培土清心颗粒治疗特应性皮炎的蛋白质组学研究

刘俊峰，张凯，莫秀梅，3，王赛娅，晏烽根，3，叶思琪，贾金靖，张瑜，陈达灿，3，于晓波［.省部共建中医湿证国家重点实验室/广州中医药大学第二附属医院，广东广州 500；.河北大学生命科学学院，河北保定 0700；3.粤港澳中医药与免疫疾病研究联合实验室，广东广州 500；. 蛋白质组学国家重点实验室/北京蛋白质组研究中心/国家蛋白质科学中心·北京（凤凰中心）/军事科学院军事医学研究院生命组学研究所，北京 006］

特应性皮炎（Atopic dermatitis，AD）是一种常见的慢性炎症性皮肤病，具有顽固难治、易复发的特点，全球患病率逐年升高[1]。特应性皮炎的发病原因及机理尚未完全阐明，是内在因素（遗传背景下免疫功能失衡、皮肤屏障功能异常）与外在因素（环境）相互作用的结果，是一种系统性疾病[2-3]。由于病情长期反复、剧烈瘙痒及睡眠障碍，患者容易出现心理问题，严重者伴有焦虑、抑郁甚至自杀倾向，严重影响患者的生活质量。目前西医对特应性皮炎的治疗药物主要是激素、抗组胺药、免疫抑制剂、生物制剂等，虽能暂时缓解病情，但长期使用存在毒副作用的问题，并且给患者家庭和社会造成沉重的经济负担。

依据特应性皮炎的特点、症状，可将其归属于中医学的“四弯风”范畴，由于先天禀赋不耐，或后天饮食失调，导致脾虚、心火亢盛，感受风、湿、热之邪而发病[4]。中医药治疗特应性皮炎历史悠久，且有一定的优势。中药“培土清心颗粒”是广东省中医院研制的创新药物，由太子参、白术、山药、薏苡仁、连翘、白茅根、白鲜皮、珍珠母、甘草9味中药组成，具有健脾清心、祛风止痒的功效，主要用于治疗心火脾虚型特应性皮炎。通过多中心随机对照临床研究[5]显示，培土清心方可以有效改善特应性皮炎患者的病情，缓解瘙痒，提高患者的生活质量，且安全性较好。前期研究[6-8]表明，培土清心方可以通过调节Th1/Th2/Th17/Treg 免疫失衡和肠道菌群发挥治疗特应性皮炎的作用。通过网络药理学分析[9]显示，培土清心颗粒可能通过抗炎、调节免疫、调控细胞凋亡以及调节氨基酸代谢以达到治疗特应性皮炎的目的。

蛋白质组学研究[10-11]表明，特应性皮炎患者血液中均存在系统的炎症蛋白表达。血清蛋白质组学为生物标志物监测提供了一个敏感的选择，对于研究疾病诊断、预测治疗应答、药物作用靶点、预后等方面的标记物有很大的潜力[12]。故本研究拟采用数据非依赖采集质谱（DIA-MS）技术检测培土清心颗粒治疗前后特应性皮炎患者血清蛋白质的差异表达，寻找作用靶点，以期进一步阐明中药培土清心颗粒治疗特应性皮炎的作用机制。

1 材料与方法

1.1 样本来源 收集来自广东省中医院大德路门诊的特应性皮炎患者的血液样本，健康人群血液样本来自招募的志愿者。其中特应性皮炎患者5 例，男性2 例，女性3 例，年龄7～12 岁，平均10.8 岁；均符合Hanifin&Rajka 诊断标准[4]。采用培土清心颗粒（由江阴天江药业有限公司制备）治疗12 周，6～7 岁，每次4 g，每日2 次；8～16 岁，每次6 g，每天2 次。治疗前后进行临床结局评价[4]，包括病情严重程度评分（EASI、SCORAD）、瘙痒程度评分、患者自评（POEM）、生活质量指数；治疗前后采集患者血液样本，分离血清备用。健康志愿者5例，年龄及性别与治疗组的差异无统计学意义（P＞0.05），既往无过敏性疾病（包括过敏性鼻炎、哮喘、过敏性结膜炎等）病史。受试者或监护人均签署知情同意书，本研究通过广东省中医院伦理委员会审查，伦理审查批文号：BF2021-111-01。

1.2 主要试剂及仪器 10 mmol·L-1二硫苏糖醇（DTT）、50 mmol·L-1碘乙酰胺（IAA），生工生物工程（上海）股份有限公司；尿素、碳酸氢铵（ABC），美国Sigma-Aldrich 公司；50 mmol·L-1碳酸氢铵溶液（ABC）、胰蛋白酶（批号：TRY001C），北京华利世科技有限公司。超滤管（30 kDa），美国MilliporeSigma 公司；EASY-nano-LC 1200 型液相系统、Q Exactive HF 质谱仪，美国赛默飞世尔科技公司。

1.3 血清样本的FAST 酶切 取出-80 ℃保存的血清样本，以4 ℃、10 000×g离心3 min，取上清2 μL；加入200 μL 50 mmol·L-1ABC，室温下以12 000×g离心15 min，重复洗涤3 次。更换收集管，加胰蛋白酶（0.02 μg·μL-1，由50 mmol·L-1ABC 配制）200 μL，37 ℃下水浴酶解13～16 h，室温下以12 000×g离心15 min。再各加200 μL 纯水，室温下以12 000×g离心15 min。将滤液转移至1.5 mL EP 管中，置于离心浓缩系统热吹干，加热温度为42 ℃。

1.4 血清样本的DIA 质谱检测 色谱条件：将多肽样本溶于30 μL A 液（0.1%甲酸水溶液）中，进样5 μL，以4.5 μL·min-1流速载样至预柱上，然后以600 nL·min-1流速在分析柱上进行分离。色谱分离梯度程序为：0～15 min，B 液（含0.1%甲酸的80%乙腈溶液）从7%至15%线性上升；15～85 min，B 液从15%至30%线性上升；85～110 min，B 液从30%至50%线性上升；然后在2 min 内，B 液上升至95%并维持到120 min。质谱条件：离子源喷雾电压：2.1 kV；一级扫描范围为m/z300～1 400，分辨率为60 K（m/z200），AGC target 为3e6，Maximum IT 为80 ms；二级扫描分辨率为15 K（m/z200），AGC target 为5e4，Maximum IT 为40 ms，碰撞能量为30，电荷状态为2～6，动态排除时间为30 s。采用293T 细胞对质谱仪器进行质量控制，检测期间仪器稳定性、重复性较好。

1.5 统计学处理方法及数据分析 患者治疗前后各临床指标变化的比较采用配对t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。蛋白质组学分析结果通过Spectronaut 软件导出搜库数据，共鉴定2 865 个肽段和407 个蛋白。将搜库文件导入悟空云平台（https：//www.omicsolution.com/wkomics/main/）进行数据中位数标准化、缺失值填充、Log2 转换处理，以获得高质量数据进行后续统计分析。使用limma 包进行两组间的差异分析，根据P＜0.05、变化倍数（Fold Change）＞1.2筛选出差异蛋白；然后对所有差异蛋白进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和层聚类分析；最后通过GO数据库（https：//geneontology.org）及KEGG数据库（https：//www.genome.jp/kegg/pathway.html）对差异蛋白进行GO 功能富集分析（包括生物学过程、细胞组分、分子功能3个方面）和KEGG通路富集分析。

2 结果

2.1 培土清心颗粒对特应性皮炎患者相关疗效指标的影响 结果见表1。与治疗前比较，特应性皮炎患者治疗后的临床核心评价指标包括病情严重程度评分（EASI、SCORAD）、瘙痒程度评分、患者自评（POEM）、生活质量指数等均得到明显改善，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。结果表明，培土清心颗粒对特应性皮炎疗效确切。

表1 培土清心颗粒对特应性皮炎患者相关疗效指标的影响（±s，n=5）Table 1 Effects of Peitu Qingxin Granules on the related therapeutic indicators of patients with atopic dermatitis（±s，n=5）

表1 培土清心颗粒对特应性皮炎患者相关疗效指标的影响（±s，n=5）Table 1 Effects of Peitu Qingxin Granules on the related therapeutic indicators of patients with atopic dermatitis（±s，n=5）

注：与治疗前比较，*P＜0.05，**P＜0.01

疗效指标EASI/分SCORAD/分POEM/分瘙痒程度评分/分生活质量指数/分治疗前12.35±7.47 50.41±12.15 20.00±6.04 8.00±1.22 13.60±1.67治疗后2.67±3.15*29.02±6.59*13.00±9.30*4.80±2.28*6.40±2.97**

2.2 特应性皮炎患者与健康人群的差异蛋白分析 对预处理的健康对照组及特应性皮炎组的血清蛋白质组学数据进行方差分析，根据P＜0.05、变化倍数＞1.2 筛选出变化差异较大的蛋白质。2 组共分析出特应性皮炎患者有28 个差异性蛋白，其中12 个蛋白表达水平上升，16个蛋白表达水平下降，见图1。其中差异性排前列的蛋白质包括ALAD（δ-氨基乙酰丙酸脱水酶）、LTA4H（白三烯A-4 水解酶）、FGA（纤维蛋白原α 链）、F11（凝血因子XI）、LCP1（淋巴细胞胞浆蛋白1）等，见图2。

图1 特应性皮炎患者与健康人群差异表达蛋白的火山图Figure 1 Volcano plots of differentially expressed proteins between atopic dermatitis patients and healthy people

图2 特应性皮炎组与健康对照组的主要差异表达蛋白（±s，n=5）Figure 2 The main differentially expressed proteins between atopic dermatitis group and healthy control group（±s，n=5）

通过GO 功能富集分析发现，差异蛋白主要参与的生物进程包括固有免疫应答、细胞外基质、细胞黏附等；主要与外泌体、细胞外间隙、胞外区、细胞膜等细胞组分有关；主要参与的分子功能包括钙离子结合、锌离子结合、转化生长因子β 结合等，见图3-A。通过KEGG 通路富集分析发现，差异蛋白主要涉及PI3K-AKT 信号通路、脂质与动脉粥样硬化、ECM-受体相互作用、血小板活化、NF-κB信号通路、中性粒细胞外陷阱形成等信号通路，见图3-B。

图3 特应性皮炎组与健康对照组差异表达蛋白的GO 功能及KEGG 通路富集分析Figure 3 GO enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed proteins between atopic dermatitis group and healthy control group

2.3 培土清心颗粒治疗前后特应性皮炎患者的差异蛋白分析 对预处理的特应性皮炎患者治疗前、后的血清蛋白质组学数据采用limma 包进行差异分析，根据P＜0.05、变化倍数＞1.2 筛选出变化差异较大的蛋白质。结果特应性皮炎患者经培土清心颗粒治疗前后共分析出12 个差异蛋白，其中8 个蛋白表达水平上升，4 个蛋白表达水平下降，见图4。差异性排前列的蛋白质包括表达显著上调的ALAD、FGA、IGHV3-64D，以及表达显著下调的IGHV3-38，见图5。对治疗前后的差异蛋白进行层聚类分析，结果表明治疗前后样本变异度可控，差异蛋白质之间存在一定的相关性，聚类分析热图见图6-A。对治疗前后的差异蛋白进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA），结果显示治疗前后组间分离趋势明显（见图6-B），表明差异表达蛋白对于特应性皮炎患者治疗前后的区分度明显。

图4 特应性皮炎患者治疗前后差异表达蛋白的火山图Figure 4 Volcano plots of differentially expressed proteins in patients with atopic dermatitis before and after treatment

图5 特应性皮炎患者治疗前后的主要差异表达蛋白（±s，n=5）Figure 5 The main differentially expressed proteins in patients with atopic dermatitis before and after treatment（±s，n=5）

图6 特应性皮炎患者治疗前后差异表达蛋白的相关性分析Figure 6 Correlation analysis of differentially expressed proteins in patients with atopic dermatitis before and after treatment

进一步通过GO 功能富集分析发现，差异蛋白主要参与的生物进程包括血小板脱颗粒、血小板聚集、细胞外基质、对药物的反应等；主要与胞外外泌体、细胞膜、细胞外间隙、细胞质等细胞组分有关；主要参与的分子功能包括钙黏蛋白结合（包括细胞间的黏附）、相同的蛋白质结合、金属离子结合、细胞黏附分子结合等，见图7-A。通过KEGG 通路富集分析发现，差异蛋白主要涉及脂质与动脉粥样硬化、补体途径、金黄色葡萄球菌感染、NF-κB 信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化等信号通路，见图7-B。

图7 特应性皮炎患者治疗前后差异表达蛋白的GO 功能及KEGG 通路富集分析Figure 7 GO enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed proteins in patients with atopic dermatitis before and after treatment

2.4 培土清心颗粒治疗特应性皮炎的作用靶点 对“特应性皮炎患者与健康人群的差异蛋白”与“培土清心颗粒治疗前后特应性皮炎患者的差异蛋白”取交集，发现ALAD、FGA、IGHV3-64D 等3 个蛋白靶点在特应性皮炎患者中的表达显著下调，而在培土清心颗粒治疗后显著上调，提示这3个差异蛋白可能是培土清心颗粒治疗特应性皮炎的作用靶点，见表2。

表2 培土清心颗粒治疗特应性皮炎的作用靶点Table 2 The target of Peitu Qingxin Granules in the treatment of atopic dermatitis

3 讨论

特应性皮炎是一种慢性、复发性、炎症性皮肤病，湿疹样皮炎、瘙痒及病情反复是其临床特点。广东省名中医陈达灿教授认为特应性皮炎多由禀赋不耐、胎毒遗热、外感淫邪、饮食失调，致心火过胜，脾虚失运而发病，脾虚心火亢盛是特应性皮炎的核心病机[13-14]，培土清心法是其基本治法，培土清心颗粒依该法而创制。该方由太子参、白术、山药、薏苡仁、连翘、白茅根、白鲜皮、珍珠母、甘草组成，既有四君子汤中正平和、健脾培土之义，又有导赤散清心导赤、泄邪从下之功。方中遣白术以培土健运，补脾胃；而连翘为疮家要药，可清心火，解热毒；二者共奏清心培土之功效，为君药。白茅根凉血清热，利尿消肿，甘寒而不伤正；太子参、薏苡仁、山药健脾除湿，平补脾胃；以上诸药助君药以调理心脾，共为臣药。珍珠母长于安神定惊，潜阳息风；白鲜皮善清热燥湿，祛风止痒；以上二药安神、止痒，同属佐药。全方紧扣病机，轻灵平正，清而不伤正，养而不留邪，共奏培土清心，祛风止痒之功。本研究结果表明，培土清心颗粒治疗后，特应性皮炎患者的临床核心评价指标[15]包括病情严重程度评分（EASI、SCORAD）、瘙痒程度评分、患者自评（POEM）、生活质量指数等均得到明显改善，培土清心颗粒能够有效缓解瘙痒，改善症状，提高患者生活质量，与多中心随机对照研究[5]结果一致。

本研究采用DIA-MS 技术检测并分析了特应性皮炎患者与健康人群的血清差异蛋白，以及培土清心颗粒治疗前后特应性皮炎患者的血清差异蛋白，寻找培土清心颗粒治疗特应性皮炎的作用靶点。特应性皮炎患者与健康人群比较，共分析出28 个显著差异表达蛋白，其中12 个蛋白表达上调，16 个蛋白表达下调。表达显著上调的差异蛋白包括CA1（碳酸酐酶1）、F11、ICAM-1（细胞间黏附分子）、可溶性CD14等；表达显著下调的蛋白包括ALAD、 LTA4H、FGA、IGHV1-3、IGHV3-64D等。研究发现，ICAM-1在特应性皮炎患者血清和皮损中的表达均显著上调，参与了特应性皮炎的发生，并能够反映病情严重程度[16-17]；可溶性CD14 与皮疹严重程度相关，可能是疾病活动标志物[18]。此外，LTA4H也是本研究中发现的一个重要差异蛋白，LTA4H 为双功能锌金属酶，包含环氧化物水解酶（EH）和氨肽酶活性，其中EH可催化LTA4 转化为促炎介质白三烯B4（LTB4）。因其具有氨肽酶活性，对各种合成三肽的N端精氨酸具有高亲和力，因此其除了促炎的EH 活性外，还可以通过其氨肽酶活性来抵抗炎症，该活性可通过裂解另一种中性粒细胞引诱剂三肽Pro-Gly-Pro（PGP）灭活。研究[19]表明，血清LTA4H 是一个用于早期预测通过变应原免疫治疗（AIT）变应性鼻炎有效的潜在生物标志物。因此，LTA4H 在特应性皮炎发病机制中的作用值得进一步研究。其余大部分差异性蛋白与特应性皮炎的相关性尚未见文献报道，可为阐明特应性皮炎发病机制提供研究方向。

特应性皮炎患者经培土清心颗粒治疗前后比较，共分析出12个差异蛋白，其中8个蛋白表达水平上升，4 个蛋白表达水平下降。其中ALAD、FGA、IGHV3-64D 等3 个蛋白靶点在特应性皮炎患者中的表达显著下调，而在培土清心颗粒治疗后显著上调，可能是培土清心颗粒的作用靶点。ALAD 由8 个相同的亚基组成，催化2 个δ-氨基乙酰丙酸分子缩合形成血红素、细胞色素和其他血红素蛋白的前体胆色素原。ALAD 是一种硫醇依赖性酶，可以代表循环氧化状态，其活性的改变与氧化应激密切相关，因此被认为是人类病理中氧化应激的标志物[20]。人体血液中的ALAD 水平是大气铅污染的生物监测指标，也是低浓度铅暴露的敏感性指标。特应性皮炎作为体质和环境交互作用引发的疾病，其中环境因素如铅的暴露受到广泛关注。研究发现，室内空气中的铅含量可能与特应性皮炎的症状相关[21]；孕晚期暴露高水平铅会增加6 个月男孩患特应性皮炎的风险[22]；出生时脐带血中高水平铅会导致免疫反应向Th2极化，促进疾病的发生与发展[23]。在特应性皮炎的发生发展中，ALAD 可能与氧化应激以及与重金属铅有重要关系，需要进一步深入研究。血清纤维蛋白原α 链（FGA）是血清纤维蛋白原的组成部分，与β、γ 多肽链通过二硫键形成对称的二聚体结构。FGA 参与凝血及多种疾病的炎症机制，包括类风湿关节炎、多发性硬化症和阿尔茨海默病、淀粉样变病、非创伤性股骨头坏死[24]。IGHV3-64D 为免疫球蛋白复合体的一部分，具有抗原结合活性和免疫球蛋白受体结合活性，参与包括免疫反应的激活、对其他生物的防御反应、吞噬作用等。目前，FGA、IGHV3-64D 在特应性皮炎发病中的作用尚未见相关报道，有待深入研究。此外，通过对健康对照组与特应性皮炎组，以及特应性皮炎组经培土清心颗粒治疗前后差异蛋白的KEGG通路分析，均显示涉及NF-κB信号通路。NF-κB信号通路可调控转录多种炎性因子表达，作为下游信号通路参与了特应性皮炎的发病机制，其可促进人角质形成细胞和肥大细胞中细胞因子及趋化因子的产生，加剧炎症反应，与特应性皮炎的严重程度密切相关。上述差异蛋白有可能通过NF-κB 信号通路加重了皮肤炎症，差异蛋白与NF-κB 信号通路之间的关系值得深入研究。

综上所述，本研究采用DIA-MS 技术筛选出差异表达蛋白ALAD、FGA、IGHV3-64D，可能是培土清心颗粒治疗特应性皮炎的作用靶点。该结果为进一步实验验证奠定了基础，后续研究将扩大样本，进一步阐明上述靶蛋白在特应性皮炎发病机制中的作用，同时可为有效药物的筛选提供新的思路。