时为优秀、160～180为良好、120～160为差、120以下为无效。

抗球虫指数(ACI)=(存活率+相对增重率)-(病变值+卵囊值)。

1.2.7 血清中细胞因子测定 分别于15日龄(攻虫前)、18日龄(攻虫3 d,给药前)、21日龄(攻虫5 d,连续给药3 d)、23日龄(攻虫8 d,连续给药5 d)、25日龄(攻虫10 d,停药2 d)翅下采血,室温下斜置20 min,3 500 r/min离心10 min,收集血清保存于-80℃冰箱。并按照鸡IL-17和鸡IL-10 ELISA试剂盒说明书的操作步骤进行检测。

1.2.8 数据处理与分析 结果数据先采用Excel进行整理,再用 SPSS 20.0软件进行单因素方差分析和多重比较,结果以“平均数±标准差”表示,P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 临床症状

攻虫前,雏鸡采食饮水正常,精神状况良好且生长速度较快。18日龄(攻虫3 d,给药前),雏鸡食欲下降,精神沉郁,怕冷扎堆,并排出伴有肠道伪膜的血便。部分雏鸡离群呆立,缩颈闭眼,肛周羽毛因附着干硬粪便,排便困难。F组部分雏鸡因长期不食,导致营养不良、生长缓慢或死亡。剖检死亡鸡可见盲肠肿大,内壁出血。治疗组在给药3 d后精神状态、食欲有所恢复,但生长速度减缓。整个试验期间E组雏鸡均无疾病表现。

2.2 对感染雏鸡增重情况及料肉比的影响

18日龄(攻虫3 d,给药前),各组雏鸡平均体重无显著差异(P>0.05)。21日龄(攻虫5 d,连续给药3 d),平均体重F组显著低于其他各组(P<0.05),治疗组中A、B与D组体重无显著差异(P>0.05)。23日龄(攻虫8 d,连续给药5 d),平均体重A、B、C组高于D组,且A组与E组差异不显著(P>0.05)。25日龄(攻虫10 d,停药2 d),平均体重A组、D组、E组差异不显著(P>0.05),且以A组获得的平均体重最大。试验结束后,各治疗组的平均增重、相对增重率、料肉比均显著优于F组(P<0.05),且A组、D组与E组的平均增重、相对增重率及料肉比差异不显著(P>0.05)(表2)。

表2 各试验组不同日龄体重、增重情况及料肉比

2.3 感染雏鸡盲肠病变记分及对OPG的影响

25日龄(攻虫10 d,停药2 d),治疗组的盲肠病变记分和OPG值均显著低于F组(P<0.05),且复方常青治疗组(A、B、C)的盲肠病变记分和OPG值均随着给药浓度的增加而减少;D组与C组的盲肠病变记分差异不显著(P>0.05),与A组的OPG值差异不显著(P>0.05)(表3)。

表3 各试验组盲肠病变记分及OPG值

2.4 复方常青抗E.tenella的效果研究

与F组相比,4个治疗组均具有抗球虫效果,B组与D组的治疗效果相近,而A组的抗球虫指数最高(ACI>180),并且结合存活率、相对增重率、病变值、卵囊值可见A组的抗球虫疗效最好(表4)。

表4 各试验组抗球虫指数

2.5 对感染雏鸡血清中细胞因子含量的影响

2.5.1 复方常青对血清中IL-10含量的影响 18日龄(攻虫3 d,给药前),与E组相比,攻虫组血清中IL-10含量出现下降,但差异不显著(P>0.05)。21日龄(攻虫6 d,连续给药3 d),与E组相比,F组血清中IL-10含量显著降低(P<0.05),而4个治疗组含量与E组接近(P>0.05)。23日龄(攻虫8 d,连续给药5 d),A、B、C 3组血清中IL-10含量高于E组,但差异并不显著(P>0.05)。25日龄(攻虫10 d,停药2 d),4个治疗组中,B组血清中IL-10含量最高(图1)。

同一日龄组间不同字母表示两组差异显著(P<0.05)

2.5.2 复方常青对血清中IL-17含量的影响 18日龄(攻虫3 d,给药前),与E组相比,各攻虫组血清中IL-17含量显著增高(P<0.05)。21日龄(攻虫5 d,连续给药3 d),与F组相比,各治疗组血清中IL-17含量均出现不同程度的下降;且B组血清中IL-17含量与E组相近(P>0.05)。23日龄(攻虫8 d,连续给药5 d),各治疗组血清中IL-17含量与E组相比差异不显著(P>0.05)。25日龄(攻虫10 d,停药2 d),血清中IL-17的含量各治疗组均显著低于F组(P<0.05),且C组相对于E组含量显著升高(P<0.05),而其他治疗组含量与E组差异不显著(P>0.05)(图2)。

3 讨论

中兽医学认为,鸡球虫病属于虫积范畴,为虚症,由外感虫邪引起的湿证所致[3],治疗应以清热解毒、凉血止痢、抗菌消炎、利水消肿为主,辅以补虚补气,健脾养胃、提升中气,增强机体免疫力[10]。本文以常山为 “君药”,具有清热燥湿、杀虫驱虫、止痢等功效[7];常山因含有常山碱、异常山碱及其衍生物常山酮等成分,可以抑制鸡球虫子孢子、第1和第2代裂殖子的入侵,因此对抵抗多种球虫感染有良好作用[14-15]。以青蒿、白茅根、地榆为臣药,具有清热生津、凉血止血止痢、利尿通淋的功效[16],君臣相辅起着主要的抗球虫病作用;青蒿中含有青蒿素,具有抑制鸡球虫第2代裂殖子微线基因,促进第2代裂殖子凋亡的功效,从而能够减少卵囊产生,抑制球虫感染引起的炎症反应[7]。用补足脾阳、凉血止血、清除肝火的药物柴胡、仙鹤草、苦参、黄芪和厚朴作为“佐药”,协助抗球虫药物发挥作用的同时,具有补中益气、升举阳气、助消化、破疮排脓、利水消肿、抗病原微生物、增强机体免疫力等功能;柴胡的主要成分是柴胡皂苷,具有抗肿瘤、抗过敏、抗凋亡和免疫调节作用[17]。此外,还能抑制促炎细胞因子TNF-α和IL-17等表达,提高抗炎细胞因子IL-10和转化生长因子等的表达[18]。黄芪含有黄芪多糖,具有抗病毒、调节免疫力、抗氧化等生物学功能,还能促进生长性能的提高[8]。以陈皮、炙甘草为使药,陈皮具有理气健脾、燥热去湿的作用,炙甘草能补脾和胃、益气复脉及调和诸药[19-20]。因此,该方剂在抑制球虫、提高机体免疫力的同时,还表现出促进生长发育的作用。

雏鸡攻虫后,表现出食欲下降、精神萎靡、抱团取暖、排血便等典型症状,死亡雏鸡盲肠肿大、内壁出现大量血斑,这与之前的研究结果一致[8]。四个治疗组均能减轻E.tenella所引起的临床症状,且以A组症状最轻微。与F组相比,各治疗组的料肉比较低、相对增重率高,其中A组的料肉比最低、相对增重率最高,说明A组具有良好的促生长作用,这可能与黄芪、陈皮等中药的促生长和促消化作用相关[8,19]。A、B组的存活率及抗球虫指数(ACI)均高于D组,说明本研究中A、B两组的疗效较好,且以A组的抗球虫疗效(ACI>180)最佳。

血清中细胞因子会受肠道炎症的影响[21],IL-10是由多种细胞释放的抗炎及免疫抑制效用细胞因子,在原生动物和蠕虫感染时控制着炎症反应的性质和程度,并且能够抑制TNF-α、IL-6、IL-17等的分泌,起到稳定肠道黏膜环境的作用[22]。而IL-17是由CD4+T细胞、T淋巴细胞所释放的促炎细胞因子,不仅参与黏膜上皮免疫屏障对抗病原微生物,还使中性粒细胞、淋巴细胞等免疫细胞在炎症部位积累,引起组织病理学变化[23]。本研究中,与E组相比,18日龄,给药前,攻虫组血清中IL-10含量下降,IL-17显著上升(P<0.05),说明攻虫后,肠道环境遭到病原微生物入侵,黏膜上皮免疫屏障被破坏,机体免疫稳态失去平衡,诱发了肠道炎症,这与之前的研究相符。21日龄,连续给药3 d,治疗组血清中IL-10含量显著高于F组(P<0.05),IL-17出现不同程度下降,说明此时在药物的作用下机体炎症得到缓解;其中B组血清中IL-10、IL-17含量均恢复到E组的水平(P>0.05),说明该药物在此浓度下见效快,这可能与组方中青蒿、黄芪、柴胡等药物增强免疫和缓解炎症功能有关[10,17]。23日龄,连续给药5天,四个治疗组血清中IL-10与IL-17均恢复到正常水平,与E组无显著差异(P>0.05),说明药物刺激了机体产生免疫反应,促进了抗炎因子的释放,减少了促炎因子的释放,维持机体免疫的稳态,且B组表现出的抗炎效果最佳。25日龄,停药2 d,C组血清中IL-17含量相对于E组显著上升(P<0.05);而A、B两组仍表现为高水平的免疫稳态,且与E组无显著差异(P>0.05),说明复方常青在低浓度下用药时间应该延长,以维持机体的免疫稳态。

本文综合评价了复方常青的治疗效果,该方剂可增加平均体重,降低料肉比,提高存活率,减轻盲肠病变,减少OPG,提高ACI,刺激机体产生免疫应答,增强自身免疫力;复方常青高剂量组(A)的抗球虫效果最佳,中剂量组(B)的抗炎效果最佳。为抗球虫中药的筛选、组方及应用提供了参考,也为后期进行中药抗球虫病机制的研究奠定了基础。