39味中药及其复方对鸡源禽致病性大肠杆菌体外抑菌试验研究

2024-03-07王冠男周子凡寇宇宁陈春琴焦梦珍于忠娜

饲料工业 2024年3期

■ 赵双王冠男周子凡寇宇宁陈春琴焦梦珍于忠娜于雷

（青岛农业大学海都学院，山东莱阳 265200）

禽致病性大肠杆菌（APEC）属于肠道外致病性大肠杆菌中的一种，一年四季都可使不同日龄的鸡、火鸡等禽类罹患各种肠道外疾病。APEC 具有多种血清型，常见的血清型包括O1、O2、O78，其中O78 是优势血清型。APEC 可通过其毒力因子，例如黏附素、外膜蛋白、大肠杆菌素等诱发鸡感染大肠杆菌病[1]。根据Kathayat 等[2]的统计，鸡患大肠杆菌病后，可引起死亡率增加及饲料转化率、孵化率和蛋鸡产蛋量降低，对禽养殖业造成极大的经济损失。当前治疗该类疾病主要依赖于抗生素药物，但抗生素的滥用可能导致耐药性菌株的产生[3-4]，进而影响动物的免疫机能和畜产品药物残留等多方面健康问题。王颖[5]的研究表明，除头孢他啶外，畜禽对另外11 种抗生素耐药率均在60%以上。由于噬菌体能重新增强细菌对抗菌药物的敏感度，降低对抗生素的耐药作用[6-7]。近年来，有学者提出对细菌感染采取噬菌体治疗法，但噬菌体具有对生存环境要求苛刻、抗菌谱窄等局限性[7]。

在我国，中药以其增强免疫、毒性低、不易产生耐药性、价格低廉等特点被广泛应用于疾病的治疗。研究发现，黄酮类、生物碱类、萜类等中药活性成分对抑制大肠杆菌有显著效果[8]。本试验测定了黄柏、蒲公英等39 味中药及其复方中药对鸡源APEC O78 地方流行株的体外抑菌效果，旨在为制作抑制鸡大肠杆菌的中药制剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物

五味子、黄柏、蒲公英、红花、洛神花、决明子、石榴皮、丁香、莱菔子、北沙参、干姜、丹皮、陈皮、花椒、柴胡、何首乌、薏米仁、独活、连翘、山药、黄连、桔梗、金银花、桂皮、紫苏、桂枝、甘草、大青叶、黄芩、芦根、黄芪、荷叶、菊花、王不留行、玫瑰、桃仁、杏仁、神曲、大黄39 种中药饮片，均购自莱阳市枣行药店。

1.1.2 培养基

普通营养肉汤、普通营养琼脂和伊红美蓝培养基，均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

1.1.3 供试菌种和培养

鸡源禽致病性大肠杆菌O78，分离自烟台地区某鸡场送检的疑似大肠杆菌病的病死鸡，由青岛农业大学海都学院预防兽医学实验室鉴定并保存。

1.1.4 主要仪器

CJ2FD 净化工作台，购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；LYZ-2118 恒温摇床，购自上海龙跃仪器设备有限公司；XMTD-8222 隔水式培养箱，购自上海精宏试验设备有限公司；SQP 电子天平，购自北京赛多利斯科学仪器有限公司；TGL-16M 离心机，购自湘潭湘仪仪器有限公司；YXQ-LS-50A高压蒸汽灭菌锅，购自上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；打孔器直径7 mm 等常规的试验材料均由青岛农业大学海都学院预防兽医学实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 中药处理

分别称取各单味中药30 g，500 mL 纯化水浸泡30 min，放入砂锅中使用武火加热至沸腾后使用文火加热至100 mL，使用8 层纱布将中药过滤弃药渣，将药液加热浓缩至30 mL，即浓度为1 g/mL。40 ℃、3 000 r/min 离心40 min，取上清液，高压灭菌，4 ℃保存，备用。

1.2.2 培养基的制备

普通营养肉汤（LB 肉汤）、伊红美蓝培养基、普通营养琼脂培养基均按规定比例配制，121 ℃高压灭菌15 min，置于4 ℃冰箱，备用。

1.2.3 原菌液的制备

将APEC O78 菌株接种在伊红美蓝培养基中，37 ℃培养箱中培养14 h，待长出单菌落后挑取单菌落接种在普通营养琼脂，37 ℃培养箱中培养14 h，待长出单菌落后挑取单菌落接种在5 mL 肉汤，37 ℃、150 r/min 摇床中培养14 h。使用稀释平板法测定菌液浓度，将菌液用无菌水稀释制成10-1、10-2、10-3等浓度的稀释菌液进行平板培养，记录菌落数量，进行3 次平行试验，调整菌液浓度为3.5×106CFU/mL。

1.2.4 单味中药的抑菌试验

参考文献[9]，采用打孔法进行单味中药的抑菌试验，具体方法如下：吸取65 μL 菌液置普通营养琼脂中央，使用“L”型玻璃棒均匀涂布。使用7 mm的打孔器在普通营养琼脂上打孔，去除琼脂块，并用火焰封底，在孔内加满药液，在37 ℃培养箱中培养12～16 h，使用游标卡尺测量抑菌圈直径。每种药物进行3 次平行试验，每种药物的抑菌圈直径用“平均值±标准差”表示。

判定标准：平均抑菌圈直径≥20 mm 为高敏，9 mm≤平均抑菌圈直径<20 mm 为中敏，平均抑菌圈直径<9 mm为低敏。

1.2.5 复方中药的抑菌试验

选取抑菌效果较强的单方中药，均按1∶1 比例2.5 mL 置于相同试管混匀组成复方，抑菌试验方法同1.2.4。

1.2.6 单味中药最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的测定

参照文献[10]的二倍稀释法测定单味中药中抑菌试验结果为高度敏感与中度敏感中药的MIC。取11 支试管编号1～11，每支试管加入LB 肉汤5 mL，1 号试管加入药液5 mL 混匀，从1 号试管吸取5 mL 置于2 号试管，从2 号试管吸取5 mL 置于3 号试管混匀，以此类推到9 号试管，9 号试管弃去5 mL 混合液，11 号管加入5 mL 药液混匀，再弃去5 mL 混匀。将1～10 号试管放入50 μL 菌液（菌液浓度3.5×106CFU/mL），在37 ℃、150 r/min 摇床中培养14 h，肉眼观察，试管不浑浊的判定为细菌受到抑制作用，细菌受到抑制作用的最低药液浓度为MIC。

MBC 的测定参照文献[11]的研究，将MIC 试验中抑制细菌培养的混合物所对应的浓度药液，取75 μL 的混合物置于普通培养皿，使用“L”型玻璃棒均匀涂布，37 ℃培养箱中培养14～24 h，记录试验结果，将少于5 个菌落的药液浓度作为MBC。

1.2.7 复方中药MIC和MBC的测定

复方中药均按1∶1 比例5 mL 置于相同试管混匀，备用，其MIC和MBC测定步骤同1.2.6。

2 结果与分析

2.1 单味中药的体外抑菌试验结果

由表1 可知，39 种中药中有9 种对APEC O78 菌株有抑菌效果，其中APEC O78 菌株对五味子、黄柏、洛神花为高度敏感；对蒲公英、红花、石榴皮为中度敏感；对丹皮、何首乌、荷叶为低度敏感，其余30 种中药均表现为不敏感。

表1 单味中药的体外抑菌试验结果

2.2 复方中药的体外抑菌试验结果

参照表1 结果，选取4 种抑菌能力较强的中药进行复方配伍，分别为五味子、黄柏、洛神花、蒲公英，依次编号为B、T、L、P。由表2可见，复方中药对APEC O78菌株均有较强的体外抑菌效果，其中BL、TL、TP、BT 均为高度敏感，平均抑菌圈直径为20～30 mm；BP、LP均为中度敏感。

表2 复方中药的体外抑菌试验结果

2.3 单味中药MIC和MBC测定结果

由表3 可知，五味子、洛神花的抑菌和杀菌效果最优，其MIC 均为31.25 mg/mL，MBC 分别为62.50、125 mg/mL，蒲公英、黄柏、红花、石榴皮的MIC、MBC均大于或等于500 mg/mL。

表3 单味中药的MIC和MBC测定结果（mg/mL）

2.4 复方中药MIC和MBC测定结果

由表4 可知，复方中药中对APEC O78 菌株抑菌效果最好的为BL，即五味子+洛神花复方，其MIC 为31.25 mg/mL；其他依次为TL、LP、BP、BT、TP，MIC 分别为62.50、62.50、125、250、250 mg/mL。对APEC O78 菌株杀菌效果较强的为BL、LP，其MBC 均为125 mg/mL。

表4 复方中药的MIC和MBC测定结果（mg/mL）

3 讨论

鸡大肠杆菌病病型复杂，不同日龄和品种的鸡均可发生，是家禽养殖业中发病率最高、造成经济损失占比最大的疾病。因此治疗鸡大肠杆菌病尤为重要。目前鸡大肠杆菌病多采用抗生素疗法，常用的抗生素包括β-内酰胺类阿莫西林、头孢氨苄和氨基糖苷类抗生素庆大霉素等[12-14]。其中阿莫西林、头孢氨苄通过干扰细菌细胞壁的合成达到抑菌效果[15-16]，庆大霉素的抑菌机理是破坏基因翻译过程[17]。但抗生素的普遍使用会导致耐药菌株的产生，增大治疗的难度，且严重威胁公共卫生安全[18]。同时新型抗生素研发缓慢[19]，替代抗生素药物的研发迫在眉睫。而中药具有多种有效成分，可作用于多个靶位，发挥相应的调节机体健康、改善疾病症状、抗应激及抑菌作用[20]。

鸡大肠杆菌病按照中兽医理论属于大肠湿热症，所以祛除湿热之邪是治疗鸡大肠杆菌病的主要原则[21]。研究证实清热解毒、燥湿解表、健脾补中、生津止泻类中药复方制剂对该症具有较好疗效[22]。为了给后续的临床应用奠定基础，本研究筛选了清热类中药12 味、解表药和温里药各4 味、收涩药2 味及一些临床少用的中药，共39 味中药，进行体外抑菌试验。本研究发现，39 味中药中五味子、洛神花、蒲公英、黄柏、红花、石榴皮等9 味中药对APEC O78具有一定的抑菌作用。这与贺常亮等[21]发现的石榴皮对APEC O78 有抑制效果一致，但黄柏与蒲公英对其无效与本试验结果不同。石榴皮中的槲皮素、鞣花酸、儿茶素、木犀草素、山奈酚成分可破坏细菌细胞膜和细胞壁的结构，发挥抑菌作用[23]。本研究中的五味子的抑菌效果最优，这与鹿意等[11]的研究一致，但与王悦等[24]的研究不同。五味子中抗菌成分主要为木脂素类物质，木脂素通过破坏细胞膜改变细菌的正常生理结构达到抑菌效果；其中的多糖、黄酮也具有抑菌效果，黄酮提取物具有抑制羟自由基能力，会破坏细胞膜[25]。此外，本研究选用了临床应用较少的洛神花，也具有较好的抑菌效果，可能是由于其中生物碱、黄酮类、酚类等成分综合作用的结果[26]，玫瑰茄中的红色素花色苷可与细菌体内的酶或蛋白结合使菌体酶失活达到抑菌效果[27]。目前，洛神花的研究主要集中在食品保鲜、调味剂、添加剂的应用上[27]。鉴于洛神花对细菌较好的抑菌效果，具备良好的替抗潜力，值得进一步开发研究。本研究中部分中药的试验结果与前人[11，21，24]研究结果存在差异，可能与菌液浓度、菌液产地来源、大肠杆菌血清型以及中药饮片来源不同有关。

中兽医理念注重辨证论治，本试验从单方抑菌效果、清热解毒、涩肠止痢等方面着手，选取黄柏、洛神花、五味子、蒲公英四味中药组成复方。以往的研究也显示，黄柏、五味子和蒲公英参与的组方在抑制APEC 菌株上有明显的效果[10-11，28]。本试验中抑菌效果较好的黄柏为清热燥湿药，洛神花和蒲公英都具有清热解毒的功效，五味子则具有涩肠止泻的功效，符合中兽医理论的对证下药。本研究结果表明，洛神花+五味子复方对APEC O78菌株抑菌效果最优，而洛神花和五味子与其他中药的配伍抑菌效果明显低于单味的洛神花与五味子。中药间合理的配伍会产生协同增强作用，复方效果低于单方，可能是复方中药产生颉颃作用或仅单一成分发挥作用[29]。由于中药成分复杂，其有效成分可作用于多个靶位发挥功能，单味或复方中药的作用机制至今仍不明确，因此临床研究仍需继续深入。