济南口岸输入性蜚蠊携带病原体宏基因组分析

赵 辉，辛国辉，闫荣军，韩焕美，张春新，厉淑红，彭 健，宗春辉（通信作者）

（1.济南国际旅行卫生保健中心，山东 济南 250012；2.济南海关，山东 济南 250012）

蜚蠊是重要的口岸病媒生物，可以传播多种细菌、病毒及寄生虫，增加病原体通过口岸传播风险，给口岸卫生检疫工作带来巨大的挑战［1］。山东省自然环境适合蜚蠊的生长，输入性蜚蠊对济南海关辖区各口岸的公共卫生安全造成了威胁。本研究利用宏基因组技术对2022 年至2023 年6 月间济南海关辖区截获送检的623 只蜚蠊携带病原体进行监测分析，可为口岸防控蜚蠊传播疾病提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 虫体采集与处理

研究所采用的623 只蜚蠊为济南海关辖区口岸入境的船舶、集装箱检疫截获。截获的虫体使用无菌密封袋保存，加干冰运输至实验室。每批次40～50 只，每组制作成一个样本，使用PBS 缓冲液对蜚蠊体表进行反复冲洗，再用75%乙醇消毒5 min，最后用PBS 缓冲液反复洗涤3 次，采用液氮研磨的方法破碎匀浆，-80 ℃保存。

1.2 主要实验试剂及耗材

1.2.1 检测试剂盒

霍乱弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、诺如病毒PCR检测试剂盒（上海之江生物科技股份有限公司生产）。

1.2.2 文库构建

ATPOIex RNA 多重PCR 建库试剂盒套装V3.1（包括ATPOIex RNA 多重PCR 扩增模块、内参引物池V3.1、MGIEasy DNA 纯化磁珠试剂盒）（华大制造）。

1.2.3 酶切文库制备试剂盒

MGIEasy Fast PCR-FREE 酶切文库制备试剂盒套装（包括MGIEasy Fast PCR-FREE 酶切文库制备模块、MGIEasy 双端独立标签PF 接头试剂盒A、MGIEasy DNA 纯化磁珠试剂盒）（华大制造）。

1.2.4 DNB 制备

DNBSEQ 一步法DNB 制备试剂盒V2.0（OSDB）（华大制造）。

1.2.5 测序套装和芯片

DNBSEQ-G99RS 高通量测序试剂槽和DNBSEQ-G99RS 测序载片（华大制造）。

1.3 仪器设备

1.3.1 核酸提取仪，西安天隆，GeneRotex96

1.3.2 PCR 仪，ABI-Q5

1.3.3 基因测序仪，华大，DNBSEQ-G99

1.3.4 PNB 浓度检测仪，Thermo-Qubit4.0

1.4 宏基因组检测分析

1.4.1 体表清洗液和组织液使用GeneRotex96 提取总RNA，RNA 均溶于DEPC 处理水。将检测合格的RNA 去除rRNA，保留mRNA 以及其它的非编码RNA，用于后续的文库构建。使用RNA 纯化磁珠对RNA 消化产物进行纯化，使用NF water 洗脱RNA，制备DNB，用Qubit®ssDNA Assay Kit 和Qubit®Fluorometer 进行浓度检测。使用DNBSEQG99 测序仪，将已加载好的芯片放于机器运行测序程序。

1.4.2 测序数据拼接完成后，使用大数据、统计模型、分析软件CLC 和Nextclade 在线网站等进行多序列比对和分析。

2 结果

2.1 蜚蠊物种鉴定情况

口岸截获的623 只蜚蠊经鉴定均为德国小蠊。

2.2 病原体检测情况

霍乱弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、诺如病毒PCR检测均为阴性。

2.3 病毒宏基因组检测情况

623 只蜚蠊制作的15 组样本中检出蟑螂杆状体细菌、大肠杆菌、肠球菌属、不动杆菌属、魏斯氏菌属、变形杆菌、克雷伯菌属等多种条件致病菌。（见表1）。

表1 输入性蜚蠊病原体宏基因组检测情况

3 讨论

随着我国经济发展和对外开放速度的提高，入出境人员及交通工具、集装箱、货物等逐年剧增，由此带来的输入性病媒生物及媒介传染病传入的风险性也进一步加大。特别是我国许多口岸本身处于媒介传染病的疫区或与境外疫区接壤，同时来自各种疫区的交通工具、集装箱、货物数量巨大，其带来的危险性更加突出。

蜚蠊作为口岸监测的重点病媒生物，具有高度适应性，它们可能会通过交通工具、集装箱和货物等检疫对象跨境转移，很容易在入侵地定殖并形成危害。蜚蠊可以携带多种致病病原体，如大肠埃希菌可引起各种肠内外的感染，是腹泻和泌尿道感染的主要病原菌；克雷伯菌可引起肺部感染、泌尿道感染、胆道感染、败血症和化脓性脑膜炎等严重疾病，对人类造成严重危害［3］。本研究未检出高致病病原体和不明病原体，条件致病菌检出率高于高玉峰等研究［2］，可能与使用的方法学以及样本来源和数量有关，本研究的样本均为海港口岸截获送样，来源国家多为中东、日本、韩国等地区和国家，环境对蜚蠊的种群和携带病原体有一定的影响。本研究中，由于病原体丰度等因素，存在部分低辨识度或无法鉴定的RNA，可能会对病原体的检出产生影响。

宏基因组分析检测技术为济南口岸防控输入性蜚蠊传播疾病提供有效技术支持，且在检测灵敏度方面优于PCR 检测技术。通过加强口岸蜚蠊监控，可以及时发现并拦截外来物种，采取措施进行防治，从而降低外来传染病入侵和传播的风险。加强对入境交通运载工具的卫生检疫工作，通过加强口岸蜚蠊监控，可以及时发现并处理携带病原体的蜚蠊，有效预防疾病的传播和扩散，保障人民生命健康，防止疾病通过口岸传入和流行，对于保障国民健康和经济生产意义重大。