3种流产剂对大鼠妊娠干预作用的比较研究

王祈帆,买占海,张晓松,纪 鹏,魏彦明*

(1.甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070;2.新疆农业大学动物医学院,新疆乌鲁木齐 830052)

自然流产(spontaneous abortion,SA)是指非人为因素引发的流产,其发病因素繁多,主要包括母胎免疫失衡、内分泌失调、性激素分泌不足等[1]。其中Th1/Th2失衡使母胎免疫功能紊乱,是导致流产的主要因素之一[2],而外源性雌激素、孕酮、促乳素等在妊娠期间可调节母胎免疫失衡问题,随着激素的增加,Th1细胞的活性降低、炎性细胞因子分泌减少[3]。米非司酮是一种孕激素受体拮抗剂,凭借对孕酮受体的高亲和力和孕酮竞争结合受体,使孕酮失活引起流产[4];溴隐亭是通过降低促乳素的浓度,间接引起孕激素降低,增强Th1型细胞因子的亢进,使Th1/Th2平衡偏向Th1型,最后引起流产[5];脂多糖则是通过诱发子宫内膜炎症引起流产或胚胎吸收[6]。

建立稳定、可控的动物流产模型,有助于研究自然流产发病机制。本研究选用米非司酮、溴隐亭和脂多糖分别建立动物流产模型,对妊娠大鼠的生殖生理、肝、肾功能的变化进行研究,比较不同流产剂对SD大鼠妊娠的干预及肝肾损伤,为探究流产疾病发病机制及药物对后代生长发育的影响和中药方剂防治妊娠母畜流产的临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级SD雌性大鼠24只,180 g左右;SD雄性大鼠12只,250 g左右;[生产批号SCXK(甘)2021-0001],由中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心提供。昼夜各半循环照明,自由采食饮水7 d后开始试验,试验获甘肃农业大学实验动物伦理委员会批准。

1.1.2 主要试剂 米非司酮片(国药准字:H10950003),紫竹公司产品;甲磺酸溴隐亭片(国药准字:HJ20160170),佰莫亭公司产品;脂多糖,北京索莱宝科技有限公司产品;雌二醇(estradiol,E2)、白细胞介素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)、白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)、孕酮(progesterone,P)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor- alpha,TNF-α)、ELISA试剂盒,上海酶联生物科技有限公司产品;山羊抗兔二抗试剂盒、免疫组化抗原修复缓冲液、DAB显色液,中杉金桥生物技术有限公司产品;兔源抗大鼠NF-κB p65一抗,博奥森生物技术有限公司产品;兔源抗大鼠ER一抗,武汉三鹰公司产品。

1.1.3 主要仪器 Olympus DP-71显微照相系统(BX51+DP71),日本Olympus公司产品;正置显微镜(13395H2X),德国徕卡公司产品;全自动生化分析仪(Chemray 800),深圳雷杜生命科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 孕鼠检测 SD大鼠适应性饲养7 d后,于第7 d下午18时雌雄比例2∶1合笼,次日上午9时左右开始孕检。将有阴栓或阴道分泌物涂片有大量无核片状角质化上皮细胞和精子者判定为妊娠第1天。

1.2.2 试验分组 妊娠大鼠随机分组,分别设立空白对照组、米非司酮组、溴隐亭组和脂多糖组,每组6只。空白对照组按0.8 mL/kg注射生理盐水外,其余各组均于妊娠第6～8天上午8:30进行背部皮下注射药物,米非司酮组3.75 mg/kg(1 mg/mL),溴隐亭组0.4 mg/kg(0.4 mg/mL)注射75%无水乙醇溶解的溴隐亭,脂多糖组0.8 mg/kg(0.5 μg/mL)注射脂多糖溶液,每日下午18:00观察孕鼠状态。若阴道有少量出血,且孕鼠状态烦躁易怒,则表明流产模型建立成功[7]。

1.2.3 血液生化指标测定 腹主动脉采血后于室温放置2 h,3 000 r/min离心15 min,取上清,用全自动生化分析仪测定各组大鼠血清中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、血尿素(UREA)以及血肌酐(creatinine,CREA)等血液生化指标。血液生化指标。

1.2.4 血清中炎性细胞因子和孕激素水平测定 酶联免疫试剂盒检测血清中TNF-α、IL-2、IL-12、IL-6、IL-1β、雌激素、孕酮和促乳素等,具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.2.5 病理组织学观察 取固定于40 mL/L甲醛溶液中的子宫、肝脏组织,流水冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、HE染色、封片。

1.2.6 子宫组织中NF-κB p65、ER蛋白表达 取子宫组织石蜡切片,脱蜡后用柠檬酸盐修复液进行抗原热修复,一抗NF-κB p65(1∶150)、ER(1∶200)37℃孵育1 h,山羊抗兔二抗试剂盒孵育二抗,DAB显色,苏木素复染,梯度酒精脱水、二甲苯透明,封片。

1.2.7 数据处理与分析 本试验结果图用GraphPad Prism5.0软件制作,统计学分析用SPSS 22.0统计软件对各组间数据进行单因素方差分析,比较采用LSD法,试验数据以“平均值±标准差(Mean±SD)”表示,P<0.01表示差异极显著,P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 不同流产剂引起大鼠流产率比较

不同流产剂引起大鼠流产模型的妊娠结局相关指标见表1。 米非司酮组和溴隐亭组的流产率明显高于LPS组,超过50%;与空白对照组相比,其余各组大鼠子宫连胎重均显著降低(P<0.05)。表明米非司酮和溴隐亭的致流产作用较强,优于脂多糖。

表1 各组孕鼠妊娠结局相关指标

2.2 各组大鼠血清中血液生化指标

与空白对照组相比,米非司酮组的ALT、AST和ALP水平显著增加(P<0.05),溴隐亭组的AST和ALP水平显著增加(P<0.05),脂多糖组的ALT和ALP水平显著增加(P<0.05);脂多糖组的UREA和CREA显著降低(P<0.05),其他各组无显著性差异(P>0.05)。表明3种流产剂均会对SD大鼠的肝功能造成不同程度的损伤,其中米非司酮对SD大鼠肝功能损伤最严重,脂多糖还会对SD大鼠的肾功能造成严重损伤(图1)。

K.空白对照组;MFST.米非司酮组;XYT.溴隐亭组;LPS.脂多糖组;*P<0.05

2.3 各组大鼠血清中炎性细胞因子水平

与空白对照组相比,米非司酮组大鼠血清中IL-2和各模型组大鼠血清中TNF-α、IL-12、IL-1β、IL-6均显著增加(P<0.05)。表明不同流产剂均会导致炎性细胞因子水平升高,从而引发炎症(图2)。

图2 各组大鼠血清中TNF-α、IL-2、IL-12、IL-6和IL-1β的水平

2.4 各组大鼠血清中孕激素的水平

与空白对照组相比,米非司酮组和脂多糖组大鼠血清中的雌激素水平显著降低(P<0.05),溴隐亭组大鼠血清中的雌激素水平极显著降低(P<0.01);其余各组大鼠血清中孕酮水平均显著降低(P<0.05),脂多糖组大鼠血清中的促乳素水平显著降低(P<0.05),溴隐亭组大鼠血清中的促乳素水平极显著降低(P<0.01),米非司酮组有所降低,但无显著性差异(P>0.05)(图3)。说明不同流产剂对孕激素的分泌均有抑制作用。

图3 各组大鼠血清中E2、P和PRL的水平

2.5 各组大鼠子宫组织中NF-κB p65和ER的表达

空白对照组中有ER表达,且主要表达在子宫组织细胞核上,部分表达于胞浆中,其他各组的ER表达则不明显;各组均有NF-κB p65的表达,主要表达在子宫组织的细胞核中,胞质中也有表达,且与空白对照组相比,各流产模型组的表达更为强烈。说明不同的流产剂均对ER表达有抑制作用,对NF-κB p65表达则有促进作用(图4)。

A.空白对照组; B.米非司酮组; C.溴隐亭组; D.LPS组

2.6 各组大鼠病理组织形态学观察

空白对照组中央静脉血管周围肝细胞索排列整齐,肝细胞核、肝窦清晰可见,且散落少许红细胞;米非司酮组肝细胞索间肝窦变窄几近消失,且布有红细胞,肝细胞肿胀,有充血、淤血现象;溴隐亭组部分肝细胞索间间隙减小,散落有少量红细胞,细胞核清晰可见;脂多糖组肝细胞肿胀、变圆,胞浆中有颗粒状物质,存在颗粒变性现象,此外,肝窦变窄几近消失,且散落有红细胞。空白对照组的子宫内膜结构层次清晰完整,腺体丰富;米非司酮组的腺体数目显著减少,腺腔变得狭长,子宫内膜变薄;溴隐亭组的子宫内膜显著变薄,腺腔扩张;脂多糖组的腺体数目明显减少,腺腔闭合(图5)。表明不同流产剂均会对肝组织和子宫组织造成不同程度的病理学损伤,其中以溴隐亭组的肝损伤较轻。

A1、B1、C1、D1.肝组织(400×);A2、B2、C2、D2.子宫组织(100×);A1～A2.空白对照组;B1～B2.米非司酮组;C1～C2.溴隐亭组;D1～D2.脂多糖组;灰色箭头表示散落的红细胞;绿色箭头表示肝细胞肿胀;黑色箭头表示肝细胞索间隙减小;橙色箭头表示颗粒变性;蓝色箭头表示子宫内膜

3 讨论

3.1 不同流产剂对大鼠流产率的影响

自然流产是妊娠母畜在妊娠期间由于某些因素引发的妊娠中断[8]。不同流产剂导致大鼠流产率为:脂多糖的致流产率为33.3%,米非司酮和溴隐亭的致流产率为50%以上,表明米非司酮和溴隐亭对妊娠大鼠的致流产效果更好。

3.2 不同流产剂对大鼠血液生化指标的影响

血液生化检测中ALT、AST和ALP均属于肝功能变化的主要评定指标,ALT、AST和ALP升高则表明肝功能受到了损伤[9]。本试验结果显示,与空白对照组相比,各模型组的ALT、AST和ALP的水平均有不同程度的增加,病理组织学显示溴隐亭组有轻微肝损伤,而米非司酮组和脂多糖组表现有严重肝损伤。UREA、CREA是检测肾功能损伤的常用指标,UERA、CREA降低则表明肾功能受损[10]。本试验结果显示,与空白对照组相比较,脂多糖组的UREA和CREA显著降低,说明脂多糖可引起严重的肾损伤。

3.3 不同流产剂对大鼠血清炎症因子表达的影响

母体妊娠期间母胎界面处于促炎因子和抑炎因子动态平衡的免疫微环境,可建立起母体对半同种异体胚胎的耐受性,使胚胎免受母体的免疫排斥[11]。Th1型细胞分泌Th1促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12等,介导细胞免疫、炎症反应,促炎细胞因子的分泌增多,Th1/Th2平衡向Th1型偏移,抑制胚胎发育,危害胎儿生存,进而导致流产[12]。Th2型细胞分泌Th2抑炎细胞因子如IL-4、IL-10等,主要通过激活产生B细胞抗体以介导体液免疫,拮抗Th1促炎细胞因子,最后达到维持妊娠的目的[13]。本试验结果显示,与空白对照组相比,各模型组的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12和米非司酮组的IL-2水平显著增加(P<0.05),表明各模型组中Th1型细胞细胞因子呈现不同程度的增加,Th1/Th2平衡向Th1型偏移,提示各流产剂可能是通过促进Th1促炎细胞因子的分泌以改变Th1/Th2平衡的途径导致流产发生,这与兽医临床实践中家畜流产的主要原因相一致[14]。

3.4 不同流产剂对大鼠血清激素水平表达的影响

孕酮和雌激素均为维持妊娠所需的重要激素,主要由妊娠黄体和胎盘分泌,维持妊娠的Th2型细胞因子的产生有关[15];催乳素可以促进卵泡发育成熟、提高子宫内膜容受性,还有助于促进胚胎着床、维持妊娠[16],常用于评估女性卵巢功能[17]。本研究发现各模型组的孕激素水平与空白对照组相比均呈现不同程度的降低,这与吴燕红研究结果相一致[18],表明了孕激素对于妊娠成功和维持妊娠的重要性。

3.5 不同流产剂对大鼠子宫组织中NF-κB p65和ER表达的影响

雌激素通过结合激活ER,调节ER介导的NF-κB等炎症相关通路[19-22],抑制IL-1β、IL-6和TNF-α分泌,促使Th1/Th2平衡向Th2偏移,以维持正常妊娠[23]。与雌激素相比,孕酮对Th1型细胞分泌的Th1促炎细胞因子的下调作用更加明显[24]。催乳素可以通过抑制NF-κB通路活化,下调NF-κB水平,间接抑制TNF-α、IL-6、IL-1β的产生[25],使Th1/Th2平衡向Th2型偏离,从而维持妊娠。本试验结果表明,各模型组与空白对照组相比ER表达不明显,而NF-κB p65有较高的表达,与文献[26]的研究结果一致。表明各流产剂可能通过降低孕激素,抑制ER表达,从而促进NF-κB p65磷酸化,促进TNF、IL-6、IL-1β的产生,引发炎症反应,使Th1/Th2平衡向Th1型偏离,从而抑制胚胎发育,导致流产。

不同流产剂均可通过降低孕激素水平抑制ER激活,活化NF-κB通路,促进NF-κB p65磷酸化和TNF、IL-6、IL-1β的产生,使Th1/Th2平衡向Th1型偏离,从而引发炎症反应,抑制胚胎发育导致流产。其中,米非司酮和溴隐亭的致流产作用更强,流产率超过50%,且溴隐亭对母体肝肾损伤小于米非司酮,更适用于建立流产模型进行相关研究。