QuEChERS-UPLC-MS/MS同时测定畜禽肉中23种驱虫类药物残留量

■ 张 彤 徐宜宏 付海滨 刘 俊 史喜菊 徐蕾蕊 康明芹 张 敏

（1.沈阳农业大学工程学院，辽宁沈阳 110866；2.沈阳海关技术中心，辽宁沈阳 110016；3.成都海关技术中心，四川成都610041；4.中国海关科学技术研究中心，北京 100026；5.长春海关技术中心，吉林长春 130062)

驱虫类药物包括驱虫药、抗虫药和杀虫药等，能够有效预防和治疗各种虫害，如在植物种植过程中通常通过喷洒驱虫类药物来预防虫害，在畜禽动物饲养的过程中，养殖者也会通过给畜禽服用驱虫类药物来消灭畜禽体内的蛔虫、线虫等有碍畜禽健康的虫类。驱虫类药物的种类很多，如用于治疗梨形虫病、边虫病、锥虫病和附红细胞体病的咪唑类药物[1]，以及异噁唑啉等用于宠物驱虫的新型外驱寄生虫药[2]，阿维菌素类药物对线虫有较强的作用[3]，虽然驱虫类药物对畜禽养殖有不可或缺的作用，但是错误使用也会造成巨大的危害，近期就有一起因驱虫类药物使用不当导致山羊中毒的病例报道[4]。而且养殖户给动物驱虫时使用的咪唑类药物，会刺激细胞的有丝分裂，长期使用具有潜在的致癌危害。一般情况下，通过休药期使药物在动物体内代谢完全，否则动物体内的药物残留量过大，会给食用者的身体健康带来危害[5-7]。随着对肉类质量安全水平要求的逐渐提高，建立快速、准确检测市售畜禽肉中驱虫类药物残留的分析方法显得十分必要。

目前，现行国家标准中，SN/T 3144—2011《出口动物源食品中抗球虫药物残留量检测方法 液相色谱-质谱/质谱法》利用硅胶固相萃取柱的净化方式可同时检测动物源性食品中19 种抗球虫类药物。该方法的测定限为0.005～0.050 mg/kg；GB 31613.5—2022《食品安全国家标准 鸡可食性组织中抗球虫药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》利用胰蛋白酶酶解、C18固相萃取柱净化同时检测7 种抗球虫类药物。该方法的检出限为5 μg/kg，定量限为10 μg/kg。而在相关文献中，驱虫类化合物的检测种类比较单一，巩婧婷等[8]利用C18固相萃取柱提取技术测定鸡蛋和鸡肉中氯苯胍的含量，检出限为5.0 μg/kg；陈彤等[9]利用HLB 固相萃取柱提取技术检测了猪肉中两种驱虫药，方法的检出限为1.22～1.25 μg/kg；李晓岩等[10]利用分散固相萃取法（QuEChERS）提取净化，测定动物肝脏中左旋咪唑的含量，检出限为10 μg/kg。综上可见，现阶段缺乏同时检测畜禽肉中多种驱虫类药物的分析方法。而且多数检测方法中普遍应用的是固相萃取法，与QuEChERS 提取法相比更加耗时耗力，检测成本也更高[11-12]。本研究根据药物对虫类的作用强弱进行了分类，选择对虫类作用性强的药物进行了检测分析，建立了一种有效的液相色谱-串联质谱分析方法，可同时测定畜禽肉中23 种驱虫类药物的残留量，显著提高了检测效率，为畜禽肉中驱虫类药物残留量的监测提供了有力的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

UPLC-MS/MS-8060 超高效液相色谱串联质谱仪（日本岛津公司)、Genie PURIST TOC 超纯水系统（上海乐枫生物科技有限公司）、BSA2202S 电子天平（德国赛多利斯公司）、MGS-2200 氮吹仪（东京理化公司）、X1 离心机（德国赛默飞世尔公司）、MX-S 涡混仪（北京大龙公司）。

吡喹酮（Praziquantel）、左咪唑（Levamisole）、敌百虫（Trichlorfon）、乙氧酰胺苯甲酯（Ethopabate）、仲丁威（Fenobucarb）、双硫磷（Temephos）、右旋烯丙菊酯（Allethrin）、莫能菌素（Monensin）、克洛索隆（Clorsulon）、苯硫胍（Febantel）、氟苯哒唑（Flubendazole）、罗苯哒唑（Lobendazole）、氯氰碘柳胺（Closantel）、氯羟吡啶（Clopidol）、二硝托胺（Dinitolmide）、双羟萘酸噻嘧啶（Pyrantel Pamoate）、氯苯胍（Robenidine hydrochloride）、三氮脒（Diminazene）、酒石酸锑钾（L-Antimony potassium tartrate）、地克珠利（Diclazuril）、盐酸氨丙啉（Amprolium hydrochloride）、癸氧喹酯（Decoquinate）、杀虫脒（Chlordimeform）等23种驱虫类药物，均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司，纯度≥96%；乙腈、甲醇均为色谱纯；乙酸、乙酸钠、QuEChERS净化盐包[含有5.0 g无水硫酸镁、2.50 g C18和2.50 g 活性炭（carb）]，0.22 μm滤膜，均购自美国迪马公司。

1.2 样品的制备

畜禽肉样品，采自沈阳周边农贸市场和批发市场。每份样品均不少于500 g，用绞肉机充分绞碎，混匀后装入洁净的密封容器内，-18 ℃避光密封保存。

1.3 样品提取与净化

准确称取5 g（精确至0.01 g）样品，置于50 mL离心管中，加入15 mL 乙腈振荡提取20 min，0～4 ℃10 000 r/min 离心10 min，将上清液移取至干净的离心管中，用15 mL的乙腈重复提取剩余残渣1次，合并上清液，待净化。

将上清液加入含QuEChERS 盐包的离心管中，涡旋混匀。0～4 ℃、10 000 r/min离心10 min。准确吸取上清液20.0 mL，氮吹至近干，然用1.0 mL 乙腈+水（1+1）溶液溶解残渣，过0.22 μm 滤膜后，供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.4 样品分析

1.4.1 色谱条件

色谱柱：岛津C18（100 mm×2.1 mm，2.0 μm）；样品室温度：4 ℃；柱温：40 ℃；进样体积：2.0 μL；流速：0.30 mL/min；流动相（乙腈+0.1%甲酸水）梯度：10+90（0 min）→50+50（3 min）→70+30（8 min)→100+0(11 min)→100+0(13 min)→10+90(13.01 min)→10+90（16 min）。

1.4.2 质谱条件

离子源：ESI；DL 管温度：250 ℃；加热块温度：400 ℃；接口温度：300 ℃；接口电压：3.0 kV；雾化气流速：3.0 L/min；干燥气流速：10.0 L/min；加热气流速：10.0 L/min。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 流动相的选择优化

比较了有机相（甲醇和乙腈）与水相（纯化水、5 mmol/L乙酸铵、0.1%甲酸水、含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸铵水溶液）的不同组合对23 种驱虫类药物分离度的影响。结果表明，以乙腈+0.1%甲酸水溶液作为流动相时，23种驱虫类药物经梯度洗涤后完全分离且具有更好的色谱峰形和更高的灵敏度，因此，本研究选择乙腈+0.1%甲酸水作为流动相，此流动相条件下23种驱虫类药物的总离子流见图1。

图1 23种驱虫类药物的总离子流

2.1.2 质谱条件的优化

首先对浓度为0.1 μg/mL 的23 种驱虫类药物的单标标准液进行全扫描，根据峰高、峰形以及信噪比等因素确定母离子、定性离子和定量离子，然后在质谱多反应监测（MRM）模式下，对第一阶段电压（Q1 Pre Bias）、第三阶段电压（Q3 Pre Bias）和碰撞电压（CE）进行参数优化，最终确定质谱参数，如表1所示。

表1 23种驱虫类药物的质谱参数

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 提取溶剂的选择

根据有关文献和标准可知，驱虫类药物在有机溶剂中更加稳定。本研究比较了乙腈和甲醇作为提取溶剂时23 种驱虫类药物的回收率（见图2）。结果表明，乙腈作为提取溶剂时，23 种驱虫类药物的回收率为69.4%～92.5%，和甲醇作为提取溶剂的回收率（47.6%～74.0%）相比具有明显提升。因此，本研究采用乙腈作为提取溶剂。

图2 不同提取液时23种驱虫类药物的回收率

2.2.2 净化方法的选择

QuEChERS 是目前药物残留检测中常见的净化手段，考虑到畜禽肉中可能存在油脂、蛋白质、色素以及一些特殊的杂质，本研究选择具有吸附油脂和蛋白质作用的C18固相萃取柱，吸附色素的Carb 固相萃取柱，以及吸附一些极性强杂质的氨基固相萃取柱与QuEChERS 进行比较，找出净化畜禽肉最适用的方法。本研究以鸡肉和猪肉基质为例，对比了上述几种净化方法的净化效果，结果见表2。根据表2 可知，采用几种固相萃取柱净化的23 种驱虫类药物其回收率明显低于QuEChERS 净化的回收率。这是因为QuEChERS 净化盐包中同时使用了三种净化材料，可以更充分地净化样品，而固相萃取柱因为成分比较单一，净化得不够充分，且吸附性更强，导致的回收率偏低。而使用QuEChERS 净化的23 种驱虫类药物其回收率稳定为65.6%～97.3% 。故本研究采用QuECh-ERS净化盐包为净化手段。

表2 不同净化方法下23种驱虫类药物的回收率(%)

2.2.3 基质效应（ME）

为了确保定量结果的准确性，基质效应也是需要考察的关键因素。图3 和图4 分别列出了23 种驱虫类药物在鸡肉和猪肉中的基质效应。结果表明，23种驱虫类药物在两种基质中均存在明显的基质效应，且在鸡肉和猪肉中基质效应并不相同，如仲丁威和双硫磷在鸡肉中具有机制抑制效应，但是在猪肉中具有基质增强效应。因此，本研究根据检测基质的不同采用不同的空白基质加标曲线来校正，以克服基质效应所带来的影响。

图3 23种驱虫类药物在鸡肉中的基质效应

图4 23种驱虫类药物在猪肉中的基质效应

2.3 方法学验证

将空白基质按1.2 处理，并配制混合工作曲线。23 种驱虫类药物的曲线范围见表3。以被测组分的浓度为横坐标，被测组分的峰面积为纵坐标拟合工作曲线，得到相关系数。确定方法的定量限，并在同一天检测6 批次相同添加浓度的样品，然后利用6 个试验结果计算保留时间和峰面积的日内偏差，然后在第1 天到第6 天每天在相同时间检测同一添加浓度的6 个样品，利用6 个试验结果计算其保留时间和峰面积的日间偏差，结果见表3。结果表明，23 种驱虫类药物的相关系数均高于0.993 2，回收率为71.4%～107.5%，变异系数为0.9%～8.8%。根据10 倍信噪比（S/N）确定定量限为0.2～1.0 μg/kg。

表3 23种驱虫类药物的方法学验证相关数据

2.4 实际样品检测

用本研究的方法分别对沈阳市及周边市场上的畜禽肉进行23 种驱虫类药物的检测，其中包括20 批次猪肉、20 批次牛肉、20 批次鸡肉以及20 批次鸭肉，共80 份。结果80 份畜禽肉中23 种驱虫类药物的测定值均在合理范围内，表明畜禽养殖户均在合规饲养，没有违规使用驱虫药的情况。

3 结论

本研究建立了同时测定畜禽肉中23 种驱虫类药物的超高效液相色谱－串联质谱法，23种驱虫类药物的方法定量限为0.2～1.0 μg/kg。该定性定量分析方法简便、快速、灵敏、重现性好，符合分析要求。可以同时检测23 种驱虫类药物在畜禽肉中的残留。扩大了驱虫类药物检测的基质以及检测种类，降低了定量限，具有一定的创新和推广价值。