紫象草原花青素的大孔吸附树脂纯化、平均聚合度及体外抗氧化活性测定

■ 冉思蛟 王元龙 倪海花 刘赛格 瞿秋涵 康馨月 高彦华

（西南民族大学畜牧兽医学院，动物科学国家民委重点实验室，青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室，四川成都610041）

原花青素（proanthocyanidins，PACs）是存在于多种植物的种子、花、茎、叶的一类植物多酚（plant polyphenol，PP）[1]，也是一种重要天然抗氧化剂[2]。研究发现，原花青素能有效控制糖尿病大鼠体内的铁代谢紊乱，减弱氧化损伤[3]，调节高脂日粮饲喂小鼠肠道菌群，降低体脂的过度堆积[4]。动物生产中，在生长猪饲粮中添加150 mg/kg 原花青素，也能增加背最长肌肌苷酸的含量和肌内脂肪的沉积[5]。在肉鸡饲粮中添加原花青素能显著降低AA 肉鸡右侧胸肌肌肉剪切力，提高肌肉干物质含量，改善肉质[6]，表明原花青素对保障动物健康和产品品质具有重要作用。

紫象草也称红象草（Pennisetum purpureumSchumab cv.Red），营养价值较高[7]，将其青贮或调制成青干草，与精料共同饲喂时适口性强，有助于增加动物消化率[8-9]，适用于草食动物[10]。紫象草是重要的天然PP 来源，其茎叶呈现鲜明的紫红色，叶片中存在花色苷和原花青素的生物合成途径[11]。以紫象草叶片为原料能够成功制备具有抗氧化活性的花色苷[12]和原花青素[13]。然而，目前尚未见关于紫象草原花青素的纯化条件、平均聚合度测定及纯化物的体外抗氧化功能的研究。因此，本试验以原花青素B2 含量为考察指标，采用大孔吸附树脂纯化紫象草原花青素粗提物，探究纯化树脂类型、洗脱剂浓度、上样体积、洗脱体积4 个单因素对紫象草提取物中原花青素B2 质量浓度的影响，得到纯化条件并制备紫象草原花青素纯化物，再利用盐酸-香草醛法测定紫象草原花青素提取物与纯化物的平均聚合度，并测定提取物与纯化物的体外抗氧化活性，为充分利用紫象草来源的饲草资源、将其开发为天然有效抗氧化剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

紫象草采自四川新津国家牧草实验站。

对-（二甲基氨基）肉桂醛（DMAC），纯度≥98%，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；儿茶素、表儿茶素、原花青素B2 标准品（纯度≥98%），均购自上海源叶生物科技有限公司；甲醇、香草醛（均为AR 分析纯），购自成都市科龙化学品有限公司；D101 大孔树脂、HP-20 大孔树脂、ADS-17 大孔树脂，均购于生工生物工程（上海）股份有限公司。

Sorvall ST 8R 高速冷冻离心机，购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；SpectraMax iD3多功能酶标仪，购自美谷分子仪器（上海）有限公司；RG-3000A 旋转蒸发仪，购自上海亚荣生化仪器厂；LYOQUEST-85冷冻干燥机，购自泰事达科技公司；φ2.6 cm×30.0 cm 玻璃层析柱、DBS-100 电脑全自动部分收集器，购自上海沪西分析仪器厂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 紫象草样品的预处理

紫象草前处理参照文献[14-16]的方法并略作调整。对紫象草不同部位进行切割，将紫象草于65 ℃烘干至恒重，粉碎、过40 目筛。紫象草粉与正己烷按照1∶5（g/mL）混合，浸提3 h，用纯化水清洗残留的有机溶剂，于65 ℃烘箱烘至恒重，得到脱脂紫象草粉。采用响应面分析法得到紫象草原花青素提取物的最佳提取条件，按照料液比为1∶12（g/mL）加入80%乙醇（V/V），室温超声（400 W）浸泡提取60 min，53 ℃水浴56 min，通过0.22 μm 有机相尼龙滤膜，取上清液旋转蒸发去除乙醇，经冷冻干燥15 h 后，即得紫象草原花青素粗提物，置于-80 ℃冰箱备用（图1）。

图1 试验用紫象草样品

1.2.2 紫象草原花青素B2 标准曲线的绘制及含量的测定

参照黄雪松等[17]的方法，现配现用0.1%（g/mL）DMAC 酸性乙醇溶液（纯化水∶乙醇∶盐酸=25∶150∶25，V/V/V）。参照刘赛格等[13]的方法制备原花青素B2标准溶液10 mg/mL 并将其梯度稀释至5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.02 mg/mL。在500～700 nm 处利用SpectraMax iD3多功能酶标仪进行全波长扫描确定最大吸收波长。将40 μL 原花青素B2 梯度稀释液与120 μL DMAC 溶液加样于96 孔板，室温避光，静置30 min，于最大吸收波长处测定OD 值，绘制原花青素B2 的标准曲线，建立其线性回归方程。计算紫象草提取物的原花青素B2含量。

原花青素B2含量（mg/g）=（X×V×D）/M

式中：V——上清液体积（mL）；

X——提取物中原花青素B2质量浓度（mg/mL）；

M——称取的草粉质量（g）；

D——溶解液的稀释倍数。

1.2.3 大孔吸附树脂的预处理

根据文献[18-20]预处理方法，为去除合成过程中困在孔隙中的单体和致孔剂[21]，将3 种型号的大孔吸附树脂D101、ADS-17、HP-20（见表1）在200 mL 乙醇浓度为95%（V/V）的溶液中室温避光浸泡24 h，水洗至无醇味，采用5%盐酸溶液浸泡3 h，水洗至中性，在2%氢氧化钠溶液中浸泡3 h，水洗至中性，45 ℃烘至恒重，置于4 ℃保存备用。

表1 3种型号的大孔吸附树脂性能参数对比

1.2.4 大孔吸附树脂纯化紫象草原花青素提取物的单因素试验

大孔树脂的选择：采用静态吸附法，分别准确称量3 种已预处理至恒重的干燥树脂1 g 于 250 mL 锥形瓶，加入无水乙醇浸过树脂表面，静置15 min，水洗至无醇味，吸干表面残留的水分。之后加入50 mL（V1）、2 mg/mL 紫象草原花青素提取液（X1），室温避光，120 r/min，25 ℃振荡24 h，检测上清液中原花青素B2 含量（X2）。根据静态洗脱的原理，倒掉前期已吸附完全的树脂上清液，超纯水冲洗1 次，中性干燥滤纸吸去表面残存水分，加入95%（V/V）、50 mL 配置得到的乙醇溶液（V2），室温避光、严格密封，120 r/min、25 ℃振荡24 h，检测此时洗脱液中原花青素B2 含量（X3）。根据以下公式计算获得所有树脂类型对紫象草原花青素的吸附率、解吸率及回收率。

吸附率（%）=（X1-X2）×100/X1

解吸率（%）=X3×V2×100/[（X1-X2）×V1]

回收率（%）=X3×V2×100/（X1×V1）

式中：X1——提取物初始原花青素B2含量（mg/g）；

X2——提取物平衡时的原花青素B2含量（mg/g）；

X3——洗脱液原花青素B2含量（mg/g）；

V1——粗提物稀释液体积；

V2——洗脱液乙醇体积。

洗脱浓度的选择：准确称取上述探究得到的最优树脂1 g 于250 mL 锥形瓶中，通过静态吸附原理，将2 mg/mL 紫象草原花青素提取液（X1）置于锥形瓶中，避光，摇床120 r/min，25 ℃振荡24 h，测定各洗脱浓度下紫象草原上清液中原花青素B2 质量浓度（X2）；根据静态洗脱的原理，依次倒掉静态吸附完全的树脂上清液，去离子水冲洗1 次，中性滤纸吸去表面水分，分别加入50%、70%、90%、95%（V/V）乙醇溶液50 mL，避光、严格密封，摇床120 r/min、25 ℃振荡24 h，测定洗脱液中原花青素B2 含量（X3），按照公式计算解吸率，并绘制洗脱剂浓度与解吸率的动态柱形效果图。

上样体积的选择：采用动态吸附法，按照湿法装柱，将上述试验探究获得的最优树脂装入φ2.6 cm ×30.0 cm 玻璃层析柱中，将2 mg/mL 紫象草原花青素粗提物溶液，以1.5 mL/min 的流速上样，利用DBS-100全自动部分收集器连接恒流泵定时定量收集流出液，每48 mL流出液收集1管，测定每管流出液原花青素B2 含量，绘制上样体积与流出液原花青素B2 质量浓度动态曲线。

洗脱体积的选择：利用上述确定的最优树脂类型及上样体积进行动态吸附，待吸附平衡，用去离子水冲洗上样后的层析柱至流出液无色，再按照上述探究得到的最优乙醇浓度以1.5 mL/min 的流速洗脱，利用DBS-100 全自动部分收集器收集洗脱液，每5 mL 洗脱液收集1 管，测定每管洗脱液原花青素B2 含量，最后绘制洗脱体积与洗脱液原花青素B2 含量的动态曲线。

1.2.5 紫象草原花青素粗提物的萃取分离

参照文魁山[22]的粗提物萃取方法，将1.8 g 紫象草原花青素粗提物和180 mL 超纯水混合，待完全溶解后，转移至1 000 mL梨形分液漏斗中，加入540 mL（3倍体积）的乙酸乙酯，室温振荡萃取60 min，于4 ℃冰箱静置12 h，待溶液分层，进行分液。使用以上方法萃取3次，将3次萃取的乙酸乙酯相和水相合并，经旋转蒸发、冷冻干燥，得到乙酸乙酯相和水相冻干粉。

1.2.6 儿茶素标准品甲醇体系和乙酸体系全波长扫描及标准曲线的建立

参考文魁山[22]的方法配制显色液1 并建立儿茶素-甲醇反应体系。制备10 mg/mL 的儿茶素标准品母液并将其用甲醇2倍比稀释，得到质量浓度为5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 3、0.078 1、0.039 1 mg/mL

的标准品稀释液。在400～700 nm 处进行全波长扫描，得到紫象草原花青素香草醛-盐酸-甲醇体系下反应后溶液的最大吸收波长。按照各浓度标准品稀释液∶显色液1=1∶5（V/V）加入96 孔板，25 ℃水浴避光静置15 min。以甲醇+显色液1 为空白对照，于最大吸收波长A 测定吸光度，以吸光度为纵坐标、儿茶素标准品稀释液浓度为横坐标，利用GraphPad Prism 8.3绘制标准曲线并建立线性回归方程。

参考文魁山[22]的方法配制显色液2 并建立儿茶素-乙酸反应体系。制备10 mg/mL的儿茶素标准品母液并将其利用乙酸2倍比稀释，得到质量浓度为5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 3、0.078 1、0.039 1 mg/mL的标准品稀释液。在400～700 nm 处进行全波长扫描，得到紫象草原花青素香草醛-盐酸-乙酸体系下反应后溶液的最大吸收波长。按照各浓度标准品稀释液∶显色液2=1∶5（V/V）加入96 孔板，20 ℃水浴避光静置反应10 min，以乙酸+显色液2 为空白对照，以最大吸收波长测定吸光度，以吸光度为纵坐标、儿茶素标准品稀释液浓度为横坐标，绘制标准曲线并建立线性回归方程。

1.2.7 紫象草原花青素提取物的平均聚合度测定

采用盐酸-香草醛法测定紫象草原花青素提取物的平均聚合度。按照1.3.6 的方法测定原花青素质量含量和物质的量数值，将标准品稀释液替换并配制为紫象草原花青素粗提物、纯化物、水相、乙酸乙酯相以及表儿茶素、儿茶素、原花青素B2 标准品-甲醇稀释液，分别测定其与显色液1 反应后溶液的吸光度显色液2 反应后溶液的吸光度，代入儿茶素-甲醇体系和儿茶素-乙酸体系线性回归方程，计算得到质量含量和物质的量数值。将紫象草原花青素粗提物、纯化物、乙酸乙酯相、水相、表儿茶素、儿茶素、原花青素B2 标准品的质量含量和物质的量数值代入公式，获得各提取物的平均聚合度。

平均聚合度=m/（Mn）

式中：m——原花青素的质量（μg）；

M——标准品单体儿茶素的相对分子质量308.28；

n——样品的物质的量（μmoL）。

1.2.8 紫象草原花青素纯化物的体外抗氧化活性测定

参考刘赛格等[13]的方法测定紫象草原花青素纯化物的体外抗氧化活性，根据下列公式计算紫象草原花青素提取物对DPPH·和·OH的清除能力。

DPPH·清除率（%）=[A空白-（A样品-A对照）]/A空白]×100

·OH 清除率（%）=（B测定-B对照）÷（B空白-B对照）×100

式中：A空白——未加提取物时DPPH·自由基溶液的吸光值；

A样品——提取物或维生素C 与DPPH·反应后溶液的吸光值；

A对照——提取物或维生素C 与未加DPPH·反应液的吸光值；

B空白——未加提取物和有色反应试剂液体系的吸光值；

B测定——提取物与反应液体系的吸光值；

B对照——反应液与同体积的纯化水反应后溶液的吸光值。

1.2.9 数据处理与统计分析

每组试验均设置3 个重复，采用Excel 2013 进行数据整理，根据SPSS 22.0 的一般线性模型中的单因素ANOVA 检验分析和球形检验分析，P<0.05 为差异显著，图表采用GraphPad Prism 8.3进行绘制。

2 结果与分析

2.1 原花青素B2标准品的全波长扫描图谱及标准曲线

原花青素B2 标准品在500～700 nm 处的全波长扫描最大吸收波长为640 nm，标准曲线在质量浓度0～0.25 mg/mL内线性关系良好，其回归方程为：

y=9.482 4x-0.068 8（R2=0.99）

式中：x——原花青素B2标准质量浓度；

y——吸光值。

2.2 大孔吸附树脂纯化紫象草原花青素提取物的单因素试验结果

2.2.1 树脂类型对原花青素的吸附率、解吸率与回收率的影响

由图2（a）可知，D101、HP-20 型树脂对紫象草原花青素的吸附率均在80%左右，吸附效果显著高于ADS-17 型树脂（P<0.05）。由图2（b）可知，D101 型树脂对紫象草原花青素的解吸率为98.59%，解吸效果显著高于HP-20、ADS-17 型树脂（P<0.05）。由图2（c）可知，D101 型树脂对紫象草原花青素的回收率为80.56%，显著优于其他2 种树脂类型（P<0.05）。综合分析吸附率、解吸率和回收率结果，确定D101 为纯化树脂类型。

图2 3种型号的大孔吸附树脂对紫象草原花青素的吸附、解吸与回收效果的影响

2.2.2 洗脱浓度对原花青素解吸率的影响

由图3 可知，随着乙醇浓度的增加，大孔吸附树脂对紫象草原花青素的解吸效果显著提高，洗脱剂浓度为90%，显著高于50%和70%（P<0.05），浓度为95%时解吸率与90%比提升不显著（P>0.05），因此洗脱剂浓度确定为90%乙醇。

图3 洗脱剂浓度对紫象草原花青素B2质量含量解吸率的影响

2.2.3 上样体积对原花青素吸附效果的影响

由图4 可知，流出液中原花青素B2 含量呈现“S”型变化趋势。上样体积小于480 mL，流出液中原花青素B2 质量浓度随上样体积增加，当上样体积大于480 mL，流出液中原花青素B2 质量浓度基本保持在0.002 0 mg/mL，且随着上样体积增加差异不显著（P>0.05），因此确定480 mL为上样体积。

图4 上样体积与流出液中原花青素B2含量的动态曲线

2.2.4 洗脱体积对原花青素吸附效果的影响

由图5 可知，随着洗脱体积的增加，洗脱液中原花青素B2 质量浓度呈现先增加后降低的趋势，当洗脱体积为20 mL 时，洗脱液中原花青素B2 质量浓度达到最大，为0.12 mg/mL。当洗脱液体积大于155 mL时，洗脱液中原花青素B2 质量浓度虽然继续下降并接近0，但差异不显著（P>0.05），因此确定155 mL为洗脱体积。根据确定的树脂类型、洗脱浓度、上样体积和洗脱体积制备了紫象草原花青素纯化物。

图5 洗脱体积与流出液原花青素B2含量的动态曲线

2.3 平均聚合度的测定

由图6、图7 建立了儿茶素-甲醇体系和儿茶素-乙酸体系测定平均聚合度的标准曲线，分别是y=0.35x+0.001 4、y=2.31x+0.015（R2=0.99，式中：x为儿茶素标准品质量浓度；y为吸光值），之后采用盐酸-香草醛法测定了表儿茶素、儿茶素、原花青素B2 标准品的平均聚合度，由表2 所示其平均聚合度分别为1.05、1.20、1.94。测定得到紫象草原花青素粗提物的平均聚合度为16.28，纯化物的平均聚合度为14.67，发现其粗提物和纯化物的聚合度均在15 左右，相差较小。紫象草原花青素粗提物萃取分离后，水相的平均聚合度为26.87，乙酸乙酯相的平均聚合度为13.63，发现其提取物中水相平均聚合度最高，乙酸乙酯相最低。

表2 紫象草原花青素提取物、纯化物、萃取相及各标准品的平均聚合度

图6 儿茶素-甲醇体系全波长扫描图谱及标准曲线

图7 儿茶素-乙酸体系全波长扫描图谱及标准曲线

2.4 紫象草原花青素纯化物的体外抗氧化试验结果

由图8可知，紫象草纯化物中原花青素B2质量浓度为0.05～100 mg/mL，对DPPH·清除能力随纯化提取物质量浓度的提高，呈现逐渐上升趋势。当纯化物中的原花青素B2 质量浓度为100 mg/mL 时对DPPH·清除能力最强，清除率达99.55%，与1 mg/mL 维生素C 的清除率相比显著提高（P<0.05）。当纯化物中的原花青素B2 质量浓度为3.13 mg/mL 时，清除率为96.51%，与1 mg/mL 维生素C 对DPPH·清除能力相当，两者之间无显著差异（P>0.05）。当粗提物中原花青素B2 质量浓度为100 mg/mL 时对DPPH·清除率为97.14%，与纯化物相比，其清除能力更低。

图8 紫象草原花青素提取物对DPPH·的抗氧化活性

由图9可知，紫象草纯化物中的原花青素B2质量浓度为0.39～100 mg/mL范围时，对·OH清除能力随其质量浓度提高，呈现上升趋势。当纯化物中的原花青素B2质量浓度为100 mg/mL时对·OH清除能力最强，消除率达97.72%，与1 mg/mL维生素C的清除率相比差异不显著（P>0.05），两者对羟自由基清除能力相当。当粗提物（CE）中原花青素B2 质量浓度为100 mg/mL时对·OH 清除率为80.17%，其清除自由基能力与纯化的紫象草原花青素相比差异显著（P<0.05）。

图9 紫象草原花青素提取物对·OH的抗氧化活性

3 讨论

3.1 紫象草原花青素提取物的大孔吸附树脂纯化

植物源原花青素直接提取的提取效率和含量较低。Sarmite 等[23]研究发现，落叶乔木灰胡芦巴、黑胡芦巴和山羊柳树皮的粗取物中均富含低聚原花青素，其原花青素提取率仅为12.3%～15.4%。刘赛格等[13]采用有机溶剂浸取法，测定得到紫象草粗提物中原花青素B2 的含量为5.06 mg/g。通过纯化处理能够提高原花青素的提取量。植物性活性成分粗提物的纯化方法，一般包括酶解、大孔树脂吸附、膜滤分离等方法，其中大孔树脂存在选择吸附特点和多孔结构组成，使样品提取液分离纯化到更多的有效成分或有效部位，最大限度地去除杂质，致所得提取物纯度高、品质好、杂质少[24]。谢青云等[25]研究发现，利用大孔吸附树脂纯化黄蜀葵花总黄酮，纯化后总黄酮的纯度为67.33%，提高了58.5%。本试验比较了3 种大孔吸附树脂对紫象草原花青素粗提物的静态吸附与解吸性能，发现D101 型大孔吸附树脂的吸附率和解析率最好。D101型树脂属于非极性物质，其孔径大小为25～28 nm、比表面积为480～550 m2/g，一定条件下能与原花青素紧密结合，与HP-20、ADS-17 型树脂相比，能吸附更多紫象草粗提物中的原花青素，纯化效果更好，表现出更好的回收率。王世鹏等[26]研究比较了D101、AB-8、RAS07 等8 种类型大孔吸附树脂对紫薯提取物中花青素的吸附效果，也发现D101 型吸附和解吸效果最好，与本试验结果相似。原花青素是花青素类物质的前体物，均易被弱极性或非极性类树脂回收。

原花青素属极性物质，氢键断裂数量随洗脱液体积浓度的增加而增加，其解吸率也随极性增强而逐渐提升，当乙醇体积浓度为90%时对紫象草原花青素的解吸效果最优，继续增加洗脱浓度，氢键几乎全部断裂，极性达到最大，解吸率虽有提高但不显著[27]。当上样体积达到480 mL 后，层析柱中的大孔吸附树脂孔径填充饱和，若继续上样，紫象草原花青素粗提物直接避开树脂流出，导致样品的浪费。吸附完全的树脂会随着洗脱体积的增大而逐渐解吸，解吸率先增加达到峰值后迅速降低，直至洗脱体积为155 mL 时流出液中原花青素B2 质量浓度接近0，继续洗脱，稀释先前所纯化的流出液，导致最终纯化效果变差。孙雨晴等[28]研究表明，采用D101 型大孔吸附树脂纯化石榴皮多酚提取条件，发现最优上样体积为300 mL，洗脱体积为120 mL，这与本试验结果类似。辛科颖等[29]研究发现，在响应面试验优化菟丝子总黄酮的纯化条件过程中，洗脱体积与洗脱剂浓度和上样体积之间无相互作用，而洗脱剂浓度与上样体积之间仅存在较弱的交互作用，优化纯化条件前后总黄酮含量差异不显著。靳铁柱[30]研究也发现，在响应面试验优化桑葚多糖的纯化条件过程中，上样体积、洗脱流速和洗脱体积三个因素之间无交互作用。上述研究表明，洗脱体积、洗脱剂浓度和上样体积之间互作影响较低，该三个因素进行优化试验对目标产物的获得无显著影响。因此，本试验采用单因素试验对洗脱剂浓度、上样体积和洗脱体积三个因素对紫象草提取物进行纯化时，并未进行纯化条件的响应面优化，并发现单因素试验获得的纯化条件下，紫象草提取物中的原花青素含量已经显著高于其粗提物，原花青素B2 质量浓度由纯化前10.01 mg/g提升至13.82 mg/g。

3.2 紫象草原花青素提取物的平均聚合度测定

原花青素的生物利用度随平均聚合度升高而显著下降，且生物利用度与生物学活性密切相关。Zhao 等[31]研究发现，当原花青素的平均聚合度≤4 时，它才能够被畜禽胃肠道有效吸收，表明低聚原花青素的生物学活性更强。对于植物提取物的聚合度一般采用香草醛法测定，但传统的香草醛法是仅以甲醇或乙酸为溶剂[32-33]，测定结果精度不高。本试验利用盐酸-香草醛法测定紫象草原花青素提取物的平均聚合度，这是因为甲醇和乙酸两种溶剂结合的方法简单快速，准确性最高。由于紫象草原花青素粗提物成分相对复杂，本试验利用有机溶剂萃取法，根据紫象草中不同成分在有机溶剂中溶解度不同进行分离提纯。此外，因原花青素易溶于极性溶剂，普遍选择中等极性的正丁醇或乙酸乙酯进行萃取分离，本试验选用乙酸乙酯作为萃取溶剂，因其具有使用更普遍、易于循环利用以及萃取率更高等特点[34]。文魁山等[22]研究发现，对葡萄籽原花青素粗提物进行乙酸乙酯萃取，发现水相的聚合度为5.65，而乙酸乙酯相聚合度为2.21。这与本试验结果一致，聚合度较低的均为乙酸乙酯相，相反为水相。同时，本试验结果表明，紫象草原花青素粗提物、纯化物、水相和乙酸乙酯相平均聚合度均较高，发现紫象草原花青素经大孔吸附树脂纯化后聚合度基本保持恒定，仅从16.28 降低到14.67，说明纯化过程对原花青素的聚合度几乎不影响。粗提物经萃取分离后的水相和乙酸乙酯相也均为高聚体，且具有一定的生物学活性，但生物利用度和生物活性相比低聚物相对较低，并不建议直接提取利用，可将原花青素高聚体解聚为低聚体，最大限度发挥紫象草原花青素的生物价值。

3.3 紫象草原花青素提取物的体外抗氧化活性测定

原花青素的抗氧化活性强，是一种良好的氧自由基清除剂[35]。Zhou 等[35]研究发现，葡萄籽原花青素具有抵御氧离子和约束脂质过氧化的活性，并且存在很强的体外抗氧化活性。Castillo等[36]研究还测定了5种具有自由基清除能力的物质，其中原花青素的体外抗氧化活性最强。因此，本试验通过芬顿（Fenton）反应及氧化还原反应过程生成稳定存在DPPH·和·OH，测定了紫象草原花青素纯化物的自由基清除能力，并与其粗提物中原花青素的抗氧化活性作比较，发现在质量浓度为100 mg/mL 时纯化物对 DPPH·和·OH 清除率分别为99.55%、97.72%，相当于1 mg/mL 维生素C，100 mg/mL 粗提物对DPPH·和·OH 清除率分别为97.14%、80.17%，纯化前后对DPPH·和·OH 都具有良好的自由基清除能力，但纯化提高了抗氧化活性。李晓洁等[37]研究发现，茶多酚提取物经大孔吸附树脂纯化后的总抗氧化能力、DPPH·和OH·清除的能力均显著增加，且纯度越高，清除自由基能力越强，这与本试验结果一致，为将紫象草开发为天然抗氧化饲料添加剂提供一定的理论依据。

4 结论

试验采用φ2.6 cm×30.0 cm 玻璃层析柱和D101型大孔吸附树脂，90%（V/V）乙醇浓度、上样体积为480 mL、洗脱体积为155 mL 对紫象草原花青素提取物进行纯化，纯化后的紫象草提取物的原花青素B2质量含量由纯化前10.01 mg/g 增加为13.82 mg/g，提升了36.06%。紫象草原花青素粗提物、纯化物、水相、乙酸乙酯相的平均聚合度分别为16.28、14.67、26.87、13.63。当紫象草原花青素纯化物质量浓度为100 mg/mL时，对DPPH·、·OH清除能力分别为99.55%、97.72%，显著高于紫象草原花青素粗提物。