白术内酯Ⅰ调节PI3K/Akt/mTOR 信号通路对肺脾气虚反复呼吸道感染模型大鼠肺损伤的影响

王晓利，李玮，朱珊，史兴婵，陈炜［河南省中医院（河南中医药大学第二附属医院）儿科，河南郑州 450053］

反复呼吸道感染（RRTI）是指1年内频繁发生并超过正常范围的上呼吸道和下呼吸道感染，其是儿童最常见的疾病之一[1]。儿童反复呼吸道感染发病率增加主要与年龄、免疫系统状况、过敏以及抗生素过度使用等因素有关[2]。目前，对于反复呼吸道感染的治疗方法主要包括免疫调节剂，抗生素以及其他抗感染疗法治疗，虽然这些干预措施可以在短期内缓解RRTI 症状，但这些干预措施不能预防疾病复发，且通常需长期使用[3-4]。因此，需要开发更安全有效的RRTI治疗方法。

白术内酯Ⅰ是中药苍术的主要活性成分，其具有多种药理特性，包括抗炎和器官保护作用等[5]。已有研究[6]报道，白术内酯Ⅰ可改善大鼠急性肺损伤。但关于白术内酯Ⅰ对肺脾气虚反复呼吸道感染大鼠肺损伤的影响鲜有报道。相关研究[7]显示，抑制磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）通路可抑制炎症反应和氧化应激损伤，进而保护PM2.5 诱导的大鼠肺损伤。但白术内酯Ⅰ能否通过调控PI3K/Akt/mTOR 信号通路影响肺脾气虚反复呼吸道感染大鼠肺损伤尚不可知。因此，本研究拟探究白术内酯Ⅰ对肺脾气虚反复呼吸道感染大鼠肺损伤的影响以及其作用机制，以期为开发新的治疗肺脾气虚RRTI 的药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物 84只SPF级雄性SD 大鼠，4周龄，体质量为105～110 g，购自上海泰楚生物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（沪）2023-0001，动物质量合格证号：1105292111008356。大鼠饲养于温度为（23±1）℃、湿度为（55±5）%、12 h 交替照明的环境中。所有动物实验操作均获得河南省中医院动物伦理委员会的批准，批准号：HNSZYY202200105。

1.2 药物及试剂 白术内酯Ⅰ，批号：73069-13-3，购于成都格利普生物科技有限公司，纯度大于98%，临用前用乙醇生理盐水溶液（乙醇∶生理盐水为3∶1）配制；阿莫西林克拉维酸钾片，批号：20220306，购于南京长澳制药有限公司，临用前用生理盐水溶液配制；PI3K 激活剂重组大鼠胰岛素样生长因子1（IGF-1），批号：20220809，购于北京百奥莱博科技有限公司，临用前用稀醋酸溶液配制；戊巴比妥钠，批号：20221229，佛山市化工实验厂生产；大鼠白细胞介素（IL）-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）ELISA 试剂盒，批号分 别 为 ： 20220307、 20220415、 20220609、20221003，购于上海仁捷生物科技有限公司；兔源一抗p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、PI3K、Akt、mTOR、GAPDH、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，批号分别为：ab191606、ab38449、ab218525、ab302958、ab8805、ab134903、ab8245、ab6721，均购于英国Abcam公司。

1.3 主要仪器 FlexiVent 型动物肺功能仪，北京广源达科技发展有限公司；TC3K 型电子天平，深圳市新朗普电子科技有限公司；CX53 型光学显微镜，日本Olympus公司；ST-360型酶标仪，上海科华实验系统有限公司；165-8001 型蛋白电泳仪，美国Bio-Rad公司。

1.4 分组、模型复制及给药 按照随机数字表法将84 只大鼠随机分为对照组、模型组、白术内酯Ⅰ低剂量组、白术内酯Ⅰ高剂量组、阳性药物组、IGF-1组、白术内酯Ⅰ高剂量+IGF-1 组，每组12 只。除对照组外，其他组大鼠均通过疲劳结合饮食失节的方式诱导脾气虚证[8]，具体过程为：模型复制第1 天将大鼠置于温水池中（水深度为36 cm、水温为30 ℃），强迫大鼠游泳直至其口鼻首次浸入水中，每天进行该操作1次，共持续34 d。该操作过程中大鼠可自由饮水，单日每只大鼠仅喂食20 g 白菜，双日大鼠按照15 mL · kg-1的剂量灌胃猪油脂同时喂养充足的鼠粮。通过刨花加烟叶烟熏法诱导肺气虚证[8]，具体过程为：模型复制第13天时将大鼠置于含有15 g刨花、15 g烟叶的烟熏箱中烟熏30 min，每天进行该操作一次，持续22 d。若大鼠出现呼吸急促、精神倦怠、反应迟钝、咳嗽、饮食量减少、便溏等症状则表明肺脾气虚反复呼吸道感染大鼠模型构建成功。

模型复制成功后，进行给药处理，白术内酯Ⅰ低、高剂量组大鼠分别需腹腔注射3.33、13.32 mg·kg-1白术内酯Ⅰ[9]，且均需灌胃等量的生理盐水；阳性药物组大鼠需灌胃85 mg·kg-1阿莫西林克拉维酸钾，且还需腹腔注射等量的生理盐水[10]；IGF-1 组大鼠需腹腔注射1.33 mg·kg-1IGF-1，且还需灌胃等量的生理盐水[11]；白术内酯Ⅰ高剂量+IGF-1 组大鼠需腹腔注射13.32 mg·kg-1白术内酯Ⅰ和1.33 mg·kg-1IGF-1，且还需灌胃等量的生理盐水；对照组、模型组大鼠均需腹腔注射等量的生理盐水且灌胃等体积的生理盐水。给药每天1次，持续6周。

1.5 肺功能指标的检测 选取全部大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥钠40 mg·kg-1麻醉大鼠，并将大鼠固定于手术台上，利用动物肺功能仪检测大鼠肺功能指标呼气峰流速（PEF）、1 秒用力呼气容积（FEV1）、用力肺活量（FVC）的变化。

1.6 标本收集 肺功能指标检测结束后，断头法处死大鼠，收集大鼠的左肺与右肺组织，左肺组织用于大鼠肺湿干质量比值变化的检测；右肺组织分为两部分（每部分包含各组6只大鼠的肺组织），一部分固定于4%多聚甲醛中用于HE 染色，另一部分冻存于-80 ℃用于ELISA和Western Blot实验。

1.7 大鼠肺湿干质量比值变化的检测 取各组大鼠左肺组织，擦除表面水分后称量并记录其湿质量，再将左肺组织置于60 ℃烤箱中72 h，再称量并记录其干质量，最后计算肺湿干质量比值。

1.8 HE 染色检测各组大鼠肺组织病理变化 将肺组织固定在4%多聚甲醛溶液中24 h，使用不同酒精浓度（70%、80%、90%、95%、100%）梯度脱水，用二甲苯透化组织两次，每次10 min，用石蜡包埋并切成4 μm厚的切片。将组织切片用二甲苯脱蜡，经HE染色后，梯度乙醇脱水，二甲苯透化，然后用中性香脂密封。肺组织的形态学观察在普通光学显微镜下进行。

1.9 ELISA 法检测大鼠肺组织中IL-6、TNF-α、MDA 水平及SOD 活性 严格按照试剂盒说明书检测大鼠肺组织中IL-6、TNF-α、MDA水平及SOD活性。

1.10 Western Blot 法检测大鼠肺组织中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表达 使用放射免疫沉淀测定裂解缓冲液提取肺组织匀浆蛋白质，并根据二辛可宁酸试剂盒使用说明书测定总蛋白质浓度。通过12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离提取的蛋白质，再将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜中。用5%脱脂牛奶封闭膜1 h，并与一抗p-PI3K（1∶4 000）、p-Akt（1∶5 000）、p-mTOR（1∶2 000）、PI3K（1∶2 000）、Akt（1∶3 000）、mTOR（1∶4 000）、GAPDH（1∶2 000）在4 ℃孵育过夜。然后将膜与二抗（1∶3 000）在室温下孵育1 h。ECL 试剂用于可视化膜上的免疫印迹，并使用ImageJ软件测量蛋白条带强度。

1.11 统计学处理方法 使用SPSS 25.0 统计软件对数据进行分析。符合正态分布且方差齐的数据以均数±标准差（±s）表示，单因素方差分析用于分析多组之间的比较，进一步两两比较使用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白术内酯Ⅰ对各组大鼠肺功能的影响 结果见图1。与对照组比较，模型组大鼠PEF、FEV1、FVC降低（P＜0.01）；与模型组比较，白术内酯Ⅰ低剂量组、白术内酯Ⅰ高剂量组、阳性药物组大鼠PEF、FEV1、FVC 升高（P＜0.01）；与白术内酯Ⅰ低剂量组比较，白术内酯Ⅰ高剂量组、阳性药物组大鼠PEF、FEV1、FVC 升高（P＜0.01）；与模型组比较，IGF-1组大鼠PEF、FEV1、FVC 降低（P＜0.01）；与白术内酯Ⅰ高剂量组比较，白术内酯Ⅰ高剂量+IGF-1 组大鼠PEF、FEV1、FVC降低（P＜0.01）。

图1 白术内酯Ⅰ对大鼠肺功能PEF、FEV1、FVC 变化的影响（±s，n=12）Figure 1 Effects of atractylenolideⅠon the changes of PEF，FEV1 and FVC in rats（±s，n=12）

2.2 白术内酯Ⅰ对各组大鼠肺水肿的影响 结果见图2。与对照组比较，模型组大鼠肺湿干质量比值升高（P＜0.01）；与模型组比较，白术内酯Ⅰ低剂量组、白术内酯Ⅰ高剂量组、阳性药物组大鼠肺湿干质量比值降低（P＜0.01）；与白术内酯Ⅰ低剂量组比较，白术内酯Ⅰ高剂量组、阳性药物组大鼠肺湿干质量比值降低（P＜0.01）；与模型组比较，IGF-1 组大鼠肺湿干质量比值升高（P＜0.01）；与白术内酯Ⅰ高剂量组比较，白术内酯Ⅰ高剂量+IGF-1 组大鼠肺湿干质量比值升高（P＜0.01）。

图2 白术内酯Ⅰ对大鼠肺湿干质量比值变化的影响（±s，n=12）Figure 2 Effect of atractylenolideⅠon the changes of lung wet/dry mass ratio in rats（±s，n=12）

2.3 白术内酯Ⅰ对各组大鼠肺组织病理变化的影响结果见图3。对照组大鼠肺组织结构正常，模型组大鼠肺组织肺泡间隔变大，肺间质水肿且存在大量炎性细胞浸润；与模型组比较，白术内酯Ⅰ低剂量组、白术内酯Ⅰ高剂量组、阳性药物组大鼠肺组织病理损伤减轻；与白术内酯Ⅰ低剂量组比较，白术内酯Ⅰ高剂量组、阳性药物组大鼠肺组织病理损伤减轻；与模型组比较，IGF-1 组大鼠肺组织病理损伤严重；与白术内酯Ⅰ高剂量组比较，白术内酯Ⅰ高剂量+IGF-1组大鼠肺组织病理损伤加剧。

图3 白术内酯Ⅰ对大鼠肺组织病理变化的影响（HE 染色，×200）Figure 3 Effect of atractylenolideⅠon pathological changes of lung tissues in rats（HE staining，×200）

2.4 白术内酯Ⅰ对各组大鼠肺组织中IL-6、TNF-α、MDA 水平及SOD 活性的影响 结果见图4。与对照组比较，模型组大鼠肺组织中IL-6、TNF-α、MDA水平升高，SOD 活性降低（P＜0.01）；与模型组比较，白术内酯Ⅰ低剂量组、白术内酯Ⅰ高剂量组、阳性药物组大鼠肺组织中IL-6、TNF-α、MDA 水平降低，SOD 活性升高（P＜0.01）；与白术内酯Ⅰ低剂量组比较，白术内酯Ⅰ高剂量组、阳性药物组大鼠肺组织中IL-6、TNF-α、MDA 水平降低，SOD 活性升高（P＜0.01）；与模型组比较，IGF-1 组大鼠肺组织中IL-6、TNF-α、MDA 水平升高，SOD 活性降低（P＜0.01）；与白术内酯Ⅰ高剂量组比较，白术内酯Ⅰ高剂量+IGF-1 组大鼠肺组织中IL-6、TNF-α、MDA 水平升高，SOD活性降低（P＜0.01）。

图4 白术内酯Ⅰ对大鼠肺组织中IL-6、TNF-α、MDA 水平及SOD 活性变化的影响（±s，n=6）Figure 4 Effects of atractylenolide Ⅰon the levels of IL-6，TNF-α，MDA and SOD activity in lung tissues of rats（±s，n=6）

2.5 白术内酯Ⅰ对各组大鼠肺组织中PI3K/Akt/mTOR 通路相关蛋白表达的影响 结果见图5、图6。与对照组比较，模型组大鼠肺组织中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表达升高（P＜0.01）；与模型组比较，白术内酯Ⅰ低剂量组、白术内酯Ⅰ高剂量组、阳性药物组大鼠肺组织中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达降低（P＜0.01）；与白术内酯Ⅰ低剂量组比较，白术内酯Ⅰ高剂量组、阳性药物组大鼠肺组织中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表达降低（P＜0.01）；与模型组比较，IGF-1 组大鼠肺组织中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表达升高（P＜0.01）；与白术内酯Ⅰ高剂量组比较，白术内酯Ⅰ高剂量+IGF-1组大鼠肺组织中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表达升高（P＜0.05，P＜0.01）。

图6 白术内酯Ⅰ对大鼠肺组织中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表达变化的影响（±s，n=6）Figure 6 Effects of atractylenolideⅠon the protein expressions of p-PI3K，p-Akt and p-mTOR in lung tissues of rats（±s，n=6）

3 讨论

儿童反复呼吸道感染是一种常见的呼吸道疾病，病理学和病因机制复杂[4]。临床上认为，该病的发病与免疫功能障碍、维生素缺乏、营养不良、微生物感染和护理不当有关[12]。目前反复呼吸道感染通常采用对症治疗，但治疗效果有待进一步提高[13]。因此，探讨该病的具体发病机制和新的治疗方法具有重要的意义。

本研究首先采用疲劳结合饮食失节联合刨花加烟叶烟熏的方法构建肺脾气虚反复呼吸道感染大鼠模型，结果显示，与对照组比较，模型组大鼠PEF、FEV1、FVC 降低，肺湿干质量比值升高，肺组织病理损伤严重，表明肺脾气虚反复呼吸道感染大鼠肺功能异常，且存在肺水肿及肺组织病理损伤。IL-6、TNF-α 是常见的促炎性细胞因子，其在反复上呼吸道感染肺气虚证患者血清中的水平高于正常水平[14]。氧化应激被定义为活性氧（ROS）生成与细胞抗氧化能力之间的失衡，SOD的主要功能是清除ROS，并通过维持细胞的氧化还原平衡来防止氧化应激，而MDA是氧化应激的重要生物标志物，被广泛用作氧化损伤的指标[15]；已有报道[16]显示，肺脾气虚反复呼吸道感染患儿血清中SOD 活性降低，MDA 水平升高。本研究结果显示，与对照组比较，模型组大鼠肺组织中IL-6、TNF-α、MDA 水平升高，SOD 活性降低，表明肺脾气虚反复呼吸道感染大鼠肺组织存在炎症反应及氧化应激。因此，抑制炎症反应及氧化应激可能是改善肺脾气虚反复呼吸道感染大鼠肺损伤的有效途径之一。

白术内酯Ⅰ是苍术中的主要生物活性成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等作用[17]。据报道，白术内酯Ⅰ可抑制缺血/再灌注损伤大鼠氧化应激[18]；白术内酯Ⅰ可抑制烟曲霉角膜炎小鼠炎症反应[19]。以上研究证实了白术内酯Ⅰ在多种疾病中发挥着抗炎、抗氧化作用。本研究结果与其是一致的。本研究显示，白术内酯Ⅰ可抑制肺脾气虚反复呼吸道感染大鼠炎症反应及氧化应激，且白术内酯Ⅰ剂量越高，抑制作用越明显。此外，阿莫西林克拉维酸钾是临床上常用于治疗小儿反复呼吸道感染的药物[20]，本研究设置该药物为阳性药物。结果显示，高剂量白术内酯Ⅰ与阿莫西林克拉维酸钾对肺脾气虚反复呼吸道感染大鼠炎症反应及氧化应激的抑制作用差异无统计学意义，提示白术内酯Ⅰ可能为治疗肺脾气虚反复呼吸道感染的潜在有效药物之一。

PI3K/Akt/mTOR 通路是炎症和氧化应激进展的最常见因素之一，PI3K/Akt/mTOR 通路及其相关分子被视为肺损伤的防治靶点[21]。如抑制PI3K/Akt/mTOR 途径可改善博莱霉素诱导的肺损伤小鼠炎症反应及氧化应激[22]。本研究显示，IGF-1 组大鼠肺组织炎症反应及氧化应激水平高于模型组，且IGF-1 为PI3K 激活剂，表明PI3K/Akt/mTOR 通路确实参与了肺脾气虚反复呼吸道感染大鼠肺损伤过程。此外，本研究还发现，白术内酯Ⅰ可抑制肺脾气虚反复呼吸道感染大鼠肺组织中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表达，且白术内酯Ⅰ剂量越高，抑制作用越明显，提示白术内酯Ⅰ可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR 通路改善肺脾气虚反复呼吸道感染大鼠肺损伤。为了验证该推测，本研究在高剂量白术内酯Ⅰ作用的基础上再加上PI3K 激活剂IGF-1 来干预肺脾气虚反复呼吸道感染大鼠，结果显示，IGF-1减弱了高剂量白术内酯Ⅰ对肺脾气虚反复呼吸道感染大鼠肺损伤的改善作用。此证实了猜想的正确性，即白术内酯Ⅰ可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR 通路改善肺脾气虚反复呼吸道感染大鼠肺损伤。

综上所述，白术内酯Ⅰ可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR 通路改善肺脾气虚反复呼吸道感染大鼠肺损伤。白术内酯Ⅰ改善肺脾气虚反复呼吸道感染大鼠肺损伤的机制较为复杂，具体通过PI3K/Akt/mTOR 通路下游的哪些蛋白来发挥作用有待后续实验深入探究。