模拟微重力处理间充质干细胞应用于干细胞治疗的研究进展

张俊飞，张 舒，石 菲，郭 显，胡泽兵

(空军军医大学航空航天生物动力学教研室，航空航天医学教育部重点实验室，陕西 西安 710032)

近年来，基于干细胞移植的再生医学研究和组织工程研究的发展为临床损伤修复类疾病的治疗带来了新的希望。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种典型的成体多能干细胞，具有自我更新、多向分化、免疫调节等能力，因其独特的生物学特性和良好的转化应用潜力成为干细胞疗法的热门种子细胞，在多种因衰老和病变引起的组织器官损伤修复等方面受到广泛关注[1]。但是，MSCs类细胞制品在临床疗效方面仍然存在一些问题，如长期体外扩增时分化潜能降低、致瘤性升高、免疫调节能力降低[2-3]，移植后归巢能力有限[4-5]等，这些问题极大地限制了其在细胞治疗中的应用和发展。在优化MSCs体外培养条件时，研究人员发现改变MSCs的培养环境可使其生物学特性在一定范围内重塑[6]。其中，模拟微重力培养技术能够在一定程度上维持MSCs的“干细胞特性”[7]，有望解决MSCs作为种子细胞在体外扩增和临床治疗中遇到的难题。基于这一现象，本文总结了模拟微重力培养技术对MSCs主要生物学特性的影响，并讨论了其在体外扩增中的保护效应和潜在的临床应用前景。

1 MSCs在干细胞治疗中的应用前景及问题

1.1 MSCs在干细胞治疗中的应用优势

干细胞是具有自我复制、更新和多向分化潜能的一类细胞，其按照所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)和成体干细胞(adult stem cells，ASCs)。ESCs具有发育成人类所有细胞类型的潜能，但是其来源、获取和研究受到伦理和法律限制，影响了其在再生医学中的应用[8]。在诸多ASCs中，MSCs凭借其良好的生物学特性，成为组织工程和再生医学领域较为理想的种子细胞类型[9]。MSCs属于多能干细胞的一种，在骨髓、牙髓、胎盘、脂肪、皮肤等组织中均有发现，具有高度的自我更新能力、多向分化潜能，并且在体外培养至多代后仍能够在一定程度上保持这种多向分化潜能。目前相关文献均认为身体的各部分间充质内均含有MSCs，其易于分离、培养、扩增和纯化，且避免了法律伦理审查的要求，同时比其他ASCs有更大的分化潜能，在细胞替代治疗和组织工程领域有较高的研究与应用价值[10]。我国现行法律法规已经允许使用MSCs进行临床研究[11]，相信未来其对我国再生医学的发展能够提供更强大的助力。

1.2 MSCs在干细胞治疗中的应用与问题

MSCs可通过归巢、分泌一系列细胞因子和生长因子以及分泌外泌体等多种形式发挥造血功能、免疫调节和组织修复再生等生物学功能[12]，目前，已经被多个临床医学领域广泛关注并展示出良好的转化应用潜力。例如，在治疗肺部疾病中使用MSCs治疗已被证明可以改善肺功能[13]；MSCs可以改善各种代谢类疾病，如高血糖、高甘油三酯血症、高血压等[14]；在治疗神经系统疾病中，通过鞘内MSCs给药，其分泌的生长因子和趋化因子对治疗神经系统疾病起到有益作用[15]；等等。但是，由于MSCs从体内分离纯化后的细胞量较少，无法满足临床应用，必须经过体外培养扩增后才能达到干细胞移植所需要的细胞数量，体外培养环境与体内的差异容易导致MSCs类细胞制品在生物学特性上发生改变，影响了临床应用效果。有研究显示，体外培养扩增的MSCs有在受者体内存活率低[16]、移植的MSCs归巢数量较少、不能维持MSCs的干性和免疫调节功能[3]、细胞大量体外扩增后出现衰老特征[17]等问题。因此，越来越多的目光聚焦到改变MSCs的培养环境从而改变其生物学特性上。模拟微重力培养技术是在地面采用特殊细胞培养装置，如2D回转器、随机位置仪、旋转细胞培养系统等，实现对细胞的多向转动，使得细胞来不及感受重力矢量的影响以达到模拟太空微重力环境的目的[18]。已有研究表明，模拟微重力培养能够影响细胞的形态、增殖、分化和信号转导，虽然因微重力模拟方法和实验条件的差异而得到的实验结果有所不同，但大部分结果显示模拟微重力下培养的MSCs更有利于应用到临床治疗中。

2 模拟微重力培养对MSCs归巢能力的影响

归巢能力是影响MSCs移植后治疗效果的重要因素之一。MSCs归巢，是指MSCs在目标组织的脉管系统里被捕获，随后跨越血管内皮细胞迁移至目标组织的过程。具体的过程可表述为：当机体组织受到某种刺激时，一些“休眠”的MSCs被“唤醒”，MSCs表面表达不同细胞因子受体，其与相应配体结合介导细胞迁移，移动到损伤部位后，促进损伤部位的细胞修复。归巢是干细胞作用的初始环节，亦是关键环节。干细胞移植一般可采取局部注射和全身注射。对于局部注射，MSCs主要通过促炎细胞因子梯度定向归巢到损伤部位；对于全身注射，MSCs被施用于血液，然后经历类似于白细胞迁移的多步骤过程才能离开循环并移动到损伤部位，基本可分为3个过程：活化-动员(炎性细胞释放大量的细胞因子和生长因子，活化MSCs)、结合-滚动(MSCs与血管内皮结合并滚动)、黏附-穿越(穿越血管内皮细胞进入靶组织)。

MSCs所表达的趋化因子受体、黏附分子及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)等都参与了其归巢过程。研究显示，基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)及其受体C-X-C基元受体4(C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4)在MSCs归巢的活化动员环节发挥着尤为重要的作用[19]。阻断或沉默CXCR4表达可显著抑制MSCs的迁移能力，过表达CXCR4可以增强MSCs的归巢性[20]。在模拟微重力条件下培养大鼠骨髓来源的MSCs 7 d后发现，趋化因子受体CXCR4表达显著升高，而SDF-1对表达CXCR4的MSCs趋化作用增强，将其移植到脊髓损伤模型大鼠中发现，归巢到损伤部位的MSCs明显增多[21]。MMPs可以调节内皮细胞基底膜并降解胞外基质，在归巢过程中促进MSCs的迁移[22]。将人类间充质干细胞(human mesenchymal stem/stromal cells，hMSCs)在微重力环境中暴露10 d后，MMPs抑制剂TIMP1和TIMP3基因的表达下降[23-24]，而MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、MMP10、MMP14表达则显著升高[24]，有利于降低细胞外基质蛋白，提高MSCs的迁移能力。另一研究发现，在脂肪来源间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，AD-MSCs)向成纤维细胞分化中，MMP1的表达上调，而模拟微重力环境可以促进MMP1表达进一步增加，这也印证了微重力环境对MMPs表达的影响[25]。虽然微重力对MSCs归巢的各个环节呈现出不同的影响，但现有报道显示微重力环境主要是通过增强迁移和侵入过程而促进MSCs归巢。

3 模拟微重力培养对MSCs免疫调节特性的影响

免疫调节能力是MSCs发挥治疗作用的重要机制之一[26]，其可以通过分泌细胞因子、趋化因子、细胞外囊泡等诱导免疫细胞功能发生变化，从而调节促炎因子和抗炎因子之间的平衡，形成组织修复所必需的细胞因子微环境。MSCs分泌的、参与免疫调节作用的可溶性细胞因子主要包括：强效T辅助2型细胞(T helper 2 cell，Th2)因子、IFN-γ诱导蛋白IP-10、巨噬细胞趋化蛋白(macrophage chemoattractant protein，MCP)等[27]，这些可溶性细胞因子可以作用于多种免疫相关细胞，根据局部微环境中不同的炎性反应进程，MSCs表现出不同的分泌特征，从而发挥相应的免疫调节作用[28]。

研究表明，模拟微重力培养的MSCs可以通过抑制损伤部位的炎性反应而促进组织修复和功能恢复。OTSUKA等[29]将模拟微重力条件下培养的人颅骨来源的MSCs注射于创伤性脑损伤小鼠模型，结果发现，脑损伤部位的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)表达显著降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著升高，脑损伤部位的组织修复和小鼠运动功能得到改善。另有研究证实，模拟微重力环境培养两周后MSCs中趋化因子Th2和MCP-3表达下降，而炎症与免疫抑制因子IL-10表达显著增加[30]，这有利于增强MSCs的免疫抑制能力。但是，RATUSHNYY等[31]将AD-MSCs暴露在微重力环境48 h后观察到，微重力本身不会引起炎症相关的变化，但会对炎性因子TNF-α引发的炎性反应减弱，这对MSCs的免疫抑制能力可能会起到负面影响。虽然，由于细胞来源和模拟微重力培养方法的不同导致研究结果存在差异，但从大多数研究来看，模拟微重力对MSCs免疫调节特性的影响，有利于其移植后降低排斥反应，从而延长存活时间，使MSCs在免疫与炎症相关疾病中具有更广阔的应用前景。

4 模拟微重力培养对MSCs致瘤性的影响

MSCs的临床安全性一直是再生医学研究的重要内容之一。由于人体组织中MSCs数量有限，所以需要离体扩增以获得足够数量的细胞才能发挥治疗功效，但大量扩增会降低DNA聚合酶和DNA修复效能，从而可能导致细胞遗传突变、表观遗传学改变、DNA损伤等[32-33]，这可能增加MSCs的恶性转化风险。尽管有风险，但在正常情况下MSCs比诱导性多能干细胞和ESCs的不稳定性和形成畸胎瘤的可能性更小[34]，且没有表现出本质上的致瘤性，从而成为MSCs应用于临床治疗的优势之一。但是，模拟微重力环境改变了细胞的生长环境，是否会加大MSCs体外扩增中的致瘤风险需要进一步研究评估。

在国际空间站进行的一项研究显示，对太空培养7 d和14 d的hMSCs进行染色体、DNA损伤和致瘤性检测，没有发现恶性转化的证据[30]。KOAYKUL等[35]将hMSCs在微重力环境中培养15 d后，测得细胞黏附效率和生长率与正常重力下没有显著差异。但也有另一项研究报道，在微重力条件下培养的hMSCs的平均倍增时间比在自然重力条件下短1.5倍[36]。初步推测，未来将模拟微重力培养MSCs应用于对临床疾病的治疗是可行且安全的，且可以通过这种方法来实现快速获取大量MSCs的要求。微重力还能通过减少MSCs细胞骨架的收缩性而降低其增殖能力[37]，同时通过使细胞骨架纤维重组而增强了MSCs的分化潜能。因而从这个角度看，在微重力环境中培养的MSCs致瘤性可能会降低。但同时，有研究发现，将小鼠骨髓MSCs在模拟微重力环境下暴露14 d，肿瘤发生特异性基因表达会上调[38]。因此，微重力环境对MSCs致瘤性的影响还需要进一步的验证。

5 模拟微重力培养对MSCs多向分化潜能的影响

MSCs是一种典型的多能干细胞，具有自我更新和多向分化能力，在适宜的条件下，可以分化为多种类型细胞，但MSCs在体外增殖的传代次数是有限的，传代次数过多会导致MSCs进入衰老状态[39]，最终影响MSCs的生物学特性，使其多向分化能力与治疗潜力减弱[40]。最近研究证实，老化是限制MSCs作为标准化临床产品的功能和治疗特性的重要因素[41]，这将对推进MSCs在临床上的应用造成巨大阻碍。

早已有研究证明，模拟微重力条件可以维持MSCs的多向分化潜能，例如，将小鼠MSCs和hMSCs分别在正常重力与微重力条件下培养7 d，结果发现微重力培养组的MSCs维持未分化状态，而正常重力培养组的MSCs则出现了分化；另一项实验将hMSCs在模拟微重力条件下培养3 d也得到相同结论[36]，推测这是由于微重力减慢了细胞周期、降低细胞代谢及线粒体活性，这使得MSCs进入了类似冬眠的状态，从而维持未分化状态并提高了存活率。在模拟微重力环境中培养15 d的hMSCs干性标志物POU5F1和Nanog的表达高于在常规重力条件下生长的细胞，而在正常重力中的hMSCs多能水平逐渐下降。到第三代时，模拟微重力条件下培养的hMSCs中POU5F1和Nanog的相对表达量是正常重力条件下培养的hMSCs的2.3倍和2.1倍[35]。同时，在不同诱导培养基条件下，微重力还能影响MSCs的分化倾向。模拟微重力会抑制MSCs向力敏感细胞(如成骨细胞)分化，促进向力不敏感细胞(如内皮细胞、脂肪细胞)分化[42]。这是因为微重力环境导致肌动蛋白细胞骨架变化，从而抑制了转录共激活因子与PDZ结合基序(TAZ)的核聚集，而这一步骤对于MSCs的成骨分化是必不可少的。模拟微重力条件下，hMSCs不表达碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原蛋白和骨连接素等成骨细胞标志蛋白，成骨分化因子Runx2被抑制，与软骨形成相关的Ⅱ型胶原蛋白a1显著降低[43]。有研究发现，模拟微重力可以促进MSCs向神经元的分化。与正常重力对照组相比，在微重力条件下，由AD-MSCs分化的神经细胞表达更多微管相关蛋白-2、胶质纤维酸性蛋白和突触素蛋白，并且对细胞的生存能力未发现不利影响[44]。因此，推测用模拟微重力处理过的MSCs作为治疗神经系统疾病的材料，效果可能更佳。研究还发现，模拟微重力可通过抑制ERK/β-catenin信号通路抑制MSCs的表皮成纤维细胞分化[45]，真皮成纤维细胞可以参与受损皮肤的修复，推断微重力条件可通过干预ERK/β-catenin信号通路来促进MSCs修复皮肤损伤。因此，微重力可维持MSCs的分化潜能并调控其分化倾向。

6 结束语

干细胞移植是再生医学领域的重要研究方向，而MSCs的诸多生物学特性符合干细胞疗法和组织工程的应用要求。但是，体外培养的MSCs生物学特性的变化为其在这一领域的应用增加了不确定性，影响了其在临床应用的安全性和有效性。已有多项研究结果显示，将细胞培养物暴露于不同微重力环境中能够有效维持MSCs的生物学特性。尽管各国已开展多项模拟微重力培养MSCs的研究，但任何细微的差异都可能导致结果千差万别，因此，将来还需制定更加科学合理的培养方案、创新技术仪器和更精准的监测体内复杂微环境的方法[46]，阐明这些变化背后的机制，才能充分利用微重力培养的优势，使MSCs在临床治疗中取得更好的效果。