6株禽源滑液囊支原体分离株的分子生物学鉴定及MSPB蛋白原核表达

孙佳琳,司朵朵,王建东,李继东,李生虎,何生虎*

(1.宁夏大学动物科技学院,宁夏银川 750021;2.宁夏农林科学院动物科学研究所,宁夏银川 750002;3.宁夏职业技术学院,宁夏银川 750000)

支原体属于柔膜纲,缺少细胞壁,现已发现120余种支原体,其中有20种的宿主是禽类和鸟类,其禽滑液囊支原体(Mycoplasmasynoviae,MS)是重要的禽类病原体之一,能引起家禽呼吸道疾病,滑膜炎和气囊炎[1]。尽管MS的基因组和蛋白质组较小,但可保留在高度进化的宿主中并引起慢性感染,这与其膜蛋白与宿主的相互作用密不可分,其中一些蛋白能黏附宿主细胞,是宿主免疫反应的主要靶标[2]。

MS蛋白质组的主要蛋白质是参与新陈代谢和蛋白质加工,如磷酸丙酮酸水合酶,伴侣蛋白(DnaK和触发器因子,伸长因子(EF-Tu/EF-G)以及脂蛋白[3]。对MS的分泌蛋白进行分析,发现了包含6-磷酸果糖激酶和转录延伸因子GreA在内的8种未鉴定过的分泌蛋白[4]。有研究对ULB 02/P4和ULB 02/OV6株的免疫原性蛋白进行鉴定,得出N-末端测序鉴定出17个滑液囊支原体蛋白,其中有14种是以前未鉴定的主要的高表达蛋白质,包括一些酶,伴侣蛋白和推定的脂蛋白[5]。其中鉴定出的vlhA基因,在翻译后裂解产生一个氨基末端部分(MSPB)和一个羧基末端部(MSPA),两种产物都是抗原可变,但只有MSPA能介导MS与红细胞的结合[6]。MSPB富含编码PRR的串联重复序列,且不同菌株的MSPB蛋白的分子质量大小不同,可以诱导鸡巨噬细胞产生NO、IL-6和IL-1 β[7]。有研究对比了以MS-H MSPB与WVU-MSPB为研究对象,对其反应原性进行测定,发现MS-H MSPB具有抗原变异性,在检测针对MS-H疫苗株的抗体时比WVU-MSPB 更为敏感[8]。本研究对6株MS分离株进行同源性分析,分析MS分离株与相关滑液囊支原体参考株的亲缘关系;MSPB基因测序后,对其蛋白序列进行生物信息学分析,对MSPB进行功能预测;随后,对MSPB进行表达,鉴定其反应原性。为禽滑液囊支原体感染的诊断和治疗提供靶标蛋白。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、载体和主要试剂 NX-3、NX-4,NX-5、NX-6 、NX-7、NX-10 滑液囊支原体菌株,来自宁夏不同鸡场疑似MS感染鸡,NX-10株来自陕西省某鸡场疑似MS感染鸡,MS菌株经宁夏大学动物科技学院临床兽医实验室分离培养,并进行细菌学鉴定和动物感染试验,表明病原特性稳定。

1.1.2 主要试剂 原核表达载体pET-30a(+)质粒由宁夏大学动物科技学院临床兽医实验室保存;大肠埃希氏菌BL21(DE3)、细菌基因组 DNA 抽提试剂盒、PCR 相关反应试剂,均为天根生化科技(北京)有限公司产品;电泳试剂,北京索莱宝科技有限公司产品;改良Frey培养基,北京中海生物科技有限公司产品;核酸内切酶和T4 DNA连接酶,美国NEB公司产品;DNA聚合酶、蛋白电泳所需溶液及PBS缓冲液,均为上海索莱宝生物科技有限公司产品; MS阳性血清抗体从MS感染病鸡采集分离,经ELISA试剂盒检测鉴定并保存;辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鸡IgG,生工生物工程(上海)股份有限公司产品;蛋白纯化试剂盒,康为世纪生物科技有限公司产品;BCA定量试剂盒,赛默飞世尔科技有限公司产品;AEC显色试剂盒和PVDF膜,上海索莱宝生物科技有限公司产品。

1.1.3 仪器 高速冷冻离心机,德国Beckman公司产品;PCR仪,杭州博日公司产品;电泳仪,北京六一生物科技有限公司产品;全自动凝胶成像系统,美国UVI公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据MS 1853WVU参考株16S rRNA以及宁夏本地株的MSPB基因序列,用引物设计软件Primer 5设计PCR引物,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 引物序列

1.2.2 MS的培养 将冻存的菌液经0.22 μm的无菌滤膜过滤除去杂菌、再接入改良Frey液体培养基中,37℃摇床振荡培养1周后进行基因组提取。

1.2.3 MS基因组的提取 分别取MS菌液3 mL,12 000 r/min离心1 min,弃上清,取沉淀用细菌基因组试剂盒提取目的基因组,-20℃冻存备用。

1.2.4 16S rRNA和MSPB基因的PCR扩增 以提取的MS基因组DNA为模板,分别扩增16S rRNA和MSPB基因序列:16SrRNA基因PCR反应体系为:2×TaqMix 25 μL,上、下游引物各1 μL(10 mmol/L),DNA模板3 μL,dd H2O 20 μL。16SrRNA基因PCR反应条件:95℃ 2 min;95℃ 30 s,49℃ 20 s,72℃ 2 min,30个循环;72℃ 8 mim。

MSPB基因各片段序列PCR反应体系均为:Prime STAR HS DNA Polymerase 0.5 μL,5×Prime STAR buffer 10 μL,上、下游引物各1 μL(10 mmol/L),dNTPS mixture 4 μL ,DNA模板2 μL,dd H2O 32.5 μL。MSPB基因全长序列PCR反应体系为:Prime STAR HS DNA Polymerase 0.5 μL,5×Prime STAR buffer 10 μL,上、下游引物各1 μL(10 mmol/L),dNTPS mixture 4 μL ,DNA模板:片段12 μL、片段24 μL、片段32 μL、片段43 μL,dd H2O 32.5 μL。MSPB基因PCR反应条件:95℃ 2 min;95℃ 30 s,56℃ 20 s,72℃ 2 min,30个循环;72℃ 8 min。PCR产物送北京中美泰和生物技术公司测序。

1.2.5 分子进化树构建 从NCBI上获取滑液囊支原体标准株及其他支原体的16SrRNA基因序列,用MEGA7.0软件中的邻接法(neighbor-joining,NJ)程序构建系统进化树。将6株MS的16SrRNA基因序列利用进行Blast在线比对,然后选取序列一致性较高部分禽类或鸟类易感的支原体16SrRNA基因序列,按照上述方法构建分子进化树,进行遗传进化分析。

1.2.6 MSPB功能预测分析 将测序所得的MSPB序列用软件DNA Star分析氨基酸序列的氨基酸组成、疏水性等理化性质;用NetPhos3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)在线进行磷酸化位点的预测分析;用EMBOSS中Octanol、Tmap软件对其疏水区、跨膜区进行分析;用SignalP-5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对该蛋白的信号肽进行预测;用PSORTb(https://www.psort.org/psortb/)对其亚细胞定位进行预测;用NetNGlyc 1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/)对其潜在糖基化位点进行分析。

1.2.7 MSPB重组蛋白的原核表达 通过PCR技术扩增MSPB基因,并突变其中的TGA密码子以适应大肠埃希氏菌表达系统的密码子使用规律。将目的基因克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒,导入大肠埃希氏菌表达菌株BL21(DE3)中进行诱导表达和鉴定。诱导表达过程,首先采用1、0.8、0.5 mmol/L的IPTG后,再用合适浓度的IPTG进行后续试验

1.2.8 重组蛋白的纯化及鉴定 用含有0.1 mmol/L的PMSF的裂解酶对菌体进行裂解,低温高速离心后,弃上清,收集沉淀,超声破碎,待包涵体释放蛋白后,再用镍柱纯化系统对MS MSPB重组蛋白进行纯化。纯化产物进行Western blot分析(一抗采自MS阳性鸡血清,二抗为Abbkine公司的HRP,Goat Anti-Chicken IgG),检测其与MS特异性抗体的反应性。

2 结果

2.1 16S rRNA序列PCR 扩增结果

以6株MS分离株基因组DNA为模板,以16SrRNA的引物进行PCR扩增,核酸凝胶结果显示产物大小为1 479 bp(图1),和预期相符。

M.DNA标准DL 2 000;1.NX-3; 2.NX-4; 3.NX-5; 4.NX-6; 5.NX-7; 6.NX-10; 7.对照

2.2 MSPB序列PCR扩增结果

用 TaKaRa的高保真酶扩增获得含突变点的MSPB基因片段,分别扩增出与预期大小959、93、334、102 bp相一致的4条片段(图2)。将最终产物回收后得到与预期大小1 419 bp相一致的片段(图3)。送上海生工生物工程技术服务有限公司测序,结果显示测序正确,并且各个点突变也均正确。

A.各区段PCR结果; M.DNA标准DL 2 000; 1.MSPB-F1/MSPB-R1引物扩增产物; 2.MSPB-F2/MSPB-R2引物扩增产物; 3.MSPB-F3/MSPB-R3引物扩增产物;4.MSPB-F4/MSPB-R4引物扩增产物。 B.Overlap PCR扩增结果;M.DNA标准DL 2 000;1.PCR产物

图3 16S rRNA系统进化树

2.3 分子进化树构建结果

以16SrRNA基因序列构建的分子进化树显示(图3), NX-3、NX-4、NX-5、NX-6、NX-7、NX-10属于同一亚群位于同一分支上,与MS标准株同在一大分支上,属于同一群,亲缘关系较近,与参考株WVU 1853及改造后的疫苗株MS-H亲缘较远。

2.4 MSPB序列分析结果

根据结果可知MSPB共有466个氨基酸,其中强碱性氨基酸47个,占10.09%;强酸性氨基酸62个,占13.30%;疏水性氨基酸168个,占36.05%,极性氨基酸133个,占36.05%。分子质量大小约为50 ku,等电点为4.739。MSPB含有的Thr磷酸化位点最多,大约23个,其次是ser磷酸化位点,大约16个,Tyr磷酸化位点最少,为4个(图4)。对其信号肽分析结果可知,预测在MSPB N端含有一段含25个氨基酸脂蛋白信号肽(Sec/SPII)序列(图5),概率为0.9711。MSPB糖基化位点分析,得到T36、T73、T359、T361可能为糖基化位点(图6)。MSPB亚细胞定位及跨膜螺旋区分析显示,MSPB无跨膜螺旋区域,定位在细胞内膜上。

图4 磷酸化位点分析

图5 信号肽分析

图6 糖基化位点分析

2.5 重组表达质粒pET30a-MSPB鉴定结果

重组质粒菌落PCR法鉴定,以培养过夜的菌液基因组为模板,能扩增出一条与符合大小的条带(图7),初步对菌落进行了筛选。对鉴定阳性的菌落培养后提取质粒,并进行双酶切鉴定,经核酸电泳分析为阳性并测序正确的命名为pET30a-MSPB(图8)。

M.DNA标准DL 2 000;1～6.不同标号的菌液PCR鉴定结果

2.6 MSPB重组蛋白纯化及Western blot鉴定结果

1、0.8、0.5 mmol/L的IPTG对MSPB蛋白的表达量影响不大(图9),用0.5 mmol/L的IPTG进行后续试验(图10)。通过对表达的MSPB重组蛋白进行分离纯化,得到一条大小约为70 ku的蛋白(图11)。纯化后MSPB蛋白经转膜、一抗、二抗杂交后,避光显色。结果显示MSPB重组蛋白能与一抗发生特异性结合(图12)。

M.蛋白分子质量标准;1～6.分别为1、0.8、0.5、0.3、0.1 mmol/L的IPTG诱导表达产物;6.空白对照

3 讨论

禽滑液囊支原体感染后无法治愈,且我国近几年感染率逐年攀升,所以免疫接种是禽滑液囊支原体病的主要防控措施。要研制高效疫苗,必须弄清其流行菌株的血清型或主要保护性抗原蛋白的基因类型。MSPB是滑液囊支原体主要的免疫原性膜蛋白,并且不同菌株的MSPB针对不同菌株感染的阳性血清的敏感性不一样[9]。因此对滑液囊支原体本地株外膜蛋白MSPB结构功能分析以及免疫原性进行研究,可进一步增加针对该病原体免疫诊断和疫苗候选抗原的认识。

基于16SrRNA基因序列所构建的分子进化树表明,6株病原分离株与数据库中登录的MS菌株亲缘关系较近,具有同源性,因此可以从分子水平确定6株分离菌株为MS菌株。对MSPB蛋白序列的生物信息学分析表明,MS的MSPB属于酸性蛋白质,富含磷酸化位点,其中Ser磷酸化位点最多,Tyr磷酸化位点最少,含有一个Sec/SpⅡ信号肽和四个潜在性糖基化位点定位于膜上,与MSPB是MS的一个膜蛋白这一结果相符合;以默认的阈值(0.4)对其进行保护性抗原预测,得分为0.764 8,这些均与MSPB作为主要膜抗原且具有免疫原性的性质相吻合[10]。成功表达出MSPB重组蛋白,但实际表达出来的大小较预测大,为约70 ku。导致重组蛋白实际大小与预测大小有出入的原因很多,如重组蛋白是否需要剪切活化,剪切活化造成蛋白变小;蛋白质形成二聚体或多聚体以及蛋白质表达后有修饰也会导致蛋白质增大;除上述原因外,SDS-PAGE时蛋白的净电荷也会影响迁移率,如富含酸性氨基酸在电泳液的pH下带正电荷,SDS不能消除正电荷的影响,阻碍蛋白的泳动;以及富含脯氨酸的蛋白会在SDS-PAGE胶中移动得特別慢,两者均会使蛋白质变大。但因本试验使用原核表达系统,上述前三种情况存在的可能性很小,并且经查验在该蛋白序列中,酸性氨基酸约占总氨基酸的13.3%,碱性氨基酸较酸性氨基酸少,约占10.3%,等电点为4.8;所以猜测蛋白质变大可能是由于富含脯氨酸造成的,并且MSPB重组蛋白其中一段富含脯氨酸,这与其他研究给出的MSPB是包含一段富含脯氨酸的蛋白质结论一致,并且这种差异,可能解释了表观分子质量和预测分子质量之间的差异[11-12]。此外,研究使用SDS-PAGE凝胶电泳和免疫印迹成功地对MSPB的性质进行了测定,与MSPB是滑液囊支原体最具抗原性的区域特异性表面蛋白之一理论相符[11-12]。本研究对MS分离株进行了分子水平的鉴定,并分析了重要膜蛋白MSPB,同时预测MS编码的主要膜抗原相关功能,并对其进行鉴定,为地方MS ELISA检测抗原的制备提供了参考。